內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法在測定己酸菌發(fā)酵液己酸含量中的應(yīng)用

楊牢記，賓艷南，徐敏銳，陳興杰，謝國排，張寶年，程　偉，黃訓(xùn)端，張部昌（安徽大學(xué)金種子酒業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，安徽合肥230601）

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內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法在測定己酸菌發(fā)酵液己酸含量中的應(yīng)用

楊牢記，賓艷南，徐敏銳，陳興杰，謝國排，張寶年，程偉，黃訓(xùn)端，張部昌
（安徽大學(xué)金種子酒業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，安徽合肥230601）

摘要：采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法測定己酸菌發(fā)酵液的己酸含量，并進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，內(nèi)、外標(biāo)法的定量方法在線性范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，可決系數(shù)R2＞0.99，且具有良好的精密度和穩(wěn)定性，RSD＜5%。兩種方法均滿足己酸發(fā)酵液中己酸檢測的要求，但內(nèi)標(biāo)法的R2、精密度和穩(wěn)定性方面均優(yōu)于外標(biāo)法，外標(biāo)法在樣品處理和進(jìn)樣中操作要求更高。將內(nèi)、外標(biāo)法應(yīng)用于己酸菌發(fā)酵液中己酸含量的檢測，經(jīng)F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，兩種方法測得結(jié)果并無顯著性差異。

關(guān)鍵詞：己酸菌；己酸；內(nèi)標(biāo)法；外標(biāo)法；白酒

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-03-24；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160324.1211.005.html。

己酸菌是重要的窖泥產(chǎn)酸功能菌，其代謝產(chǎn)生的己酸與大曲發(fā)酵產(chǎn)生的酒精生成己酸乙酯，是濃香型白酒的特征風(fēng)味物質(zhì)，決定著白酒的質(zhì)量及風(fēng)格［1］。采用儀器分析己酸含量是人們認(rèn)識己酸菌產(chǎn)酸能力的重要手段。由于己酸菌發(fā)酵液的含水量高和高鹽特性使其樣品不能直接進(jìn)行氣相色譜檢測，在樣品處理上，除采用頂空法采集［2-5］，還可以考慮將發(fā)酵液除水和除鹽后再進(jìn)行氣相色譜檢測。在萃取劑中，乙醚具有較高的己酸萃取能力，采用乙醚萃取法可將不溶于有機(jī)物的鹽類物質(zhì)和水去除［6-7］。

內(nèi)標(biāo)法是通過內(nèi)標(biāo)物與待測組分的峰面積比值進(jìn)行計(jì)算，可消除進(jìn)樣量的變化、色譜條件的微小變化等引起的誤差，內(nèi)標(biāo)法可進(jìn)行多點(diǎn)校正也可進(jìn)行單點(diǎn)校正，既適用于大量樣品也適用于少量樣品的測定。但是內(nèi)標(biāo)法需加入準(zhǔn)確量的內(nèi)標(biāo)物，操作程序較麻煩。外標(biāo)法相對于內(nèi)標(biāo)法操作簡便，不需加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，只需繪制好標(biāo)準(zhǔn)工作曲線后進(jìn)行測定，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作線可直接讀出己酸含量，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線在檢測一段時(shí)間后可通過單點(diǎn)校正。由于每次樣品分析的色譜條件（檢測器的響應(yīng)性能、柱溫度、進(jìn)樣量、柱效等）很難完全一致，外標(biāo)法檢測的準(zhǔn)確性不及內(nèi)標(biāo)法。

本研究以己酸為研究對象，同時(shí)采用內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法測定己酸菌發(fā)酵液中的己酸含量，通過己酸測定結(jié)果的比較與分析，為己酸菌產(chǎn)酸性能檢測提供支持。

1材料與方法

1.1材料

己酸菌JKY8-E40-1（1#）、JKY8-E40-2（2#）、JKY12-E37-1（3#）、JKY12-E37-2（4#）、JKY1-E208（5#）、JKY1-E215（6#）由課組從某酒廠窖泥中分離獲得。待測己酸菌發(fā)酵液由以上菌株在37℃下厭氧發(fā)酵7d獲得。

1.2儀器與試劑

2010型氣相色譜儀（日本島津公司）；氫火焰離子化檢測器（FID）；全自動進(jìn)樣器；10μL自動進(jìn)樣針（日本島津公司）；色譜柱：DB-FFAP色譜柱（30m×0.25 mm× 0.25μm，美國安捷倫公司）；超純水儀（美國Thermo Fisher公司）；各種規(guī)格移液槍（美國Rainin公司）；各種規(guī)格容量瓶。

己酸和內(nèi)標(biāo)物2-乙基丁酸為色譜純（西亞試劑公司）；乙醇和乙醚為分析純（國藥集團(tuán)）。實(shí)驗(yàn)過程中用水均為超純水。

1.3溶液的配制方法

1.3.1內(nèi)標(biāo)液的配制方法

準(zhǔn)確稱取內(nèi)標(biāo)物2-乙基丁酸原液0.185 g于100mL容量瓶中，用60%vol乙醇水溶液定容至100mL，配制成1.85 mg/mL 2-乙基丁酸內(nèi)標(biāo)液待用。

1.3.2己酸標(biāo)準(zhǔn)液待測樣品的制備

準(zhǔn)確稱取己酸原液0.930 g于100mL容量瓶中，用60%vol乙醇水溶液定容至100mL，配制成9.30 mg/mL己酸標(biāo)準(zhǔn)液待用。

分別取9.30 mg/mL己酸標(biāo)準(zhǔn)液3mL、2mL、1mL、0.5mL、0.2mL、0.1mL于5mL容量瓶中，用60%vol乙醇水溶液定容至5mL，配制成5.58 mg/mL、3.72 mg/mL、1.86 mg/mL、0.93 mg/mL、0.37 mg/mL、0.19 mg/mL己酸標(biāo)準(zhǔn)液。

采用乙醚萃取法對己酸標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行處理。內(nèi)標(biāo)法己酸標(biāo)準(zhǔn)液：分別取不同濃度己酸標(biāo)準(zhǔn)液和1.85 mg/mL 2-乙基丁酸內(nèi)標(biāo)液500μL于5mL容量瓶中，加乙醚定容至5mL，充分振蕩2min，以便待測物高效率進(jìn)入乙醚相，靜置1min，吸取1.5mL上層乙醚溶液置于2mL樣品瓶中，由于乙醚的沸點(diǎn)較低易揮發(fā)，需使用完好無損的樣品小瓶蓋蓋緊，防止乙醚揮發(fā)。外標(biāo)法己酸標(biāo)準(zhǔn)液：分別取不同濃度己酸標(biāo)準(zhǔn)液500μL于5mL容量瓶內(nèi)，之后處理方法與內(nèi)標(biāo)法己酸標(biāo)準(zhǔn)液相同。

1.3.3己酸菌發(fā)酵液待測樣品的制備

內(nèi)標(biāo)法待測樣品的制備（乙醚萃取法）：取己酸菌發(fā)酵液（需經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾）和1.85 mg/mL 2-乙基丁酸內(nèi)標(biāo)液500μL于5mL容量瓶中，萃取方法與1.3.2部分相同；外標(biāo)法待測樣品制備不需加入內(nèi)標(biāo)物，其他與內(nèi)標(biāo)法待測樣品制備方法相同。

1.4色譜條件

進(jìn)樣口溫度240℃；柱箱起始溫度：100℃（1min）；升溫速率：10℃/min；柱溫終溫度：220℃（2min）；檢測器溫度250℃；氣體流量：氫氣40mL/min，空氣400mL/min，尾吹氣30mL/min；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比20∶1；進(jìn)樣體積：1μL。

1.5工作曲線的繪制

內(nèi)標(biāo)法工作曲線：以己酸與2-乙基丁酸內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比為縱坐標(biāo)（A/Ai），己酸與2-乙基丁酸的含量之比為橫坐標(biāo)作圖（C/Ci），得到內(nèi)標(biāo)工作曲線。根據(jù)己酸菌發(fā)酵液中己酸與2-乙基丁酸的峰面積之比，即可利用內(nèi)標(biāo)工作曲線算出發(fā)酵液中己酸的濃度。

外標(biāo)法工作曲線：以己酸的峰面積為縱坐標(biāo)（A），己酸濃度為橫坐標(biāo)（C），得外標(biāo)工作曲線。根據(jù)發(fā)酵液中己酸的峰面積，即可利用外標(biāo)工作曲線算出己酸的濃度。

2結(jié)果與分析

2.1專屬性試驗(yàn)

按照1.3.3中方法制備待測樣品，然后將待測樣品以1.4色譜條件進(jìn)行氣相色譜檢測。圖1中線1、2、3、4分別為2-乙基丁酸待測樣品、己酸待測樣品、己酸與2-乙基丁酸混合待測樣品和己酸菌發(fā)酵液與2-乙基丁酸混合待測樣品的氣相色譜圖。由圖1可知，內(nèi)標(biāo)物2-乙基丁酸出峰較己酸快，且無論是在己酸標(biāo)準(zhǔn)液待測樣品中還是己酸菌發(fā)酵液待測樣品中都可與己酸完全分離。

圖1專屬性分離氣相色譜圖

2.2內(nèi)標(biāo)法測定己酸方法的建立

2.2.1工作曲線

分別將5.58 mg/mL、3.72 mg/mL、1.86 mg/mL、0.93 mg/mL、0.37 mg/mL、0.19 mg/mL的己酸標(biāo)準(zhǔn)液按照內(nèi)標(biāo)法待測品制備方法進(jìn)行處理，取以上6個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)液待測品在1.4中的色譜條件下進(jìn)行氣相色譜進(jìn)樣，每個(gè)濃度做2個(gè)平行樣品，且每個(gè)待測樣品各平行進(jìn)樣2次，分別取己酸和2-乙基丁酸4次峰面積的平均值。以己酸與2-乙基丁酸內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比（A/Ai）為縱坐標(biāo)，己酸與2-乙基丁酸的含量之比（C/Ci）為橫坐標(biāo)作圖，見圖2，得到內(nèi)標(biāo)法工作曲線的回歸方程為y=0.5557x-0.005121 （R2=0.9993，n=6），線性范圍為0.19～5.58 mg/mL，線性良好。

圖2己酸濃度測定的內(nèi)標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.2.2精密度

在2mL小瓶中加入1.5mL的1.86 mg/mL己酸標(biāo)準(zhǔn)液待測品，用新的樣品小瓶蓋蓋緊，按1.4色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣結(jié)束后都換上新瓶蓋，用己酸與2-乙基丁酸的峰面積比計(jì)算精密度，6次測定的結(jié)果RSD為1.30%（見表1），表明該方法精密度良好。

表1 1.86 mg/mL己酸標(biāo)準(zhǔn)液6次檢測中己酸與2-乙基丁酸的峰面積之比

2.2.3穩(wěn)定性

在0、3h、6h、9h、12h分別對3.72 mg/mL己酸標(biāo)準(zhǔn)液待測品按1.4色譜條件進(jìn)行氣相色譜檢測，以己酸與2-乙基丁酸的峰面積比為依據(jù)，考察待測品的穩(wěn)定性，計(jì)算出RSD為2.18%（見表2），結(jié)果表明，己酸待測品在12h內(nèi)穩(wěn)定。

表2 3.72 mg/mL己酸標(biāo)準(zhǔn)液不同時(shí)間檢測己酸與2-乙基丁酸的峰面積之比

2.3外標(biāo)法測定己酸方法的建立

2.3.1工作曲線

將6個(gè)不同濃度的己酸標(biāo)準(zhǔn)液按照外標(biāo)法待測品制備方法進(jìn)行處理，然后取以上6個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)液待測品在1.4中的色譜條件下進(jìn)行氣相色譜進(jìn)樣，每個(gè)濃度做2個(gè)平行樣品，且每個(gè)待測樣品各平行進(jìn)樣2次，分別取己酸4次峰面積的平均值為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)，見圖3，得到外標(biāo)法工作曲線的回歸方程y=5.4147x+0.3666（R2= 0.9976，n=6），線性范圍為0.19～5.58 mg/mL，線性良好。

圖3己酸濃度測定的外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.3.2精密度

在2mL小瓶中加入1.5mL的1.86 mg/mL己酸標(biāo)準(zhǔn)液待測品，用新的樣品小瓶蓋蓋緊，按1.4色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣結(jié)束后都換上新瓶蓋，用己酸的峰面積計(jì)算精密度，6次測定的結(jié)果RSD為4.47%（見表3），表明該方法精密度良好。

表3 1.86 mg/mL己酸標(biāo)準(zhǔn)液6次檢測中己酸峰的面積

2.3.3穩(wěn)定性

在0、3h、6h、9h、12h分別對3.72 mg/mL己酸標(biāo)準(zhǔn)液待測品按1.4色譜條件進(jìn)行氣相色譜檢測，以己酸的峰面積為依據(jù)考察待測品的穩(wěn)定性，計(jì)算出RSD為4.19%（見表4），結(jié)果表明，己酸待測品在12h內(nèi)穩(wěn)定。

表4 3.72 mg/mL己酸標(biāo)準(zhǔn)液不同時(shí)間檢測己酸與2-乙基丁酸的峰面積之比

對內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合決定系數(shù)、工作曲線斜率、精密度和穩(wěn)定性進(jìn)行比較［9］，內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法測得的精密度與穩(wěn)定性的RSD均小于5%，滿足檢測的需要。通過比較發(fā)現(xiàn)，在可決系數(shù)R2、精密度和穩(wěn)定性方面，內(nèi)標(biāo)法的RSD明顯小于外標(biāo)法。

2.4己酸菌發(fā)酵液中己酸含量測定

2.4.1內(nèi)標(biāo)法測定結(jié)果

選取不同的己酸菌發(fā)酵液，按照1.3.3己酸菌發(fā)酵液待測樣品制備中內(nèi)標(biāo)法的要求進(jìn)行處理，每個(gè)己酸菌發(fā)酵液做6個(gè)平行待測樣品進(jìn)行氣相色譜檢測，每個(gè)進(jìn)樣2次，取平均值，結(jié)果見表5。

表5發(fā)酵液中己酸含量內(nèi)標(biāo)法測定結(jié)果

2.4.2外標(biāo)法測定結(jié)果

選取不同的己酸菌發(fā)酵液，按照1.3.3己酸菌發(fā)酵液待測樣品制備中外標(biāo)法的要求進(jìn)行處理，每個(gè)己酸菌發(fā)酵液做6個(gè)平行待測樣品進(jìn)行氣相色譜檢測，每個(gè)進(jìn)樣2次，取平均值，結(jié)果見表6。

表6發(fā)酵液中己酸含量外標(biāo)法測定結(jié)果

2.4.3內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法實(shí)測結(jié)果比較與分析

己酸菌發(fā)酵液中己酸測定的內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法測定結(jié)果對比見表7。將同一樣品的內(nèi)、外標(biāo)法測得數(shù)據(jù)進(jìn)行F檢驗(yàn)及t檢驗(yàn)，比較兩種方法檢測數(shù)據(jù)是否存在顯著性差異。首先進(jìn)行F檢驗(yàn)，F(xiàn)=Sd大2/Sd小2，查F檢驗(yàn)臨界表，當(dāng)自由度n=5，置信度為95%時(shí)，F(xiàn)（5，5）=5.05，實(shí)際F值均小于F（5，5），說明兩種方法測得數(shù)據(jù)的Sd差異不顯著，進(jìn)而用t檢驗(yàn)平均值間有無顯著性差異。t檢驗(yàn)，查t檢驗(yàn)臨界表，當(dāng)自由度f=10，置信度為95%時(shí)，t（10，0.95）=2.228，實(shí)際t值均小于t（10，0.95），故內(nèi)、外標(biāo)法在檢測己酸含量方面無顯著性差異。

表7己酸菌發(fā)酵液中己酸內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法對比結(jié)果

3　結(jié)論

采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法對己酸菌發(fā)酵液中的己酸含量進(jìn)行測定。首先建立內(nèi)、外標(biāo)法工作曲線，2種方法在線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，R2＞0.99。通過連續(xù)進(jìn)樣和不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣，檢測2種方法的精密度和穩(wěn)定性良好，RSD＜5%。內(nèi)、外標(biāo)法的定量方法均滿

足己酸含量的檢測要求，但內(nèi)標(biāo)法的可決系數(shù)R2、精密度和穩(wěn)定性方面均優(yōu)于外標(biāo)法。采用F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)對內(nèi)、外標(biāo)法所測得己酸菌發(fā)酵液中己酸含量的結(jié)果進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)中的F值和t值均小于臨界值，2種方法所得己酸菌發(fā)酵液中己酸含量的結(jié)果無顯著性差異，內(nèi)、外標(biāo)法都可用于己酸菌發(fā)酵液中己酸含量的檢測。但對內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法測定結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)相同樣品時(shí)，外標(biāo)法所得含量普遍比內(nèi)標(biāo)法高?？赡艿脑蚴怯米鬏腿∫旱囊颐岩讱饣笠绯鰳悠菲浚瓜嗤w積內(nèi)的己酸量上升，所以在實(shí)驗(yàn)過程中需使用完好無損的樣品小瓶蓋蓋緊，防止乙醚揮發(fā)；氣相色譜是通過進(jìn)樣針自動進(jìn)樣，但是進(jìn)樣針的氣密性決定了進(jìn)樣體積的精確度，易產(chǎn)生誤差。上述原因，致使外標(biāo)法在可決系數(shù)R2、精密度和穩(wěn)定性方面不及內(nèi)標(biāo)法［10-11］。因此，在實(shí)踐中采用外標(biāo)法需要做到精確、規(guī)范化操作，這樣才能使檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

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Application of ISTD and ESTD in the Determination of Caproic Acid Content in Caproic Acid Bacteria Fermenting Liquid

YANG Laoji，BIN Yannan，XU Minrui，CHEN Xingjie，XIE Guopai，ZHANG Baonian，CHENG Wei，HUANG Xunduan and ZHANG Buchang
（Jinzhongzi Industrial Technology Research Institute，Anhui University，Hefei，Anhui 230601，China）

Abstract:In this study，gas phase chromatography internal standard method（ISTD）and external standard method（ESTD）were used respectively for the determination of caproic acid content in caproic acid bacteria fermenting liquid.The results showed that both methods displayed good linearity（R2〉0.99）within the concentration range，and good precision and stability（RSD〈5%）.However，R2，the precision and the stability of ISTD were better than that of ESTD，and ESTD had higher requirements in sample treatment and sampling operation.The results of ISTD and ESTD were examined via F-test and t-test，and there was no significant difference between ISTD and ESTD.

Key words:caproic acid bacteria；caproic acid；internal standard method；external standard method；Baijiu

中圖分類號：TS262.3；TS261.1；TS261.7

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）06-0078-04

DOI：10.13746/j.njkj.2016039

基金項(xiàng)目：金種子人工窖泥快速培養(yǎng)技術(shù)研究（Y06099204）；安徽大學(xué)2015年百門精品素質(zhì)課程“食品安全”建設(shè)項(xiàng)目（ZLTS2015233）。

收稿日期：2016-02-02

作者簡介：楊牢記，安徽亳州人，研究生，高級工程師，從事釀造技術(shù)項(xiàng)目管理與研究。

通訊作者：張部昌，男，安徽五河人，博士，教授，從事生物工程研究。