陳 琳, 張 曦, 蘇映軍, 余 州, 雷 蕾, 郭樹忠, 馬顯杰

?

實驗研究

雷帕霉素誘導成纖維細胞自噬在瘢痕疙瘩中的作用

陳 琳, 張 曦, 蘇映軍, 余 州, 雷 蕾, 郭樹忠, 馬顯杰

目的 探討瘢痕疙瘩與正常皮膚中，真皮成纖維細胞層自噬水平的差異，并研究自噬誘導劑雷帕霉素對瘢痕疙瘩成纖維細胞Collagen Ⅰ及α-SMA表達的影響。方法 收集瘢痕疙瘩和正常皮膚臨床標本，免疫組化和WB檢測自噬標志物LC3的表達；雷帕霉素處理成纖維細胞，檢測細胞Collagen Ⅰ及α-SMA表達。結果 瘢痕疙瘩中，LC3表達高于正常皮膚；雷帕霉素可誘導成纖維細胞自噬，并降低細胞Collagen Ⅰ及α-SMA的表達。結論 自噬與瘢痕疙瘩發(fā)病相關，雷帕霉素誘導自噬可以顯著影響成纖維細胞合成膠原及向肌成纖維細胞分化的特性，干預細胞自噬可能是一種有效的治療瘢痕的途徑。

瘢痕疙瘩； 自噬； 雷帕霉素； 成纖維細胞; Collagen Ⅰ; α-SMA

筆者擬研究瘢痕疙瘩與正常皮膚中，自噬水平的差異，并探討自噬誘導劑雷帕霉素對成纖維細胞的作用，以期為闡明自噬在瘢痕疙瘩中的作用提供理論依據(jù)，從而為尋求防治瘢痕疙瘩的方法提供新思路。

1 對象與方法

1.1 臨床標本采集及處理 收集自2015年1月至2015年11月，來第四軍醫(yī)大學附屬西京醫(yī)院整形外科就診的門診和住院患者共計20例組織標本。瘢痕疙瘩13例，男性2例，女性11例，年齡9～43歲；正常皮膚7例，男性4例，女性3例，年齡3～40歲。標本采集前均征得患者知情同意，并簽署同意書。瘢痕疙瘩組取材部位為上臂、足背、耳郭、腰背部；正常皮膚組為手指、腹部和腰背部(來我院行腹部整形、多指畸形及植皮術的患者)。標本取材后分為2部分，一部分行甲醛固定、石蠟包埋和免疫組化染色；另一部分保存于液氮中行組織研磨、蛋白裂解和Western blot檢測。

1.2 主要試劑 雷帕霉素購自美國LC LABORATORIES公司；LC3α/β(ab58610)、Collagen Ⅰ(ab138492)、α-SMA(ab7817)購自美國ABCAM公司;β-actin抗體購自杭州華安生物公司;用于免疫組化的辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase, HRP)標記的羊抗兔二抗和DAB顯色試劑盒購自福州邁新公司;用于WB檢測的HRP標記的抗兔二抗和抗鼠二抗購自美國CELL SIGNALING TECHNOLOGY公司。

1.3 成纖維細胞分離培養(yǎng) 成纖維細胞分離培養(yǎng)采用組織塊貼壁法，取無菌采集的人瘢痕疙瘩及正常皮膚組織，PBS洗滌去除血漬，剪除皮下脂肪組織，切成大小約1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，接種于培養(yǎng)瓶中，待組織黏附牢固后，加入含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2、3 d后，去除漂浮組織，加入新鮮培養(yǎng)基。3～5 d后換液。待貼壁的成纖維細胞匯集率達到95%以上時，采用0.25%胰酶消化，傳代。取第4～8代細胞用于后續(xù)的實驗。1.4 雷帕霉素處理成纖維細胞 取培養(yǎng)至第4～8代的成纖維細胞按3×105個/孔的密度接種至6孔板，細胞匯合至85%時加入雷帕霉素溶液(DMSO溶解)，依據(jù)雷帕霉素的處理濃度實驗分為5組：對照組、2.5 μm組、5.0 μm組、7.5 μm組和10.0 μm組。

1.5 免疫組化 常規(guī)石蠟切片后，脫蠟至水。加入3%H2O2浸泡10 min，從而除去內源性的過氧化氫酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗2次，用檸檬酸鈉抗原修復液微波抗原修復20 min。5%BSA(PBS 稀釋)封閉，室溫孵育60 min。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗，4 ℃過夜。PBS 沖洗3次，5 min/次。滴加適當比例稀釋的HRP標記二抗(1%BSA-PBS 稀釋)，37 ℃孵育2 h。PBS 沖洗，5 min/次，沖洗3次。加入DAB顯色液，鏡下觀察著色后自來水終止反應；蘇木精染核，封片。

1.6 Western blot檢測 組織研磨后，RIPA強裂解液裂解提取蛋白，BCA定量，標本沸水浴5 min行蛋白變性，放在含10%～12%分離膠的SDS-PAGE凝膠中電泳；轉膜采用100 V恒壓濕轉法(PVDF膜)，脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入適當比例稀釋的一抗，4 ℃過夜，TBST洗滌4次，5 min/次，加入適當比例稀釋的二抗，37 ℃孵育1 h，ECL發(fā)光，UVP化學發(fā)光儀(美國UVP公司)成像拍照。

2 結果

2.1 免疫組化和WB檢測瘢痕疙瘩與正常皮膚組織中LC3的表達 免疫組化結果如圖1a所示，微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein1 light chain3， LC3)陽性細胞呈棕黃色，LC3廣泛分布在瘢痕疙瘩組織的真皮成纖維細胞層，而在正常皮膚組織，只在血管等管腔結構周圍高表達。WB結果(圖1b)與免疫組化結果一致，瘢痕疙瘩組織高表達LC3，正常皮膚組織低表達或不表達LC3。2.2 雷帕霉素增強成纖維細胞自噬 雷帕霉素處理瘢痕疙瘩成纖維細胞(keloid fibroblasts， KFB)和正常皮膚成纖維細胞(normal fibroblasts， NFB)，NFB在無藥物刺激下LC3表達較低，不同濃度雷帕霉素處理NFB細胞48 h后，LC3Ⅱ表達顯著升高，與未處理細胞相比，至少能提高4倍的表達量。相同濃度雷帕霉素處理KFB，LC3Ⅱ表達量最高只能提高約0.5倍(圖2)。2.3 雷帕霉素降低成纖維細胞Collagen Ⅰ表達 NFB 自身Collagen Ⅰ表達量較低，低濃度雷帕霉素(2.5 μm)可增加Collagen Ⅰ表達，而高濃度雷帕霉素(10.0 μm)可降低Collagen Ⅰ表達；KFB 由于自身Collagen Ⅰ表達量較高，低濃度雷帕霉素對其不起作用，只有高濃度雷帕霉素(10.0 μm)可以降低KFB中 Collagen Ⅰ的表達水平(圖3)。2.4 雷帕霉素降低成纖維細胞α-SMA表達 NFB基本不表達α-SMA；KFB自身高表達α-SMA，雷帕霉素處理KFB 48 h，雷帕霉素濃度越高，α-SMA表達越低(圖4)。

3 討論

瘢痕疙瘩是整形外科的常見病、多發(fā)病，不僅影響患者的外觀，還可能導致受累部位發(fā)生功能障礙，嚴重影響患者的生活質量。由于瘢痕疙瘩具有發(fā)病機理不清、手術切除復發(fā)率極高、藥物治療不敏感等特點。因而，深入研究瘢痕疙瘩的發(fā)病機制，探尋安全、可行、有效的瘢痕疙瘩防治方法有著重要意義。

自噬是一種細胞自我降解的過程，目的是清除受損或多余的蛋白質和細胞器。在饑餓、能量缺乏、炎癥、缺氧等應激狀態(tài)下，自噬作為一種存活機制對于維持細胞穩(wěn)態(tài)非常重要，然而，過度自噬則會導致細胞死亡，因此，自噬具有正反兩方面作用[1]。本研究分析的指標中，LC3是監(jiān)測自噬水平的特異性標志物。當自噬體形成時，胞漿型LC3(即LC3-Ⅰ)在自噬相關基因(autophagy associated gene，ATG)7和ATG12-ATG5-ATG16L的作用下，與磷脂酰乙醇胺共價結合形成膜型LC3(即LC3-Ⅱ)，結合在自噬體膜上[2]；α-SMA是肌成纖維細胞的標志，肌成纖維細胞已經(jīng)被證實在肉芽組織收縮和瘢痕攣縮過程中起重要作用[3]。

圖1 瘢痕疙瘩和正常皮膚組織中LC3的表達(N為正常皮膚，K為瘢痕疙瘩) a.免疫組化結果(兩步法，×100) b.WB檢測 圖2 雷帕霉素處理NFB和KFB 48 h后LC3表達的檢測結果 a,b.Western blot檢測結果 c,d.Western blot條帶灰度值半定量分析 圖3 雷帕霉素處理NFB和KFB 48 h后Collagen Ⅰ的表達 圖4 雷帕霉素處理NFB和KFB 48 h后α-SMA的表達
Fig 1 Expression of LC3 in keloid and normal skin tissue(N: normal skin, K: keloid). a. Immunohistochemical analysis(Two-step method，×100). b. Western blot. Fig 2 Expression level of LC3 in NFB and KFB after Rapamycin treatment for 48 hours. a,b. Western blot. c,d. Semi-quantitative analysis of LC3 Ⅱ protein expression. Fig 3 Expression level of Collagen Ⅰ in NFB and KFB after Rapamycin treatment for 48 hours. Fig 4 Expression level of α-SMA in NFB and KFB after Rapamycin treatment for 48 hours.

同時，自噬在很多纖維化疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。在Mao等[4]采用CCl4和膽汁管結扎誘導的肝纖維化模型中，自噬水平明顯高于正常水平，這一結果與本文的研究結果類似；而在Gui等[5]采用博來霉素誘導的肺纖維化模型中，自噬水平低表達；另外，毛一雷等[6]的研究結果也表明，自噬現(xiàn)象在肝纖維化過程中減弱。蔣麗麗[7]通過研究發(fā)現(xiàn)，腎臟纖維化早期自噬水平顯著增加，晚期顯著減少，提示早期腎小管細胞受到輕度損傷時，增強自噬活性對抗損傷，形成自我保護機制，而晚期，腎小管細胞損傷過于嚴重失代償，自噬活性減弱，自我保護作用失代償；Shi等[8]檢測了增生性瘢痕標本的自噬水平，較正常組織相比，增生性瘢痕自噬水平較低，這與本研究結果不一致。分析其原因：⑴其研究的側重點是檢測自噬在表皮層的表達情況，而本實驗研究主要關注自噬在真皮層的表達情況；⑵增生性瘢痕和瘢痕疙瘩在臨床表現(xiàn)、組織病理學特點及轉歸等方面均存在差異；⑶增生性瘢痕在不同階段組織病理學特點不盡相同，其結果可能會受此影響?？傊?，Shi等研究與本研究均觀察到病理性瘢痕標本與正常皮膚標本自噬活性存在差異，提示自噬與病理性瘢痕的發(fā)生相關。

雷帕霉素是自噬的傳統(tǒng)誘導劑，其通過抑制mTOR發(fā)揮作用。Wong等[9]采用雷帕霉素處理瘢痕疙瘩成纖維細胞和正常皮膚成纖維細胞后，進行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)膠原合成基因PLOD、PCOLCE和P4HA降低，然而，其作用機制未做進一步研究，雷帕霉素作為一種高效的自噬誘導劑，是否通過自噬途徑影響膠原合成基因的表達，需做進一步研究證實。本研究結果表明，雷帕霉素能夠誘導NFB自噬，KFB自噬水平也有所提高，并進一步研究了雷帕霉素處理后成纖維細胞Ⅰ型膠原和α-SMA的表達。結果表明，雷帕霉素能夠顯著降低Ⅰ型膠原和α-SMA的表達，這與Ong等[10]的研究結果一致,但其作用的信號通路及作用機制還需進一步研究。

細胞外基質，尤其是Ⅰ、Ⅲ型膠原合成與沉積過度、降解不足是導致瘢痕疙瘩形成的重要原因。Kim 等[11]研究表明，自噬相關蛋白Beclin1 基因缺陷小鼠體內膠原沉積增加，降低了小鼠原代腎小球系膜細胞自噬相關蛋白Beclin1 的表達，從而導致Ⅰ型膠原蛋白水平增加; Ishida 等[12]的研究發(fā)現(xiàn),雷帕霉素通過抑制mTOR 誘導自噬，可以消除聚集的前膠原；腎上腺素受體β2 活化的心臟成纖維細胞Ⅰ型膠原降解的增加與自噬水平的增加相關[13];在膠原基質應激下,特發(fā)性肺纖維化的成纖維細胞自噬活性低，抑制自噬促進細胞外基質產(chǎn)生[14]。綜上所述，自噬在Ⅰ型膠原的產(chǎn)生與降解中起重要作用，誘導自噬可以促進膠原的降解。筆者采用雷帕霉素誘導自噬，結果顯示Ⅰ型膠原表達量降低，也進一步印證了上述觀點。

在正常情況下，肌成纖維細胞加速組織重塑和創(chuàng)面愈合。在纖維化疾病中，持續(xù)存在的肌成纖維細胞加速細胞外基質沉積，造成組織攣縮、變形、失去功能[3]。雷帕霉素的靶點mTOR與其他幾種蛋白形成兩種復合物mTORC1和mTORC2。有研究表明,采用無血清培養(yǎng)基饑餓人胚胎肺成纖維細胞(WI-38)達4 d時，MTORC1活性下降，自噬水平升高，MTORC2活性升高，進一步通過下游的CTGF加速成纖維細胞向肌成纖維細胞分化，而加入雷帕霉素后抑制了MTORC2的活化，阻止了成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化[15]。本研究結果表明，只加入雷帕霉素處理的情況下，雷帕霉素誘導自噬α-SMA表達下降，也阻止了成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化，然而，其確切的作用還需根據(jù)細胞所處的狀況而定。本研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素誘導KFB和NFB自噬的效果有較大差異，分析其原因可能與兩種細胞內部雷帕霉素作用靶點mTOR的表達量不同有關。已有研究表明，KFB和NFB的mTOR活性不同，KFB的總mTOR和磷酸化mTOR均顯著高于NFB[16]，因此，在一定濃度下，雷帕霉素對于KFB的作用相對較弱，誘導自噬的水平也相對較低。

總之，筆者經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩標本自噬水平高于正常皮膚，提示自噬與瘢痕疙瘩的發(fā)生相關；雷帕霉素誘導自噬可以顯著降低成纖維細胞Ⅰ型膠原和α-SMA表達，從而影響成纖維細胞纖維發(fā)生特性。因此，自噬與瘢痕疙瘩的形成具有緊密的相關性，雷帕霉素等自噬干預劑有可能成為瘢痕疙瘩治療的新手段，為瘢痕疙瘩乃至病理性瘢痕的治療提供了新的治療方向和策略。

[1] Shintani T, Klionsky DJ. Autophagy in health and disease: a double-edged sword[J]. Science, 2004,306(5698):990-995.

[2] Kabeya Y, Mizushima N, Ueno T, et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing[J]. EMBO J, 2000,19(21):5720-5728.

[3] Tomasek JJ, Gabbiani G, Hinz B, et al. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2002,3(5):349-363.

[4] Mao Y, Zhang S, Yu F, et al. Ghrelin attenuates liver fibrosis through regulation of TGF-β1 expression and autophagy[J]. Int J Mol Sci, 2015,16(9):21911-21930.

[5] Gui YS, Wang L, Tian X, et al. mTOR overactivation and compromised autophagy in the pathogenesis of pulmonary fibrosis[J]. PloS One, 2015,10(9):e0138625.

[6] 毛一雷, 陳蓉蓉, 楊華瑜, 等. 自噬現(xiàn)象在肝纖維化和肝切除時的表現(xiàn)形式[J]. 中國醫(yī)學科學院學報, 2008,30(4):421-425.

[7] 蔣麗麗. 雷帕霉素對 UUO 大鼠腎臟細胞自噬及腎小管間質纖維化的影響[D]. 石家莊:河北醫(yī)科大學, 2014.

[8] Shi JH, Hu DH, Zhang ZF, et al. Reduced expression of microtubule-associated protein 1 light chain 3 in hypertrophic scars[J]. Arch Dermatol Res, 2012,304(3):209-215.

[9] Wong VW, You F, Januszyk M, et al. Transcriptional profiling of rapamycin-treated fibroblasts from hypertrophic and keloid scars[J]. Ann Plast Surg, 2014,72(6):711-719.

[10] Ong CT, Khoo YT, Mukhopadhyay A, et al. mTOR as a potential therapeutic target for treatment of keloids and excessive scars[J]. Exp Dermatol, 2007,16(5):394-404.

[11] Kim SI, Na HJ, Ding Y, et al. Autophagy promotes intracellular degradation of type I collagen induced by transforming growth factor (TGF)-β1[J]. J Biol Chem, 2012,287(15):11677-11688.

[12] Ishida Y, Yamamoto A, Kitamura A, et al. Autophagic elimination of misfolded procollagen aggregates in the endoplasmic reticulum as a means of cell protection[J]. Mol Biol Cell, 2009,20(11):2744-2754.

[13] Aranguiz-Urroz P, Canales J, Copaja M, et al. Beta(2)-adrenergic receptor regulates cardiac fibroblast autophagy and collagen degradation[J]. Biochim Biophys Acta, 2011,1812(1):23-31.

[14] Nho RS, Hergert P. IPF fibroblasts are desensitized to type I collagen matrix-induced cell death by suppressing low autophagy via aberrant Akt/mTOR kinases[J]. PloS One, 2014,9(4):e94616.

[15] Bernard M, Dieude M, Yang B, et al. Autophagy fosters myofibroblast differentiation through MTORC2 activation and downstream upregulation of CTGF[J]. Autophagy, 2014,10(12):2193-2207.

[16] Syed F, Sherris D, Paus R, et al. Keloid disease can be inhibited by antagonizing excessive mTOR signaling with a novel dual TORC1/2 inhibitor[J]. Am JPathol, 2012,181(5):1642-1658.

Effects of Rapamycin induced fibroblasts autophagy in keloid

CHENLin,ZHANGXi,SUYing-jun,YUZhou,LEILei,GUOShu-zhong,MAXian-jie.

(DepartmentofPlasticSurgery,XijingHospitaloftheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China)

ZHANGXi,Email:xizhang@fmmu.edu.cn

Objective To survey the differences of autophagy between keloid and normal skin (NS), and to study the effects of autophagy inducer Rapamycin on the expression of Collagen Ⅰ and α-SMA in keloid fibroblasts. Methods The clinical specimens of keloid and NS were collected, the immunohistochemistry and Western blot were used to detect the expression of LC3 (the microtubule-associated protein 1 light chain 3 proteins), an autophagy marker; the expression of Collagen Ⅰ and α-SMA in the fibroblasts treated by Rapamycin were detected. Results The expression of LC3 in keloid was higher than that in NS. Rapamycin can induce fibroblast autophagy, furthermore decreases the expression of Collagen Ⅰ and α-SMA. Conclusion Autophagy may associate with the pathogenesis of keloids. Rapamycin inhibits collagen Ⅰ production and myofibroblasts differentiation from fibroblasts through the autophagy pathway, which suggests that autophagy may be a promising target for keloid therapy.

Keloid; Autophagy; Rapamycin; Fibroblasts; Collagen Ⅰ; α-SMA

國家自然科學基金(81000840)

710032 陜西 西安，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院 整形外科

陳 琳(1985-)，河北清河人，研究實習員.

張 曦，710032，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院 整形外科，電子信箱：xizhang@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.02.016

R619.6

A

1673-7040(2016)02-0114-04

2015-12-28)