雷文杰/河南省平輿縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所

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禽腦脊髓炎的實(shí)驗(yàn)室診斷與預(yù)防措施

雷文杰/河南省平輿縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所

禽腦脊髓炎是由腸道病毒屬的禽腦脊髓炎病毒侵害幼齡雞的一種病毒性急性傳染病。病原為禽腦脊髓炎病毒。屬于RNA病毒科。該病一年四季均可發(fā)生，可感染任何年齡雞， 1～2周齡雛雞最易感。3周齡以上的雞對(duì)本病有抵抗力，感染時(shí)臨床癥狀不明顯。該病主要是雛雞共濟(jì)失調(diào)，兩肢輕癱，頭頸肌肉震顫，母雞產(chǎn)蛋急劇下降等為特征。由于傳播速度快，感染率高，如果診斷、治療不及時(shí)常常會(huì)給養(yǎng)殖戶帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。現(xiàn)將禽腦脊髓炎的實(shí)驗(yàn)室診斷及預(yù)防措施介紹如下。

一、實(shí)驗(yàn)室診斷

1.病毒分離。取病死雞腦組織，經(jīng)研磨后，用滅菌生理鹽水制成1∶10懸乳液，經(jīng)1 500轉(zhuǎn)/分，離心沉淀15 min，加入青霉素600～2 000 μg/ml，置4℃冰箱中過(guò)夜，取其上清液0.1毫升，接種于5～7日齡的雞胚卵黃內(nèi)。在接種后12 d如觀察到雞胚不活動(dòng)、腿肌萎縮和雞胚死亡，則可判斷病死雞腦組織中含有禽腦脊髓炎病毒。在接種后12 d后雞胚雖未病變，但在雞胚孵出后10 d的雛雞出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)，兩肢輕癱，頭頸肌肉震顫等禽腦脊髓炎病的特征性癥狀，也可證實(shí)腦脊髓炎病毒的存在。

2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。采取病死雞腦組織，加無(wú)菌生理鹽水1∶10懸液，接種于1～2月齡雛雞。每只雞腦內(nèi)注射0.1 ml，或腹腔注射0.5 ml。12～14日齡開始發(fā)病，臨床癥狀表現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)、麻痹或頭、頸震顫等特征性神經(jīng)癥狀。以致發(fā)生癱瘓或衰竭，嚴(yán)重的則俯臥不起，兩肢向一側(cè)伸直至死亡。組織學(xué)觀察，神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生軸突型變性，腺胃基層、胰臟間質(zhì)中有淋巴濾泡等特有病變。

3.中和試驗(yàn)。中和試驗(yàn)是采用適應(yīng)于雞胚內(nèi)可以生長(zhǎng)的菌株，來(lái)確定血清或血漿的中和能力。其方法如下：

將未作稀釋的被檢血清與1∶10、1∶20、1∶40稀釋的病毒液混合，用22號(hào)針頭，接種于對(duì)腦脊髓炎易感的6日齡雞胚卵黃囊內(nèi)，每個(gè)稀釋度接種5枚雞胚。于接種后10～12天檢查雞胚有無(wú)典型的腦脊髓炎病變，以確定病毒的滴定終點(diǎn)，并以中和指數(shù)表示（即ELD50病毒滴度和ELD50病毒-血清滴度之間的對(duì)數(shù)差異計(jì)算）一般中和指數(shù)為1.1或大于1.1時(shí)被認(rèn)為感染過(guò)病毒的可靠證據(jù)，新感染的雞群，其中和指數(shù)可在1.5～3.0范圍內(nèi)。

4.免疫熒光抗體檢查。

（1）試驗(yàn)準(zhǔn)備。

熒光抗體：用腦脊髓炎病毒感染雞，制備的高價(jià)血清，再用異硫氰酸熒光黃標(biāo)記而制成熒光抗體或由獸醫(yī)生物廠家生產(chǎn)。

被檢材料：采取疑為被感染雞的腦、胰腺等組織。

（2）操作方法。

制片：將腦、胰腺等組織臟器制成6～7微米的冰凍切片。

固定：將切片粘貼于載玻片上，自然干燥后，再用丙酮固定10分鐘。

染色：將固定好的載玻片，用熒光抗體（標(biāo)記熒光素的特異禽腦脊髓炎病毒血清）于室溫在濕盒染色30分鐘。再將載玻片放在PH7.4磷酸鹽緩沖液中，洗滌20分鐘，加蓋玻片并用PH7.4的磷酸鹽緩沖液-甘油等量混合液封固，在熒光顯微鏡下觀察。

（3）結(jié)果判定：在病變組織內(nèi)如見(jiàn)有亮綠色的禽腦脊髓炎病毒抗原時(shí)，判為陽(yáng)性，否則判為陰性。

5.瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。

（1）試驗(yàn)準(zhǔn)備。

抗原：將已接種經(jīng)馴化病毒的雞胚腦組織懸液，濃縮制成抗原。

被檢血清：采集被檢雞血而分離的血清。

瓊脂平板：取優(yōu)質(zhì)瓊脂粉1 g，加入含1/萬(wàn)硫柳汞的0.01M磷酸鹽緩沖液100毫升，于水浴中煮沸溶解、過(guò)濾。置120℃高壓滅菌15 min，倒入無(wú)菌平皿，待凝固后立即使用或置4℃冰箱中保持備用。

（2）操作方法。取制備好的瓊脂板，用打孔器，中央打1孔，孔徑4毫米，加抗原；周邊打6孔，孔徑6毫米，1、2、4、5孔加被檢血清；3孔加已知陰性血清，6孔加已知陽(yáng)性血清，抗原孔與血清孔之間的空間距為4毫米（如圖1）。

圖1 雞腦脊髓炎瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)示意圖

抗原與血清滴加量以加滿孔不溢出為宜。然后將瓊脂平板置于濕盒中，放37℃溫箱中24～48 h觀察結(jié)果。

（3）結(jié)果判定：抗原與被檢血清孔和已知陽(yáng)性血清孔之間，同時(shí)出現(xiàn)的沉淀線，而陽(yáng)性血清孔不出現(xiàn)沉淀線判為陽(yáng)性。否則判為陰性。

二、防治措施

1.搞好消毒措施。環(huán)境衛(wèi)生消毒是預(yù)防禽腦脊髓炎病的的有效措施之一。定搞好環(huán)境衛(wèi)生，及時(shí)清除傳染源。對(duì)禽舍內(nèi)的糞便和墊料要及時(shí)清除，定期對(duì)養(yǎng)殖用具（水槽、料槽等）進(jìn)行清洗消毒，保持舍內(nèi)地面干燥，對(duì)舍內(nèi)外環(huán)境進(jìn)行定期消毒。

2.加強(qiáng)飼養(yǎng)管理。合理安排飼養(yǎng)密度，掌控好禽舍內(nèi)的溫度和濕度，保持舍內(nèi)通風(fēng)良好，同時(shí)飼喂?fàn)I養(yǎng)均衡的全價(jià)飼料，在飲水或飼養(yǎng)中添加多種維生素、電解多維和黃芪多糖，來(lái)增強(qiáng)禽群的免疫力，增強(qiáng)抗病能力，同時(shí)也可避免應(yīng)激病的發(fā)生。

3.建立健全防疫制度。禽場(chǎng)要實(shí)行封閉式管理，激勵(lì)健全的獸醫(yī)衛(wèi)生防疫制度，減少人員流動(dòng)，降低疫病的傳播速度，防治外源性致病菌傳入。

4.做好疫苗接種。目前，接種疫苗是預(yù)防本病的最有效方法。采用弱毒疫苗對(duì)13周齡后備種禽經(jīng)飲水進(jìn)行首次免疫接種弱毒苗，15周齡時(shí)經(jīng)飲水進(jìn)行二次免疫接種弱毒苗；用弱毒苗通過(guò)飲水或噴霧等途徑免疫產(chǎn)蛋前5周的母禽，使其產(chǎn)生的母源抗體能保護(hù)2周雛禽不受在本病毒的接觸感染，而降低感染率。通過(guò)以上免疫方法，該病的免疫期可達(dá)1年以上。

5.堅(jiān)持自繁自養(yǎng)原則。堅(jiān)持自繁自養(yǎng)和全進(jìn)全出飼養(yǎng)制度，可以防止疾病的傳入或擴(kuò)散。盡量做到自繁自養(yǎng)，避免外來(lái)病帶入。如需引種，需到規(guī)?；?、正規(guī)化、規(guī)范化種禽場(chǎng)引進(jìn)，引進(jìn)前需做該病的病原檢測(cè)，確定為禽腦脊髓炎為陰性的禽群，方可引進(jìn)，引進(jìn)后也要隔離1個(gè)月，確定健康后，方可并群飼養(yǎng)。