多棘海盤車檸檬酸脫毒工藝的優(yōu)化研究

李　莎，張國琛，張　倩，李秀辰，牟春發(fā)

（大連海洋大學(xué)遼寧省漁業(yè)裝備工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116023）

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多棘海盤車檸檬酸脫毒工藝的優(yōu)化研究

李莎，張國琛，張倩，李秀辰，牟春發(fā)

（大連海洋大學(xué)遼寧省漁業(yè)裝備工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116023）

摘要：為研究多棘海盤車Asteriasamurensis檸檬酸脫毒的最佳工藝條件，采用正交試驗(yàn)法進(jìn)行了有關(guān)試驗(yàn)研究。結(jié)果表明：單因素試驗(yàn)中，增大檸檬酸濃度、提高脫毒溫度、延長脫毒時(shí)間均可提高多棘海盤車的皂苷脫除率，但也會(huì)造成多棘海盤車蛋白質(zhì)保留率顯著降低 （P＜0.05），增大料液比會(huì)降低多棘海盤車蛋白質(zhì)保留率，當(dāng)料液比為1∶10左右時(shí)，多棘海盤車的皂苷脫除率最大；在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)法對(duì)多棘海盤車脫毒工藝進(jìn)行了優(yōu)化，多棘海盤車脫毒試驗(yàn)中4個(gè)因素對(duì)綜合評(píng)分的影響程度依次為脫毒溫度＞脫毒時(shí)間＞料液比＞檸檬酸濃度。研究表明，當(dāng)檸檬酸濃度為0.10mol/L，脫毒溫度為50℃，料液比為1∶8，脫毒時(shí)間為3 h時(shí)，多棘海盤車具有較好的脫毒效果和蛋白質(zhì)保留率，其皂苷脫除率和蛋白質(zhì)保留率分別為70.96％和91.29％，綜合評(píng)分為1.982。

關(guān)鍵詞：多棘海盤車；脫毒工藝；檸檬酸；正交試驗(yàn)；皂苷脫除率；蛋白質(zhì)保留率

多棘海盤車Asterias amurensis又名海星、星魚或海盤車，隸屬于無脊椎動(dòng)物棘皮動(dòng)物門、海星綱、鉗棘目、海盤車科，其生性兇殘，常吞食牡蠣、扇貝、鮑魚等海珍品，且在捕撈海產(chǎn)品時(shí)，常常附著在漁網(wǎng)上。據(jù)調(diào)查估計(jì)，僅大連沿海海域，多棘海盤車的年產(chǎn)量就可達(dá)5萬t，嚴(yán)重危害著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展［1］。如何有效處理多棘海盤車并實(shí)現(xiàn)其資源化利用，是中國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展面臨的重大問題。多棘海盤車不僅蛋白質(zhì)含量較高，氨基酸組成齊全，必需氨基酸間比例較為合理，接近優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)［2］，而且含有牛磺酸、鋅、甾醇、多糖等活性成分，長期攝入可促進(jìn)生長發(fā)育，起到抗癌、抗菌等作用［3-4］。因此，將多棘海盤車開發(fā)為新型蛋白質(zhì)飼料資源具有十分巨大的潛力。

中國已有將脫毒多棘海盤車作為蛋白質(zhì)飼料添加粉飼喂動(dòng)物的研究報(bào)道。徐均望等［3］研究發(fā)現(xiàn)，將脫毒后的多棘海盤車棘皮粉以30％的比例摻入冰凍小雜魚中喂養(yǎng)牙鲆，可顯著提高牙鲆的生長率、增重和成活率；以20％～30％的比例摻入國產(chǎn)鮑魚餌料中喂養(yǎng)鮑魚，平均增重及成活率均高于日本鮑魚餌料組［5］；金鼎等［1］研究發(fā)現(xiàn)，脫毒多棘海盤車粉可以作為豬飼料，并可取代部分魚粉。在多棘海盤車資源化利用為蛋白質(zhì)飼料添加劑的研究中，人們發(fā)現(xiàn)其體壁、胃、消化腺、生殖腺皆含有毒物質(zhì)——皂苷，過量攝入會(huì)造成嘔吐、頭暈、昏迷甚至?xí)劳觯?］。滕瑜等［4］研究發(fā)現(xiàn)，多棘海盤車毒性源于其中的毒性皂苷成分，證實(shí)其具有魚毒作用。因此，若將多棘海盤車作為蛋白質(zhì)飼料，脫除皂苷 （簡稱脫毒）是必要的步驟。

當(dāng)前，多棘海盤車食用和飼用研究中的脫毒方法主要是酸催化水解和堿催化水解［6-7］。張成業(yè)等［8］研究發(fā)現(xiàn)，將多棘海盤車置于熱提鍋，加稀堿液分兩次提取，每次加熱煮沸1 h以上，合并濾液，濃縮后干燥磨粉，可制成膠囊；韓福山［9］研究發(fā)現(xiàn)，將多棘海盤車先后置于稀鹽酸溶液和堿性皂化液中，烘干后可制作膠囊或飼料。這些方法雖然都能有效脫除多棘海盤車中的皂苷，但未考慮稀鹽酸、氫氧化鈉等強(qiáng)酸強(qiáng)堿會(huì)破壞多棘海盤車的營養(yǎng)成分和活性物質(zhì)，且體內(nèi)殘留的酸堿會(huì)對(duì)人體有害。近年來，用有機(jī)酸溶液來脫除多棘海盤車中皂苷的探索成為一個(gè)新的研究方向［10-11］。檸檬酸是一種酸性較弱的有機(jī)酸，研究發(fā)現(xiàn)，在生長育肥豬日糧中添加1％～2％檸檬酸，可提高其日增重，降低料肉比，提高蛋白質(zhì)消化率，降低背脂厚度，改善肉質(zhì)和胴體特性。宋志樂等［11］已將用檸檬酸溶液處理后的多棘海盤車制成口服液，但脫毒工藝還亟待優(yōu)化。本研究中，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上開展了多棘海盤車脫毒工藝研究，以期為多棘海盤車的增值和開發(fā)利用提供初步加工方法，實(shí)現(xiàn)資源的循環(huán)利用。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用多棘海盤車于2014年5月采自大連市黑石礁海域。

試驗(yàn)儀器：UV-7504單光束紫外-可見分光光度計(jì)（上海欣茂儀器有限公司）、HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）、101A-5型電熱鼓風(fēng)烘干箱（上海試驗(yàn)器械公司）、雷磁pH-2F型pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）、KQ3200E型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 將新鮮多棘海盤車洗凈，剪取大小均勻、質(zhì)量為15～20 g的多棘海盤車腕，由腕側(cè)剖開，剝除其體內(nèi)消化管、生殖腺等物質(zhì)，留棘皮洗凈，瀝水后置于冰箱 （-20℃）中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將預(yù)處理后冷凍的多棘海盤車棘皮樣品于室溫下自然緩化，然后置于一定濃度的檸檬酸溶液中，以一定的溫度、料液比、時(shí)間進(jìn)行脫毒處理試驗(yàn)。最后將脫毒后的多棘海盤車瀝干并用水洗凈、烘干，分別測(cè)定其棘皮樣品的皂苷脫除率和蛋白質(zhì)保留率，綜合評(píng)定脫毒效果。

1.2.3 參數(shù)的測(cè)定與計(jì)算

（1）皂苷脫除率。參考張立新等［12］多棘海盤車皂苷總含量測(cè)定方法，略有改動(dòng)。精確稱取樣品2.5 g，用100 mL 85％乙醇浸泡，于超聲清洗機(jī)中超聲提取1 h，抽濾后的濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，殘?jiān)屑?0 mL蒸餾水，混勻后置于分液漏斗中，用150 m L石油醚脫脂。用1 g活性炭吸附分出水層中的色素，過濾后的溶液減壓蒸干后用甲醇定容至5 mL，作為待測(cè)樣品溶液，重復(fù)測(cè)定兩次。

取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，用體積分?jǐn)?shù)為95％的乙醇溶解并定容至 50 mL，得到濃度為 400 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精確吸取該標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL，于試管中稀釋至0.5 mL，在55℃水浴中蒸干乙醇，加入0.5 mL蒸餾水，再加入26％香草醛乙醇溶液0.5 mL，于冰水浴中加入75％硫酸5 mL，搖勻，蓋好瓶塞；于55℃水浴中加熱25 min，取出搖勻，于冰水浴中冷卻10 min，室溫下放置20 min后，以試劑空白為參比，在584 nm處測(cè)定其吸光度。經(jīng)回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為 y=0.0013x+ 0.0003（R2=0.9936）。待測(cè)樣品溶液吸光度的測(cè)定方法同上，平行雙樣，重復(fù)測(cè)定兩次。計(jì)算公式為

（2）蛋白質(zhì)保留率。依據(jù)GB/T 5009.5-2003，采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，并計(jì)算蛋白質(zhì)保留率：

（3）綜合評(píng)分。綜合考慮皂苷脫除率和蛋白質(zhì)保留率對(duì)脫毒效果的影響后進(jìn)行評(píng)價(jià)。計(jì)算公式為

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和Duncan多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 多棘海盤車脫毒單因素試驗(yàn)

分別進(jìn)行檸檬酸濃度、脫毒溫度、料液比和脫毒時(shí)間影響的單因素試驗(yàn)。為保證產(chǎn)品的品質(zhì)達(dá)到食用要求并降低生產(chǎn)成本，利用檸檬酸對(duì)多棘海盤車進(jìn)行脫毒時(shí)，需要合理控制檸檬酸濃度。

2.1.1 檸檬酸濃度對(duì)皂苷脫除率及蛋白質(zhì)保留率的影響 當(dāng)脫毒溫度為50℃、料液比為1∶6、脫毒時(shí)間為2 h時(shí)，溶液中不同檸檬酸濃度 （0～0.25 mol/L）對(duì)多棘海盤車皂苷脫除率及蛋白質(zhì)保留率的影響如圖1所示。由圖1可知，皂苷脫除率隨檸檬酸濃度的增加而提高，當(dāng)檸檬酸濃度由0增至0.25 mol/L時(shí)，皂苷脫除率由39.87％提高至71.24％，這是因?yàn)檐战【哂锌s醛結(jié)構(gòu)，易被稀酸催化水解為苷元和糖，故酸性越高，皂苷的脫除率就越高，樊廷俊等［13］在用水抽提法提取多棘海盤車中的皂苷時(shí)也發(fā)現(xiàn)，皂苷在堿性條件下相對(duì)穩(wěn)定，而在酸性條件下極易水解；當(dāng)檸檬酸濃度由0升高至0.15 mol/L時(shí)，皂苷脫除率由39.87％升高至68.55％，提高比較明顯，然而繼續(xù)提高檸檬酸濃度，皂苷脫除率提高不顯著 （P＞0.05）?？梢姡瑢幟仕釢舛瓤刂圃?.15 mol/L左右時(shí)，即可保證所得產(chǎn)品良好的脫毒效果。檸檬酸濃度對(duì)多棘海盤車蛋白質(zhì)保留率亦有一定程度的影響，檸檬酸濃度愈大，蛋白質(zhì)保留率愈低。這是由于當(dāng)檸檬酸濃度由0增至0.05 mol/L時(shí)，溶液pH由8.03降低至2.30，當(dāng)濃度繼續(xù)增至0.25 mol/L時(shí)，pH值降低至1.86，而多數(shù)蛋白質(zhì)在pH為4.0～10.0時(shí)比較穩(wěn)定，超過此范圍后蛋白質(zhì)因離子基團(tuán)產(chǎn)生強(qiáng)靜電排斥作用而發(fā)生變性［14］。綜上所述，皂苷脫除率與檸檬酸濃度呈正相關(guān)，而蛋白質(zhì)保留率與檸檬酸濃度呈負(fù)相關(guān)。王長云等［7］在進(jìn)行多棘海盤車脫毒試驗(yàn)時(shí)，建議粗總皂苷含量下降60％以上時(shí)即可認(rèn)為脫毒符合使用安全要求。因此，本試驗(yàn)條件下，溶液中檸檬酸的最佳濃度范圍為0.10～0.20 mol/L。

圖1　檸檬酸濃度對(duì)多棘海盤車皂苷脫除率及蛋白質(zhì)保留率的影響Fig.1 Effects of citric acid concentration on saponin desorption rate and protein retention rate

2.1.2 溫度對(duì)皂苷脫除率及蛋白質(zhì)保留率的影響當(dāng)檸檬酸濃度為0.10 mol/L、料液比為1∶6、脫毒時(shí)間為2 h時(shí)，不同處理溫度 （30～80℃）對(duì)多棘海盤車皂苷脫除率及蛋白質(zhì)保留率的影響如圖2所示。由圖2可知：隨著溫度的升高，多棘海盤車皂苷脫除率呈遞增趨勢(shì)，當(dāng)溫度由30℃增至80℃時(shí)，皂苷脫除率由36.85％增至70.90％，即溫度愈高，脫毒效果愈好，這是因?yàn)闇囟鹊奶岣邷p小了脫除液的黏度，擴(kuò)散系數(shù)增加，從而加快了皂苷的溶解擴(kuò)散速度，并且受熱也容易造成皂苷分解［15］；當(dāng)溫度為50℃時(shí)，多棘海盤車脫毒效果較優(yōu)，皂苷脫除率為61.86％。溫度對(duì)蛋白質(zhì)保留率的影響亦比較明顯，隨著溫度的提高，蛋白質(zhì)保留率呈遞減趨勢(shì)，當(dāng)溫度由30℃增至80℃時(shí)，蛋白質(zhì)保留率由97.25％降至80.66％，這是因?yàn)楫?dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被逐漸加熱并超過臨界溫度時(shí)，蛋白質(zhì)將發(fā)生從天然狀態(tài)至變性狀態(tài)的劇烈轉(zhuǎn)變，而大多數(shù)蛋白質(zhì)在45～50℃時(shí)開始變性，并且在典型的變性范圍內(nèi)，當(dāng)溫度每提高10℃，變性反應(yīng)速度約提高600倍［14］。綜上所述，多棘海盤車皂苷脫除率與溫度呈正相關(guān)，蛋白質(zhì)保留率與溫度呈負(fù)相關(guān)。因此，本試驗(yàn)條件下，多棘海盤車脫毒的最佳處理溫度為50～70℃。

圖2　處理溫度對(duì)多棘海盤車皂苷脫除率及蛋白質(zhì)保留率的影響Fig.2 Effects of tem perature on saponin desorption rate and protein retention rate

圖3　料液比對(duì)多棘海盤車皂苷脫除率及蛋白質(zhì)保留率的影響Fig.3 Effects of ratio of material to liquid on saponin desorp tion rate and protein retention rate

2.1.3 料液比對(duì)皂苷脫除率及蛋白質(zhì)保留率的影響 當(dāng)檸檬酸濃度為0.10 mol/L、溫度為50℃、脫毒時(shí)間為2 h時(shí)，不同料液比 （1∶2～1∶18）對(duì)脫毒多棘海盤車蛋白質(zhì)保留率及皂苷脫除率的影響如圖3所示。由圖3可知，隨著料液比的增大，多棘海盤車皂苷脫除率呈先上升后下降趨勢(shì)，當(dāng)料液比由1∶2提高至1∶10時(shí)，皂苷脫除率由31.36％迅速提高至64.18％，但當(dāng)料液比繼續(xù)提高至1∶18時(shí)，皂苷脫除率降低至47.04％。這是由于當(dāng)料液比為1∶10時(shí)，皂苷擴(kuò)散推動(dòng)力較大，從而皂苷脫除率升高，這與李敏晶等［16］利用超聲波提取法對(duì)海燕總皂苷進(jìn)行提取試驗(yàn)時(shí)得出的結(jié)論一致。料液比對(duì)多棘海盤車蛋白質(zhì)保留率的影響亦比較顯著（P＜0.05）。當(dāng)料液比為1∶2時(shí)，其蛋白質(zhì)保留率最高，為96.68％，當(dāng)料液比增大至1∶18時(shí)，蛋白質(zhì)保留率降至79.52％。這是因?yàn)檩^高的液固比可降低體系的黏度，從而使蛋白質(zhì)溶解率提高［17］。綜上所述，多棘海盤車皂苷脫除率隨料液比的增大先升高而后降低，蛋白質(zhì)保留率隨料液比的增大而逐漸降低。但當(dāng)料液比過高時(shí)，多棘海盤車皂苷脫除率和蛋白質(zhì)保留率均較低，且大大增加了后處理的負(fù)擔(dān)。因此，本試驗(yàn)條件下，最佳料液比為1∶10左右。

2.1.4 脫毒時(shí)間對(duì)皂苷脫除率及蛋白質(zhì)保留率的影響 當(dāng)檸檬酸濃度為0.10 mol/L、溫度為50℃、料液比為1∶6時(shí)，不同處理時(shí)間 （1～5 h）對(duì)脫毒多棘海盤車蛋白質(zhì)保留率及皂苷脫除率的影響如圖4所示。由圖4可見，隨著脫毒時(shí)間的延長，多棘海盤車皂苷脫除率逐漸提高，蛋白質(zhì)保留率逐漸降低。當(dāng)脫毒時(shí)間由1 h延長至2 h時(shí)，多棘海盤車皂苷脫除率的變化幅度達(dá)到最大，由49.28％提高至61.94％，提高了25.68％；而當(dāng)脫毒時(shí)間延長至5 h時(shí)，與脫毒2 h比較，皂苷脫除率僅提高15.91％。這是因?yàn)樵诿摱具^程中，延長一定脫毒時(shí)間可使皂苷溶出含量隨之增加，而繼續(xù)延長時(shí)間會(huì)使細(xì)胞內(nèi)大量不溶物及較多黏液質(zhì)等混入脫毒液中，使溶液中雜質(zhì)增多，黏度增大，從而增大了傳質(zhì)阻力，影響了皂苷的繼續(xù)溶出［15］。隨著脫毒時(shí)間的延長，多棘海盤車蛋白質(zhì)保留率也隨之降低。當(dāng)脫毒時(shí)間由1 h延長至5 h時(shí)，蛋白質(zhì)保留率由96.97％降低至72.08％；隨著脫毒時(shí)間的繼續(xù)延長，蛋白質(zhì)保留率的降低幅度不斷增大，當(dāng)脫毒時(shí)間由3 h延長至4 h時(shí)，蛋白質(zhì)保留率降低了9.23％；當(dāng)脫毒時(shí)間由4 h延長至5 h時(shí)，蛋白質(zhì)保留率降低了14.58％。綜上所述，多棘海盤車皂苷脫除率隨脫毒時(shí)間的延長而提高，蛋白質(zhì)保留率隨脫毒時(shí)間的延長而降低。因此，本試驗(yàn)條件下，最佳脫毒時(shí)間為2～4 h。

圖4　脫毒時(shí)間對(duì)多棘海盤車皂苷脫除率及蛋白質(zhì)保留率的影響Fig.4 Effects of detoxification period on saponin desorption rate and protein retention rate

2.2 多棘海盤車脫毒工藝的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別選取檸檬酸濃度、脫毒溫度、料液比和脫毒時(shí)間4個(gè)因素，取值范圍分別為0.10～0.20 mol/L、50～70℃、1∶8～1∶12 和2～4 h，以綜合評(píng)分為目標(biāo)值進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素及水平如表1所示。試驗(yàn)結(jié)果和極差分析結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1　試驗(yàn)因素及水平Tab.1 Factors and levels in the experiment

各個(gè)因素對(duì)綜合評(píng)分的影響均極顯著 （P＜0.01）（表3）。極差分析結(jié)果表明，4個(gè)因素中脫毒溫度 （B）對(duì)綜合評(píng)分的影響最大，脫毒時(shí)間（D）對(duì)綜合評(píng)分的影響也較大，料液比 （C）和檸檬酸濃度 （A）對(duì)綜合評(píng)分的影響次之 （表2），影響綜合評(píng)分的因素依次為B＞D＞C＞A，得到最佳脫毒工藝條件組合為A1B1C1D2，即檸檬酸濃度為0.10 mol/L，脫毒溫度為50℃，料液比為1∶8，脫毒時(shí)間為3 h。

表2　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Design and results of the orthogonal test

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按優(yōu)選的多棘海盤車脫毒工藝條件組合A1B1C1D2（檸檬酸濃度為0.10 mol/L，脫毒溫度為50℃，料液比為1∶8，脫毒時(shí)間為3 h）進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果測(cè)得皂苷脫除率為70.96％ （脫毒前皂苷含量為 0.068 7％，脫毒后皂苷含量為0.019 9％），蛋白質(zhì)保留率為91.29％ （脫毒前蛋白質(zhì)含量為 30.35％，脫毒后蛋白質(zhì)含量為27.71％），綜合評(píng)分為1.982，高于表2中每一項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果，故A1B1C1D2為本試驗(yàn)條件下的最佳脫毒工藝條件組合。

表3　綜合評(píng)分方差分析Tab.3 Variance analysis of com prehensive score

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Optim ization of detoxification techniques of starfish Asterias amurensis by an orthogonal test

LISha，ZHANG Guo-chen，ZHANG Qian，LIXiu-chen，MU Chun-fa
（Research and Development Center of Fisheries Equipment and Engineering of Liaoning Province，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

Abstract：The optimum conditions of detoxification technology were investigated carried out in starfish Asterias amurensis by an orthogonal test.Single factor tests showed that saponin desorption rateswere improved and protein retention rateswere decreased under high citric acid concentration，high temperature and long detoxification period. Protein retention rates was reduced by increasing ratio ofmaterial to liquid，with the maximal saponin desorption rate at ratio ofmaterial to liquid ratio=1∶10.The detoxification conditions of starfish were optimized through the orthogonal testbased on single factor tests，and the significance order of the factors affecting the detoxification was expressed as detoxification period＞temperature＞ratio ofmaterial to liquid＞citric acid concentration.The better detoxification wasobserved under conditions of citric acid concentration of 0.10 mol/L，temperature of 50℃，ratio ofmaterial to liquid=1∶8，and 3 h detoxification period，with saponin desorption rate of 70.96％，protein retention rate of91.29％and comprehensive score of1.982.

Key words：Asteriasamurensis；detoxification technique；citric acid；orthogonal test；saponin desorption rate；protein retention rate

中圖分類號(hào)：TS254.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.02.014

文章編號(hào)：2095-1388（2016）02-0194-05

收稿日期：2015-06-26

基金項(xiàng)目：遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目 （2015103021）；遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目 （042214106）

作者簡介：李莎 （1991—），女，碩士研究生。E-mail：634894053@qq.com

通信作者：張國琛 （1965—），男，博士，教授。E-mail：zhangguochen@dlou.edu.cn