李 鑫，王 豐，周冀衡，李 強(qiáng)，邵建平，趙 杰，王瑞寶，許 計(jì)，李亞兵，李 超

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草研究院，長(zhǎng)沙 410128；3.貴州省黔西南州煙草公司，貴州 興義 562400；4.曲靖市煙草公司羅平縣分公司，云南 羅平 655800）

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苯甲酸降解菌的分離鑒定及其對(duì)烤煙幼苗生長(zhǎng)的影響

李 鑫1，2，王 豐3，周冀衡2*，李 強(qiáng)2，邵建平4，趙 杰4，王瑞寶4，許 計(jì)4，李亞兵4，李 超4

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草研究院，長(zhǎng)沙 410128；3.貴州省黔西南州煙草公司，貴州 興義 562400；4.曲靖市煙草公司羅平縣分公司，云南 羅平 655800）

摘 要：為降低煙草連作對(duì)煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)以及煙草生長(zhǎng)發(fā)育帶來的不良影響，通過平板篩選和搖床復(fù)篩，從烤煙根系分泌物中篩選出一株能高效降解苯甲酸的菌株。結(jié)果表明，根據(jù)rDNA-ITS的擴(kuò)增及序列分析、培養(yǎng)特征及形態(tài)特征觀察初步鑒定該菌株為黃曲霉（Aspergillus flavus）；該菌株培養(yǎng)15 d內(nèi)，在0～800 μmol/L苯甲酸濃度范圍內(nèi)能夠正常生長(zhǎng)，800～1600 μmol/L苯甲酸濃度范圍內(nèi)生長(zhǎng)受到一定程度抑制；該降解菌在以苯甲酸為唯一碳源的800 μmol/L濃度LBA培養(yǎng)基中菌株干重、降解率均達(dá)到最大，菌株干重為0.765 g，降解率為19.98%；菌株在培養(yǎng)至第9天時(shí)降解速率達(dá)到最快，為8.5 mg/d；烤煙幼苗生長(zhǎng)過程中施加降解菌液能在一定程度上降低根系分泌物的抑制作用。該降解菌株在盆栽試驗(yàn)中能夠降低根系分泌物對(duì)烤煙的自毒作用，使微生物菌株降解烤煙自毒物質(zhì)來克服連作障礙成為可能。

關(guān)鍵詞：烤煙；苯甲酸降解菌；分離鑒定；連作障礙

鑒于我國農(nóng)田種植制度、土地流轉(zhuǎn)方式及經(jīng)濟(jì)效益方面的考慮，煙草連作障礙依然普遍，已成為制約我國煙草農(nóng)業(yè)發(fā)展的障礙之一［1-4］?？緹煾翟谏L(zhǎng)過程中會(huì)分泌一些有害物質(zhì)，在土壤中積累到一定程度時(shí)會(huì)抑制烤煙本身及其他作物的生長(zhǎng)，同時(shí)導(dǎo)致土壤理化性狀惡化、土傳病害日趨嚴(yán)重?？緹煾捣置谖镝尫诺臒焿A、水楊酸、苯甲酸、2-羥基丙酸等［5-6］均可降低植煙土壤利用率和煙葉品質(zhì)。有研究報(bào)道，采用作物輪作［7］、施用土壤改良劑［8-9］和微生物肥料等［10］方法，可以緩解由于營養(yǎng)元素失衡和土傳病害增多引起的連作現(xiàn)象，但關(guān)于烤煙自毒物質(zhì)的生物可降解性報(bào)道還不多見，只有毛寧等［11］、苗艷芳等［12］和周治等［13］對(duì)植物根系分泌物降解菌有少許研究。上述研究主要針對(duì)細(xì)菌和放線菌，關(guān)于真菌的研究較少，尤其真菌對(duì)苯甲酸降解效果研究未見報(bào)道。本研究針對(duì)烤煙連作自毒作用的生物降解菌進(jìn)行分離篩選，對(duì)分離的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并進(jìn)行盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證其降解效果，進(jìn)一步探討利用微生物菌株降解烤煙自毒物質(zhì)的可行性，為烤煙連作障礙修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 供試培養(yǎng)基

真菌培養(yǎng)選用馬丁氏培養(yǎng)基，活化培養(yǎng)及保存方法參照文獻(xiàn)［14］以苯甲酸為唯一碳源真菌培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀1 g，七水硫酸鎂0.5 g，1/300孟加拉紅水溶液3 mL，pH自然，定容至1 L，固體培養(yǎng)基用于降解苯甲酸真菌的篩選；液體培養(yǎng)基分裝后，加入苯甲酸，使苯甲酸的終濃度分別為400（設(shè)為T1）、800（T2）、1200（T3）、1600（T4）及2000（T5）μmol/L，用于真菌對(duì)苯甲酸降解測(cè)定。

1.2 真菌的分離與純化

真菌按照常規(guī)方法進(jìn)行分離和純化［15］：按照文獻(xiàn)［16］方法制備烤煙根系分泌物，取1 mL烤煙根系分泌物均勻涂布于馬丁氏培養(yǎng)基中，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d。在菌落形成后挑取單個(gè)菌落置于以苯甲酸為唯一碳源的固體真菌培養(yǎng)基中，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。待長(zhǎng)出單菌落后，挑取單孢純化，純化后的菌株保存于LBA培養(yǎng)基斜面上，置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 真菌鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將分離純化得到的真菌接種到LBA平板上，28 ℃黑暗培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)；7 d后從平板上挑取少量菌絲進(jìn)行鏡檢，觀察孢子形態(tài)及其產(chǎn)生方式。

1.3.2 rDNA-ITS擴(kuò)增及序列分析 將分離得到的真菌接種于LBA培養(yǎng)基中，在28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d。用滅菌牙簽挑取少量菌絲用于DNA提取。DNA提取參照Lee等［17］的方法。利用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）通用引物ITS1（5?-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3?）和 ITS4（5?-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3?）對(duì)病原菌的rDNA-ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增［18］。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最終72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov）中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

1.4 降解菌液對(duì)烤煙幼苗生長(zhǎng)的影響

幼苗生長(zhǎng)試驗(yàn)于2013年8月至2013年10月，在貴州省煙草科學(xué)研究院人工大棚中進(jìn)行，采用常規(guī)育苗盤育苗，育苗基質(zhì)由云南省丘北縣煙用物資有限責(zé)任公司提供。8月1日開始播種，育苗15 d后間苗（8月15日），間苗后每穴留有1株煙苗，后向育苗盤中每天下午澆入50 mL相應(yīng)處理液，連續(xù)灌澆45 d，含有降解菌的處理液在澆入前12 h即在常溫下混勻。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共設(shè)3個(gè)處理液處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)（即3盤幼苗），每個(gè)重復(fù)12株煙苗。3個(gè)處理中M1處理為自來水設(shè)為CK，M2處理為烤煙根系分泌物，M3處理為降解菌液和烤煙根系分泌物的混合液。M3處理的混合處理液以降解菌液5 mL，分泌物45 mL進(jìn)行分配。待幼苗生長(zhǎng)60 d（10月1日）后測(cè)量其根系結(jié)構(gòu)、葉綠素含量和光合特性等各類指標(biāo)。

1.5 測(cè)定項(xiàng)目

1.5.1 降解菌干重和苯甲酸降解速率測(cè)定 在馬丁氏培養(yǎng)基中取5 mm降解菌菌絲塊無菌操作移到T1-T5等5個(gè)以苯甲酸為唯一碳源濃度處理溶液培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，連續(xù)培養(yǎng)15 d。在降解菌培養(yǎng)至15 d時(shí)取出降解真菌，過濾、干燥（60 ℃，2 h）、稱量，同時(shí)每隔3 d測(cè)量一次不同濃度LBA培養(yǎng)基中苯甲酸含量，連續(xù)測(cè)量15 d。苯甲酸含量測(cè)定采用文獻(xiàn)［19］方法測(cè)量，并稱量。

1.5.2 烤煙幼苗生長(zhǎng)相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定 選取長(zhǎng)相一致具有代表性的煙苗根系，采用 WinRHIZO植物根系掃描分析系統(tǒng)（北京易科泰生態(tài)技術(shù)有限公司）測(cè)定幼苗根系結(jié)構(gòu)。采用Li-6400XT便攜式光合作用測(cè)定儀和6400-02B紅藍(lán)光源（美國Li-cor公司）測(cè)定幼苗光合指標(biāo)。采用丙酮提取-TU1901紫外分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）測(cè)定幼苗葉綠素各類指標(biāo)。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003軟件進(jìn)行處理，采用SPSS18.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2　結(jié)果

2.1 降解菌株鑒定

2.1.1 降解菌株的菌落形態(tài)特征觀察 降解菌在LBA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落生長(zhǎng)較快，結(jié)構(gòu)疏松，表面灰綠色，背面無色或略呈褐色（圖1-D）。菌體有許多復(fù)雜的分枝菌絲構(gòu)成（圖1-A）。營養(yǎng)菌絲具有分隔；氣生菌絲的一部分形成長(zhǎng)而粗糙的分生孢子梗，頂端產(chǎn)生燒瓶形或近球形頂囊（圖1-C），表面產(chǎn)生許多小梗，小梗上著生成串的表面粗糙的球形分生孢子（圖1-B）。具典型的黃曲霉形態(tài)特征。

2.1.2 菌株 Z5序列測(cè)定 采用真菌鑒定通用引物ITS1/ITS4對(duì)該菌株進(jìn)行rDNA-ITS的PCR擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序分析該菌株 ITS序列片段長(zhǎng) 589bp （Genbank收錄號(hào)為KT633952）。BLAST分析表明，該菌株的 rDNA-ITS序列與 GenBank中FJ878681、HQ340108、HQ340103、HQ340101等黃曲霉序列的相似性最高，達(dá)到99%。

圖1　降解菌的菌落和形態(tài)學(xué)特征Fig.1 The colony and morphological characteristics of the acid-degrading bacterium

綜合上述的形態(tài)學(xué)觀察及ITS序列數(shù)據(jù)，將該降解菌初步鑒定為黃曲霉菌（Aspergillus flavus）。

2.2 菌株對(duì)苯甲酸降解的影響

2.2.1 不同濃度苯甲酸對(duì)菌株干重的影響 圖 2可知，降解菌株在苯甲酸溶液中經(jīng)過15 d培養(yǎng)后干重隨濃度的增加呈先增大后降低的趨勢(shì)。苯甲酸干重在T2處理中達(dá)到最大，為0.765 g，與其他處理差異顯著；在T3、T4和T5處理濃度中干重顯著降低，且3個(gè)處理間無顯著性差異。

2.2.2 菌株對(duì)苯甲酸降解速率的影響 圖3可知，降解菌在T1和T2處理濃度下苯甲酸的降解速率呈先上升后降低的趨勢(shì)，在第9天時(shí)降解速率達(dá)到最大，分別為2.7和8.5 mg/d，然后逐漸降低，在第15 d時(shí)兩個(gè)濃度處理下苯甲酸的降解速率趨于相同，分別為1.31和1.2 mg/d，其他處理濃度下基本不降解。

圖2　不同濃度苯甲酸溶液對(duì)降解菌干重的影響Fig. 2 Effects of benzoic acid solution at different concentrations on dry weight of degrading bacteria

圖3　降解菌對(duì)苯甲酸溶液降解速率的影響Fig. 3 Effect of degrading bacteria on the degration rate of benzoic acid

2.3 降解菌液對(duì)烤煙幼苗根系結(jié)構(gòu)的影響

表1可知，各處理間以M1處理的烤煙幼苗根系生長(zhǎng)最好，與M2和M3處理的各類根系結(jié)構(gòu)指標(biāo)有顯著性差異；M2與M3處理除總根表面積有顯著性差異，其他指標(biāo)均無顯著性差異，但M3處理烤煙根系生長(zhǎng)優(yōu)于M2處理。說明，根系分泌物中加入降解菌后能夠在一定程度上降低根系分泌物對(duì)烤煙根系生長(zhǎng)的抑制作用。

2.4 降解菌液對(duì)烤煙幼苗葉綠素含量的影響

表2可知，灌澆不同處理液后對(duì)烤煙幼苗生長(zhǎng)過程中葉綠素含量的影響不同。其中，M1處理較M2和M3處理在葉綠素各類指標(biāo)中均為最大，且差異性顯著，M2和M3處理間雖無顯著性差異，但M3處理葉綠素含量有高于M2處理的趨勢(shì)。

2.5 降解菌液對(duì)烤煙幼苗光合特性的影響

表3可知，含有降解菌處理液的M3處理能夠減緩根系分泌物對(duì)烤煙生長(zhǎng)過程中光合特性的抑制作用。各處理間光合特性以 M1＞M2＞M3，M1處理與M2和M3處理間呈顯著性差異，M2 和 M3處理的凈光合速率呈顯著性差異，但氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率以及胞間CO2濃度無差異或差異不顯著。

表1　不同處理對(duì)烤煙幼苗根系結(jié)構(gòu)的影響Table 1 Effects of different concentrations on flue-cured tobacco roots

表2　不同處理對(duì)烤煙幼苗葉綠素含量的影響 mg/gTable 2 Effects of different concentrations on flue-cured tobacco chlorophyll content

3　討論

表3　不同處理對(duì)烤煙幼苗光合特性的影響Table 3 Effects of different concentrations on photosynthetic characteristics of flue-cured tobacco

烤煙根系分泌物造成的烤煙連作障礙是近年來我國主要植煙區(qū)遇到的常見問題，連作障礙往往會(huì)導(dǎo)致病蟲害加重、土壤次生鹽漬化及酸化、植物自毒作用和元素平衡破壞等［20］。Asao T等［21］認(rèn)為導(dǎo)致烤煙連作障礙的一個(gè)重要原因是由于本身的自毒作用，由于連年種植，導(dǎo)致烤煙根系會(huì)分泌一些自毒物質(zhì)并積累，達(dá)到一定程度會(huì)抑制烤煙生長(zhǎng)?；形镔|(zhì)可以對(duì)受體植物的細(xì)胞分裂、膜功能、光合作用和生物合成等生理生化反應(yīng)產(chǎn)生影響［22］。筆者從烤煙根系分泌物中分離出一株能夠降解苯甲酸的菌株，采用形態(tài)學(xué)觀察和rDNA-ITS的擴(kuò)增及序列分析對(duì)其進(jìn)行鑒定，初步將其鑒定為黃曲霉（aspergillus. flavus），并對(duì)其降解效果進(jìn)行了研究。研究結(jié)果對(duì)解決當(dāng)前植煙土壤連作障礙有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

關(guān)于苯甲酸降解菌的研究并不多見，方艷芬等［23］采用富集培養(yǎng)法從廢水中分離到能以苯甲酸為唯一碳源和能源的菌株LS01，在最適宜條件下，菌株的降解率能達(dá)到85%以上；蔡寶立等［24］用富集培養(yǎng)法從工業(yè)污水中分離出不動(dòng)桿菌（Acinetobacter sp.）BJ1、無色桿菌（Achromobacter sp.）BY1、假單胞菌（Paesdomonas spp.）SJ1、SY1 和SH1等5株能夠降解苯甲酸的微生物，在最適條件下BJ1菌株對(duì)苯甲酸的降解率達(dá)到98%以上。苯甲酸是多種芳香化合物生物代謝的中間產(chǎn)物，研究發(fā)現(xiàn)，好氧微生物降解苯甲酸主要通過鄰位代謝途徑、間位代謝途徑［25］以及苯甲酰輔酶A和3-羥基苯甲酰輔酶A代謝途徑［26］，分別將苯甲酸分解為生理反應(yīng)各階段中間物質(zhì)。國內(nèi)外未見黃曲霉具有這種降解特性的報(bào)道，其降解機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

黃曲霉（Aspergillus flavus）對(duì)苯甲酸的降解效果研究表明，黃曲霉在以苯甲酸為唯一碳源在800 μmol/L濃度時(shí)生長(zhǎng)條件最佳，苯甲酸降解率可達(dá)19.98%，在第9天時(shí)降解速率最快。進(jìn)一步將黃曲霉培養(yǎng)后與烤煙根系分泌物混合施加到育苗盤中進(jìn)行烤煙幼苗培養(yǎng)，能減輕根系分泌物對(duì)烤煙幼苗根系結(jié)構(gòu)、葉綠素含量以及光合特性等指標(biāo)的抑制作用，說明根系分泌物中施加降解菌液一定程度上弱化根系分泌物對(duì)烤煙幼苗的化感效應(yīng)。與本研究結(jié)果相似，胡春江等［27］研究發(fā)現(xiàn)，在土壤中施加微生物修復(fù)菌物可以有效減輕作物連作障礙。上述研究結(jié)果表明微生物降解作物自毒物質(zhì)，有助于克服連作障礙。此外，本文只研究了一種降解菌液與烤煙根系分泌物混合對(duì)烤煙幼苗生長(zhǎng)的影響，要解決大田烤煙連作障礙，還需進(jìn)一步分離鑒定更多根系分泌物降解菌株并進(jìn)行大田試驗(yàn)研究。

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Isolation and Identification of a Benzoic Acid-degrading Bacterium and Its Effect on Growth of Flue-cured Tobacco

LI Xin1，2，WANG Feng3，ZHOU Jiheng2*，LI Qiang2，SHAO Jianping4，ZHAO Jie4，WANG Ruibao4，XU Ji4，LI Yabing4，LI Chao4
（1. College of BIological Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2. College of Tobacco Research，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；3. Southwest of Guizhou Company，Xingyi，Guizhou 562400，China；4. Luoping County Branch of Qujing City，Luoping，Yunnan 655800，China）

Abstract:In order to reduce adverse effects of continuous cropping on yield and quality to some extent，as well as growth and development of flue-cured tobacco，the authors isolated a benzoic acid decompositon strain from the root exudate of tobacco by plate screening and shaker rescreening. The strain was identified as Aspergillus according to rDNA-ITS and sequence analysis，culture characteristics and morphological characteristics. The results showed that the strain could grow normally in the 0-800 μmol/L benzoic acid concentration range in 15 days. To certain extent the strain’s growth was constrained in the 800-1600 μmol/L benzoic acid concentration range. When using benzoic acid as the sole carbon source at the concentration of 800 μmol/L，dry weight and degradation rate of the strain reached the maximum on LBA medium. The dry weight of the strain was 0.765 g and the degradation rate was 19.98%. The degradation of the strain reached the highest rate which was 8.5 mg/d on the ninth day. To some extent，application of the degradation strain could reduce the the hazard of benzoic acid in root exudates of flue-cured tobacco. The degradation strain can reduce the toxic effect of root exudates in a pot experiment，it then can potentially be used to degrade the self poison substance to overcome the continuous cropping obstacle.

Keywords:flue-cured tobacco；benzoic acid-degrading bacterium；isolation and identification；continuous cropping obstacle

中圖分類號(hào)：S345.72

文章編號(hào)：1007-5119（2016）01-0072-06

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.01.013

基金項(xiàng)目：中國煙草總公司項(xiàng)目“土壤微生物生態(tài)修復(fù)關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用”（11020100219）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目“基于烤煙土壤-根系互作機(jī)制的煙葉鉀素調(diào)控技術(shù)研究”（CX2015B238）

作者簡(jiǎn)介：李 鑫（1989-），男，在讀博士，研究方向：煙草生物科學(xué)與工程技術(shù)。E-mail：s2007203272@yeah.net*通信作者，E-mail：jhzhou2005@163.com

收稿日期：2015-06-22 修回日期：2015-11-04