李　勝,梅同華

(1.重慶市沙坪壩區(qū)人民醫(yī)院內科　400030；2.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院呼吸危重病科　400016)

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Skp2基因沉默對SPC-A-1肺癌細胞增殖和凋亡的影響

李勝1,梅同華2△

(1.重慶市沙坪壩區(qū)人民醫(yī)院內科400030；2.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院呼吸危重病科400016)

[摘要]目的探討S期激酶相關蛋白2(Skp2)基因沉默對肺癌細胞增殖和凋亡的影響。方法將Skp2 RNA干擾表達載體轉染至SPC-A-1肺癌細胞中，G418篩選獲得陽性克隆細胞。通過實時熒光定量(RT-PCR)、蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測肺癌細胞中Skp2的表達。采用流式細胞術、四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測各組肺癌細胞生長、凋亡情況。結果轉染Skp2 shRNA表達載體的肺癌細胞中Skp2蛋白表達量明顯減少,抑制效率分別可達75.3±5.1，70.4±3.2；轉染Skp2 shRNA表達載體的肺癌細胞生長減慢，阻滯于G1期的增多，S期細胞減少。Skp2 shRNA轉染質粒組凋亡率較陰性對照組明顯增加，細胞凋亡率分別為(17.5±2.8)%、(15.6±3.1)%。結論通過特異性沉默Skp2基因的表達，可有效降低肺癌細胞中Skp2蛋白表達水平,抑制肺癌細胞生長及增加細胞凋亡。

[關鍵詞]肺腫瘤；凋亡；RNA干擾；S期激酶相關蛋白

S期激酶相關蛋白2(S phase kinase associated protein 2,Skp2)是泛素蛋白酶降解過程中一種重要蛋白組成部分，參與周期蛋白的泛素化降解，與細胞周期調節(jié)障礙密切相關的可疑癌蛋白，在細胞增殖生長中發(fā)揮重要作用[1]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)Skp2具有癌基因的潛能，其表達水平及活性與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及生物學性狀有關[2-4]。為了研究Skp2在肺癌生長、增殖中的作用，本實驗通過構建Skp2 shRNA表達質粒，抑制Skp2基因表達，觀察其對人肺癌細胞生物學活性的影響，為肺癌治療找到新的分子靶點。

1材料與方法

1.1材料Skp2 RNA干擾重組質粒表達載體購于武漢晶賽生物技術公司； SPC-A-1肺癌細胞由上海細胞庫提供；兔抗人Skp2抗體、鼠抗人P27抗體購于Santa Cruz公司，羊抗兔抗體、羊抗鼠抗體購于北京中山公司；Annexin V-FITC試劑盒購于晶美生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)、轉染、細胞篩選SPC-A-1肺癌細胞培養(yǎng)于RPMI培養(yǎng)基。轉染前1 d，接種于24孔培養(yǎng)板，用無血清、無抗生素培養(yǎng)基稀釋Skp2 RNA干擾表達載體質粒及脂質體。將3種重組質粒Skp2 shRNA-1、Skp2 shRNA-2、Skp2 shRNA-HK(空質粒對照)分別轉染至肺癌細胞內，每周換液2次，取陽性克隆肺癌細胞進行擴增培養(yǎng)。

1.2.2實驗分組將4組肺癌細胞分為轉染質粒組Skp2 shRNA-1組，Skp2 shRNA-2組，Skp2 shRNA-HK組及無質粒的陰性對照組進行研究。

1.2.3肺癌細胞生長曲線檢測將4組實驗組細胞分別接種于96孔培養(yǎng)板中，移至細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按四甲基偶氮唑鹽(MTT)法加入噻唑藍溶液后繼續(xù)孵育4 h后，再加入二甲基亞砜，酶聯(lián)免疫檢測儀讀取各孔光吸收數(shù)值。分別繪制各組細胞生長曲線。每組實驗重復3次。每日取1塊板檢測，連續(xù)檢測7 d。繪制各組細胞生長曲線。實驗重復3次。

1.2.4實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測4組肺癌細胞內Skp2 mRNA水平分別收集4組(5×106個/組)肺癌細胞，按照RT-PCR試劑盒說明書操作，檢測各組Skp2 mRNA水平。細胞內Skp2 mRNA的相對表達水平以Skp2與β-actin條帶灰度值的比值計算。各組實驗重復3次。

1.2.5蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測各組肺癌細胞Skp2、P27蛋白表達提取4組肺癌細胞總蛋白，經(jīng)凝膠電泳、轉膜、封閉，分別加入特異性針對Skp2、P27、β-actin的一抗抗體，再加入稀釋后的二抗，最后通過化學發(fā)光底物顯色。對顯色結果進行圖像分析，Skp2、P27蛋白的相對表達水平以Skp2、P27與β-actin灰度值的比值表示。實驗重復3次。

1.2.6流式細胞術檢測細胞周期分別收集4組細胞，每組細胞數(shù)為1×107個，用70%乙醇固定24 h，加入RNA酶，37 ℃反應1 h。加入碘化丙啶溶液染色30 min后，在流式細胞儀上進行檢測。實驗重復3次。

1.2.7流式細胞術檢測細胞凋亡情況分別收集實驗4組細胞，每組設6孔，收集轉染24 h后的細胞，按照凋亡試劑盒說明進行操作。流式細胞術檢測記錄各組凋亡比例，實驗重復3次。

2結果

2.1肺癌細胞生長曲線MTT法結果顯示，Skp2 shRNA-1組、Skp2 shRNA-2組細胞生長、增殖速度慢于Skp2 shRNA-HK組及陰性對照組，細胞生長曲線見圖1。

圖1　4組肺癌細胞的生長曲線

2.2肺癌細胞內Skp2、P27 mRNA表達情況RT-PCR檢測4組肺癌細胞轉染前后Skp2、P27 mRNA的表達：Skp2 shRNA-1組、Skp2 shRNA-2組的Skp2 mRNA的表達產(chǎn)物明顯弱于Skp2 shRNA-HK組、陰性對照組。Skp2 shRNA-1組、Skp2 shRNA-2組肺癌細胞mRNA與陰性對照組比較，抑制率分別達到(74.2±5.3)%、(61.5±3.4)%，見圖2。

M:標準參考物；1:陰性對照組；2:Skp2 shRNA-HK組；3:Skp2 shRNA-1組;4:Skp2 shRNA-2組。

圖2Skp2 shRNA對肺癌細胞內Skp2 mRNA

表達水平的影響

2.3各組肺癌細胞內Skp2、P27蛋白表達情況與陰性對照組比較，Skp2 shRNA-1組、Skp2 shRNA-2組細胞內Skp2蛋白表達明顯受到抑制，其抑制率分別達到75.3±5.1、70.4±3.2,而轉染重組質粒組shRNA-1、shRNA-2 細胞內P27蛋白表達水平明顯增加，上升幅度為73.6±4.6、67.2±2.6，而各組間的β-actin表達無明顯差異，見圖3。

A:Skp2蛋白表達;B:P27蛋白表達;C:內參蛋白表達;1:陰性對照組;2:Skp2 shRNA-HK組;3:Skp2 shRNA-1組;4:Skp2 shRNA-2組。

圖3shRNA對肺癌細胞內Skp2、P27蛋白

表達水平的影響

A：Skp2 shRNA-1組；B：Skp2 shRNA-2組；C：Skp2 shRNA-HK組；D：陰性對照組。

圖4Annexin V-FITC法對各組細胞凋亡率檢測

2.4各組細胞周期的檢測流式細胞術檢測結果表明，Skp2 shRNA-1組、Skp2 shRNA-2組進入S期細胞比例平均為(22.42±1.52)%、(20.34±1.87)%，低于陰性對照組和Skp2 shRNA-HK組進入S期的細胞比例(30.53%±2.31)%，(29.43±2.24)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而Skp2 shRNA-1組、Skp2 shRNA-2組停滯于G0/G1期細胞百分數(shù)分別為(67.35±2.55)%、(69.43±2.23)%，較陰性對照組及Skp2 shRNA-HK組(56.52±2.33)%、(55.34±2.16)%明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而陰性對照組和Skp2 shRNA-HK組進入S期的細胞比例無明顯差別(P>0.05)，見表1。

2.5各組細胞凋亡率檢測Annexin V-FITC法檢測結果表明，Skp2 shRNA-1組、Skp2 shRNA-2組細胞凋亡率與陰性對照組及Skp2 shRNA-HK組相比，兩組細胞的凋亡指數(shù)出現(xiàn)不同程度的增加，細胞凋亡率分別高達(17.5±2.8)%、(15.6±3.1)%，而陰性對照組的細胞凋亡率為(2.1±0.4)%，Skp2 shRNA-HK組僅為(2.3±0.3)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

表1　流式細胞技術檢測各組細胞周期改變±s，%)

a:P>0.05，與陰性對照組比較;b:P<0.05，與對照組相比;c:P<0.05，與Skp2-shRNA-HK組比較。

3討論

細胞周期障礙在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用日益受到重視，而泛素蛋白酶體系統(tǒng)功能的異常將導致細胞周期發(fā)生障礙，與腫瘤的發(fā)生密切相關[5]。Skp2是細胞周期的關鍵調節(jié)因子，屬于泛素蛋白連接酶F-box底物識別亞基，能夠特異性地識別各種磷酸化蛋白底物，并介導其泛素化降解[6]。Skp2在細胞周期進程、細胞增殖調控方面發(fā)揮重要作用，是細胞進入S期所必需因子，Skp2在S期時水平較高，對細胞周期的轉換發(fā)揮重要作用[7]。在細胞周期蛋白的泛素蛋白降解過程中，Skp2主要通過特異性識別底物，促進底物蛋白泛素化降解而發(fā)揮作用。目前發(fā)現(xiàn)，E2F、myc、cyclinE、cyclinA、CDC25B，以及細胞周期負性調控因子P27、P21及P57等都是通過Skp2參與的的途徑進行降解。Skp2通過調節(jié)細胞周期蛋白因子的泛素化降解，促進細胞周期發(fā)生轉換，從而參與細胞增殖與凋亡的調控，在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，正常細胞中Skp2是低水平表達的，而在絕大多數(shù)惡性腫瘤如乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、肺癌、胃癌，以及淋巴瘤等腫瘤中均發(fā)現(xiàn)有異常高的表達，與腫瘤的惡性程度、侵襲性、轉移、預后密切相關，具有癌基因的特性。研究表明Skp2促癌機制與其誘導細胞增殖、抑制凋亡、增強腫瘤的侵襲性及轉移活性等多方面的特性有關[2-4]。由于Skp2基因在腫瘤細胞中的特異性表達，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移密切相關，因此可能成為腫瘤基因治療新的靶點。

本實驗通過Skp2 shRNA質粒轉染肺癌細胞，研究Skp2在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，檢測各組肺癌細胞周期的變化，觀察其對細胞增殖、凋亡的影響。實驗結果表明，轉染Skp2 shRNA重組質粒的細胞組與對照組比較，進入S期的細胞比例減少，而停滯在G0/G1期細胞比例增加，沉默Skp2表達阻滯了細胞生長、增殖。本實驗觀察到轉染Skp2 shRNA重組質粒肺癌細胞內Skp2蛋白表達下調同時，P27蛋白表達水平反而上升，也間接證實Skp2可能通過下調P27蛋白表達而在促進細胞增殖中發(fā)揮重要作用。關于Skp2對細胞周期影響的具體機制仍不清楚，可能通過抑制Skp2表達，Skp2對負性周期調控因子P27、P21、P57泛素化蛋白降解作用減弱，使上述周期調控因子在細胞內水平的增加，從而抑制了細胞增殖[8-9]。

許多資料表明，腫瘤細胞之所以能在機體內迅速增殖與細胞凋亡機制受到了抑制有關。為進一步探討Skp2在腫瘤細胞中的抗凋亡作用，筆者檢測了轉染重組質粒肺癌細胞的凋亡情況。Annexin V-FITC檢測結果表明轉染質粒組的凋亡指數(shù)出現(xiàn)不同程度的增加。結果表明抑制Skp2蛋白的表達能促進SPC-A-1肺癌細胞的凋亡的發(fā)生，提示Skp2在腫瘤細胞抗凋亡方面發(fā)揮作用。目前Skp2對抗凋亡方面的作用機制，有學者也進行了相關研究和探討[10-13]。抑制癌細胞Skp2表達后，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞凋亡增加，細胞碎片增多，認為細胞凋亡增加與下調Skp2表達后，從而減少了對P27、P53、P21等細胞周期調節(jié)蛋白泛素化蛋白降解，上調了上述周期調節(jié)蛋白表達水平，激活了細胞內凋亡途徑中的重要的凋亡因子caspase-3、 caspase-8、caspase-9活性及增加其水平有關。

本實驗通過采用RNAi技術沉默肺癌細胞內Skp2基因表達，進而下調Skp2蛋白表達，增加細胞內周期蛋白P27水平，抑制肺癌細胞的生長，增加了細胞凋亡發(fā)生。以Skp2基因為靶點的基因治療有望在不久的將來應用于腫瘤的治療，為肺癌的治療提供新的切入點。

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The effect of Skp2 gene silencing on the proliferation and apoptosis of SPC-A-1 lung cancer cells

Li Sheng1,Mei Tonghua2△

(1.DepartmentofInternalMedicine,thePeople′sHospitalofShapingbaDistrict,Chongqing400030,China;2.DepartmentofRespiratoryDiseases,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of Skp2 gene silencing on the proliferation and apoptosis of SPC-A-1 lung cancer cells.MethodsSpecific small hairpin RNA (shRNA) targeting Skp2 gene was introduced into lung cancer cells by Lipofectamine 2000 and the positive clones were screened by G418.The Skp2 mRNA and protein expression level of lung cancer cells were detected by RT-PCR and Western blot．MTT method and flow cytometry (FCM) analysis were used to observe the effect of RNAi on proliferation of lung cancer cells.Cell apoptosis was analyzed by FCM.ResultsTransfected with Skp2 shRNA expression vector significantly reduced the expression of Skp2 protein in lung cancer cells.Inhibition efficiency was respectively (75.3±5.1),(70.4±3.2).P27 protein expression was increased significantly in lung cancer cells.The growth of lung cancer cells transfected with Skp2 shRNA was blocked,with Glphase cells increased and S phase cells decreased.The apoptosis rate of cancer cells was higher in Skp2 shRNA groups than in control groups.Apoptosis rates were (17.5±2.8)%,(15.6±3.1)% in Skp2 shRNA groups.ConclusionSpecific inhibition of the expression of Skp2 can slow down the growth of lung cancer cells,increase cell apoptosis.

[Key words]lung neoplasms;apoptosis;RNA interference;S-phase kinase associated protein

作者簡介：李勝(1971-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事腫瘤生物學研究?！魍ㄓ嵶髡?，Tel:(023)89012016;E-mail:mtonghua@163.com。

doi:論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.009

[中圖分類號]R734.2

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)17-2334-03

(收稿日期：2015-12-18修回日期：2016-03-02)