HPLC法測定大鼠血漿和腦組織中的?？颂婺釢舛?/h1>
2016-07-18 11:23:04楊梅
中國生化藥物雜志 2016年3期
楊梅
(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院 藥劑科，北京 100021)
HPLC法測定大鼠血漿和腦組織中的埃克替尼濃度
楊梅Δ
(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院 藥劑科，北京 100021)
目的 建立大鼠血漿和腦組織中?？颂婺釢舛鹊腍PLC測定方法。方法 將55只大鼠隨機(jī)分為11組，每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)物數(shù)為5。給藥前12 h禁食，口服灌胃給予?？颂婺?0 mg/kg。于給藥前和給藥后0.5、1、2、3、4、6、8、12、24和48 h，分別采集大鼠靜脈血及腦組織，樣品經(jīng)蛋白沉淀法處理后，采用Waters XTerra RP C18(2.1 mm×150 mm，5 μm)色譜柱；在流動(dòng)相為水-乙腈(25:75)，流速為0.12 mL/min，334 nm波長處，保持柱溫25 ℃的條件下進(jìn)樣20 μL檢測。結(jié)果 內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾測定，埃克替尼在0.05～25 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系Y=0.793X+0.101，r=0.9986(血漿)和Y=0.84X+0.0818，r=0.9965(組織)，最低檢測限為0.05 μg/mL。低、中、高3個(gè)濃度的方法回收率和提取回收率分別為98.1%、102.1%、101.5%和64.3%、69.5%、75.8%，RSD%(n=5)分別為7.3、9.2、6.6和3.5、2.3、2.1。日內(nèi)、日間精密度(RSD%，n=5)分別為7.14、5.82、3.79和8.08、6.24、4.43，均小于10%。給藥前和給藥后0.5、1、2、3、4、6、8、12和24 h、48 h大鼠血漿和腦組織中?？颂婺釢舛确謩e為0、(0.25±0.04)、(2.77±0.23)、(2.54±0.61)、(2.89±0.72)、(3.94±0.77)、(6.45±1.60)、(0.33±0.09)、(0.56±0.11)、(0.45±0.03)、(0.43±0.03)μg/mL和0、(0.20±0.07)、(0.14±0.06)、(0.11±0.01)、(0.15±0.08)、(0.11±0.03)、(0.13±0.04)、(0.07±0.01)、(0.08±0.02)、(0.06±0.02)、(0.05±0.01)μg/mL。結(jié)論 本方法簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好。
?？颂婺?；HPLC；血漿；腦組織
埃克替尼是我國自主研制成功，第一個(gè)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑，于2011年6月經(jīng)SFDA批準(zhǔn)上市，用于晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的治療[1-2]。對該藥物的研究也正隨著其廣泛應(yīng)用而不斷深入[3-6]。研究藥物在體內(nèi)的代謝情況，可以更好的為臨床用藥服務(wù)。目前對于埃克替尼能否透過血腦屏障進(jìn)入腦組織的研究較少，本研究旨在建立一種簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好的HPLC方法，可用于大鼠體內(nèi)?？颂婺岬乃巹?dòng)學(xué)分析，并為臨床研究奠定基礎(chǔ)。
圖1 ?？颂婺峤Y(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of icotinib
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： 55只SD大鼠，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量(200±20)g；北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。
1.1.2 藥品與試劑：鹽酸?？颂婺釋φ掌?純度98%，浙江貝達(dá)藥業(yè)有限公司，批號(hào)20130902)；內(nèi)標(biāo)舒尼替尼(純度>99%，輝瑞制藥有限公司，批號(hào)U684A)。乙腈、甲醇為Fisher公司產(chǎn)品(色譜級(jí))；Millipore去離子水；其余試劑均為分析純。
1.1.3 儀器：Waters高效液相色譜系統(tǒng)，包括：515泵，717自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，溫度控制器，2487紫外檢測器，Epower色譜工作站；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；Allegra 21R低溫離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司)。
1.2 方法
1.2.1 色譜條件：色譜柱：Waters XTerra RP C18(2.1 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：水：乙腈(25:75)；流速：0.12 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測波長：334 nm；柱溫：25 ℃。在上述色譜條件下，進(jìn)樣埃克替尼及內(nèi)標(biāo)。
1.2.2 埃克替尼與內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液的配制：精密稱取?？颂婺釋φ掌?0.0 mg于50 mL量瓶中，用去離子水(pH6.8)溶解并稀釋至刻度，得濃度為600.0 μg/mL?？颂婺醿?chǔ)備液，于冰箱4 ℃保存；精密稱取舒尼替尼12.5 mg于50 mL量瓶中，用去離子水(pH6.8)溶解并稀釋至刻度，得濃度為250.0 μg/mL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，于冰箱4 ℃保存。臨用時(shí)稀釋成25 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。
1.2.3 血漿樣品和組織：取血漿樣品或勻漿后的組織樣品100 μL，加25 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液150 μL，混勻，加甲醇-乙腈(1:9)3mL，渦旋1 min后放置5 min，于3500 r/min離心10 min，取上清液于60 ℃水浴放置，氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?.5 mL流動(dòng)相溶解，離心(r=10cm，15000 rpm，10 min)，取上清液，進(jìn)樣20 μL。
1.2.4 線性關(guān)系：分別配制0.05、0.1、0.5、2.5、5、10、25 μg/mL的埃克替尼對照品血漿或組織樣品，進(jìn)樣20 μL檢測，以?？颂婺岷蛢?nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，埃克替尼的濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。
1.2.5 回收率、準(zhǔn)確度和精密度的考察：分別配制?？颂婺釢舛葹榈?、中、高(0.5、5、25 μg/mL)的樣品各5份，按樣品處理方法操作后測定，計(jì)算方法回收率。另用流動(dòng)相配制相應(yīng)系列的?？颂婺崛芤海唤?jīng)提取直接測定，以此為標(biāo)準(zhǔn)，將2組峰面積相比，計(jì)算埃克替尼的提取回收率。同法配制?？颂婺釢舛葹榈?、中、高(0.5、5、25 μg/mL)的樣品各5份，同日處理進(jìn)行測定，計(jì)算日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)差。以后取低、中、高(0.5、5、25 μg/mL)的樣品各1份，連續(xù)測定5d。
作為戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)，傳統(tǒng)商貿(mào)企業(yè)應(yīng)用電子商務(wù)對區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展至關(guān)重要。近年來，全市雖然安排了一定的財(cái)政資金用于扶持電子商務(wù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展，但與杭州、深圳等發(fā)達(dá)地區(qū)設(shè)立專項(xiàng)資金支持傳統(tǒng)商貿(mào)企業(yè)應(yīng)用電子商務(wù)相比，全市對電商的扶持力度還不夠大，政府對傳統(tǒng)商貿(mào)企業(yè)線上線下發(fā)展的引導(dǎo)作用沒有充分發(fā)揮。
1.2.6 穩(wěn)定性考察
① 儲(chǔ)備液的穩(wěn)定性考察 取?？颂婺岷蛢?nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，分別在1、10、25、45、60 d用流動(dòng)相配制成60和25 μg/mL的溶液直接進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積。
② ?？颂婺峒觾?nèi)標(biāo)血漿的穩(wěn)定性考察 按“1.2.3”項(xiàng)下方法分別配制低、中、高3種濃度(0.5、5、25 μg/mL)的血漿樣品各5份，分別在短期(0、6、12、18、24 h)，長期(-20 ℃凍存1、5、10、20、30d)和凍融(1、2、3、4、5次)條件下進(jìn)行色譜測定，記錄?？颂婺岷蛢?nèi)標(biāo)的峰面積。
1.3 大鼠體內(nèi)藥物濃度測定
1.3.1 分組及給藥方法：分組：按照采樣時(shí)間點(diǎn)即給藥前和給藥后0.5、1、2、3、4、8、12、24和48 h，將55只大鼠隨機(jī)分為11組，每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)物數(shù)為5。
給藥方法：精密稱取?？颂婺釋φ掌?00.0 mg于100 mL量瓶中，用去離子水(pH6.8)溶解并稀釋至刻度，得濃度為2 mg/mL?？颂婺崛芤骸４笫笤诮o藥前12 h禁食，按照70 mg/kg的劑量口服灌胃給予埃克替尼。
1.3.2 標(biāo)本提取及處理：標(biāo)本提?。河诮o藥前和給藥后0.5、1、2、3、4、8、12、24和48 h，將大鼠抓取固定后，使其頸部充分暴露，剪開頸部皮膚、肌肉，充分暴露血管，自頸靜脈取血5 mL；然后將大鼠斷頭，剪開顱骨，取腦組織1 g，標(biāo)本放置于-20 ℃冰箱凍存待測。
標(biāo)本處理：血液于3000 rpm/min離心10 min后取血漿。每份組織標(biāo)本加入乙酸銨緩沖液2 mL，使用研缽充分研磨后，3000 r/min離心10 min后提取上清液，-20 ℃冰箱凍存。
2 結(jié)果
圖2 空白樣本、血漿和腦組織樣本及內(nèi)標(biāo)的HPLC圖譜1：?？颂婺?；2：舒尼替尼Fig.2 HPLC chromatogram of negative samples, plasma and brain tissue samples, sunitinib1：icotinib; 2：sunitinib
2.2 線性關(guān)系 埃克替尼血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=0.793X+0.101，r=0.9986，組織樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程Y=0.84X+0.0818，r=0.9965。顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.05～25 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。
2.3 回收率，準(zhǔn)確度和精密度考察 按“1.2.5”項(xiàng)下方法計(jì)算方法回收率，提取回收率和日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果顯示，?？颂婺岬姆椒ɑ厥章示?90%，日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)差均<10%。見表1。
表1 回收率和日內(nèi)、日間精密度(n=5)
2.4 穩(wěn)定性考察
2.4.1 儲(chǔ)備液的穩(wěn)定性考察：?？颂婺岷蛢?nèi)標(biāo)的峰面積的RSD均<5%，表明?？颂婺岷蛢?nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液至少在60 d內(nèi)穩(wěn)定。
2.4.2 ?？颂婺峒觾?nèi)標(biāo)血漿的穩(wěn)定性考察：埃克替尼和內(nèi)標(biāo)的穩(wěn)定性結(jié)果見表2。短期、長期及凍融條件下2者峰面積的RSD均<10%。
表2 ?？颂婺岷蛢?nèi)標(biāo)的穩(wěn)定性(n=5)
2.5 大鼠血漿和腦組織中的藥物濃度測定結(jié)果 大鼠灌胃給藥后，測定給藥前和給藥后0.5、1、2、3、4、8、12、24和48 h血漿及腦組織中的藥物濃度，結(jié)果見表3。
表3 ?？颂婺嵩诖笫笱獫{和腦組織中的藥物濃度±s，n=5)
3 討論
?？颂婺嵘鲜泻螅S著研究的不斷深入，其在血漿和多種組織中的藥動(dòng)學(xué)研究已有報(bào)道[7-8]。但藥物能否透過血腦屏障分布至腦組織，目前尚未見報(bào)道。因此本研究建立的?？颂婺嵩谀X組織中的HPLC測定方法，為進(jìn)一步研究藥物在腦組織中的藥動(dòng)學(xué)特征及進(jìn)行臨床研究奠定基礎(chǔ)。
藥物即使可透過血腦屏障進(jìn)入腦組織，其含量也會(huì)相對較低，只有借助高靈敏度和高分辨力的測定方法才能滿足臨床和科研實(shí)驗(yàn)的檢測要求。因此在探索該檢測方法時(shí)，基于既往研究的基礎(chǔ)上[9-10]，本研究建立的測定方法，藥物濃度在0.05～25 μg/mL之間具有良好的線性關(guān)系。回收率，批內(nèi)、批間差異及穩(wěn)定性均符合檢測要求。因此該方法靈敏、準(zhǔn)確且簡便。
通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，若柱平衡時(shí)間較短，連續(xù)進(jìn)樣時(shí)對保留時(shí)間有所影響，因此柱平衡很重要。測定藥物在腦組織的含量時(shí)，為了將更多的藥物游離出來，蛋白質(zhì)的去除是很關(guān)鍵的。本研究采用甲醇-乙腈沉淀蛋白法，簡單快捷，沉淀完全，色譜峰峰形良好，且獲得了較高的回收率，準(zhǔn)確度和精密度考察結(jié)果。流動(dòng)相的選擇參考相關(guān)文獻(xiàn)[10-11]，采用醋酸銨與乙腈或甲醇的不同配比進(jìn)行分離，但均未達(dá)到完全分離。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，采用本文所選的流動(dòng)相配比分離效果最佳，樣品與內(nèi)標(biāo)在10 min內(nèi)便可完全分離，且不受內(nèi)源性雜峰的干擾。
本實(shí)驗(yàn)建立了埃克替尼在血漿和腦組織中的HPLC檢測方法，本方法簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好。
通過本實(shí)驗(yàn)建立的方法測定了藥物在大鼠血漿和腦組織中的濃度，表明藥物可部分透過血腦屏障進(jìn)入腦組織，為藥物的臨床合理應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
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(編校：王冬梅)
Determination of icotinib in rat plasma and brain tissue by HPLC
YANG MeiΔ
(Department of Pharmacy, Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Mdeical College, Beijing 100021, China)
ObjectiveTo establish a HPLC method for the determination of icotinib in rat plasma and brain tissue.MethodsFifty-five rats were randomly divided into 11 groups, each group was five rats. Administration of 12 h before fasting, oral intragastric administration of icotinib 70 mg/kg. The plasma and brain tissue samples were pretreated by protein precipitation,and the separation was performed on a Waters X Terra RP C18column (2.1 mm×150 mm，5 μm)before and after administration 0.5, 1, 2, 3, 4, 8, 12, 24, 48 h.The mobile phase consisted of water-acetonitrile(25:75), at a flow rate of 0.12 mL/min.Detection was carried out at the wave length of 334 nm and the column temperature of 25 ℃.The sample size was 20 μL.ResultsThe linear range of calibration curve was 0.05-25 μg/mL, the lowest limit of detection was 0.05 μg/mL,Y=0.793X+0.101 andr=0.9986(plasma),Y=0.84X+0.0818 andr=0.9965(tissue). The method recoveries and extraction recoveries of three concentrations were respectively 98.1%, 102.1%, 101.5% and 64.3%, 69.5%, 75.8%; RSD%(n=5)were respectively 7.3, 9.2, 6.6 and 3.5, 2.3, 2.1. The intra- and inter- day precisions(RSD%,n=5) were respectively 7.14, 5.82, 3.79 and 8.08, 6.24, 4.43, less than 10%. Administration of before and after 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 24, 48 h, icotinib concentrations of plasma and brain tissue in rats were respectively 0, 0.25±0.04, 2.77±0.23, 2.54±0.61, 2.89±0.72, 3.94±0.77, 6.45±1.60, 0.33±0.09, 0.56±0.11, 0.45±0.03, 0.43±0.03 μg/mL and 0, 0.20±0.07, 0.14±0.06, 0.11±0.01, 0.15±0.08, 0.11±0.03, 0.13±0.04, 0.07±0.01, 0.08±0.02, 0.06±0.02, 0.05±0.01 μg/mL.ConclusionThe HPLC method is simple, rapid, sensitive, accurate, highly specific and reproductive.
icotinib; HPLC; plasma; brain tissue
中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院臨床課題(LC2011B39)
楊梅，通信作者，女，碩士，主管藥師，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)，臨床藥學(xué)，E-mail：yangmei910@163.com。
R927.2;O657.72
A
10.3969/j.issn.1005-1678.2016.03.55
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楊梅
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楊梅Δ
(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院 藥劑科，北京 100021)
目的 建立大鼠血漿和腦組織中?？颂婺釢舛鹊腍PLC測定方法。方法 將55只大鼠隨機(jī)分為11組，每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)物數(shù)為5。給藥前12 h禁食，口服灌胃給予?？颂婺?0 mg/kg。于給藥前和給藥后0.5、1、2、3、4、6、8、12、24和48 h，分別采集大鼠靜脈血及腦組織，樣品經(jīng)蛋白沉淀法處理后，采用Waters XTerra RP C18(2.1 mm×150 mm，5 μm)色譜柱；在流動(dòng)相為水-乙腈(25:75)，流速為0.12 mL/min，334 nm波長處，保持柱溫25 ℃的條件下進(jìn)樣20 μL檢測。結(jié)果 內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾測定，埃克替尼在0.05～25 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系Y=0.793X+0.101，r=0.9986(血漿)和Y=0.84X+0.0818，r=0.9965(組織)，最低檢測限為0.05 μg/mL。低、中、高3個(gè)濃度的方法回收率和提取回收率分別為98.1%、102.1%、101.5%和64.3%、69.5%、75.8%，RSD%(n=5)分別為7.3、9.2、6.6和3.5、2.3、2.1。日內(nèi)、日間精密度(RSD%，n=5)分別為7.14、5.82、3.79和8.08、6.24、4.43，均小于10%。給藥前和給藥后0.5、1、2、3、4、6、8、12和24 h、48 h大鼠血漿和腦組織中?？颂婺釢舛确謩e為0、(0.25±0.04)、(2.77±0.23)、(2.54±0.61)、(2.89±0.72)、(3.94±0.77)、(6.45±1.60)、(0.33±0.09)、(0.56±0.11)、(0.45±0.03)、(0.43±0.03)μg/mL和0、(0.20±0.07)、(0.14±0.06)、(0.11±0.01)、(0.15±0.08)、(0.11±0.03)、(0.13±0.04)、(0.07±0.01)、(0.08±0.02)、(0.06±0.02)、(0.05±0.01)μg/mL。結(jié)論 本方法簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好。
?？颂婺?；HPLC；血漿；腦組織
埃克替尼是我國自主研制成功，第一個(gè)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑，于2011年6月經(jīng)SFDA批準(zhǔn)上市，用于晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的治療[1-2]。對該藥物的研究也正隨著其廣泛應(yīng)用而不斷深入[3-6]。研究藥物在體內(nèi)的代謝情況，可以更好的為臨床用藥服務(wù)。目前對于埃克替尼能否透過血腦屏障進(jìn)入腦組織的研究較少，本研究旨在建立一種簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好的HPLC方法，可用于大鼠體內(nèi)?？颂婺岬乃巹?dòng)學(xué)分析，并為臨床研究奠定基礎(chǔ)。
圖1 ?？颂婺峤Y(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of icotinib
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： 55只SD大鼠，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量(200±20)g；北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。
1.1.2 藥品與試劑：鹽酸?？颂婺釋φ掌?純度98%，浙江貝達(dá)藥業(yè)有限公司，批號(hào)20130902)；內(nèi)標(biāo)舒尼替尼(純度>99%，輝瑞制藥有限公司，批號(hào)U684A)。乙腈、甲醇為Fisher公司產(chǎn)品(色譜級(jí))；Millipore去離子水；其余試劑均為分析純。
1.1.3 儀器：Waters高效液相色譜系統(tǒng)，包括：515泵，717自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，溫度控制器，2487紫外檢測器，Epower色譜工作站；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；Allegra 21R低溫離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司)。
1.2 方法
1.2.1 色譜條件：色譜柱：Waters XTerra RP C18(2.1 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：水：乙腈(25:75)；流速：0.12 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測波長：334 nm；柱溫：25 ℃。在上述色譜條件下，進(jìn)樣埃克替尼及內(nèi)標(biāo)。
1.2.2 埃克替尼與內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液的配制：精密稱取?？颂婺釋φ掌?0.0 mg于50 mL量瓶中，用去離子水(pH6.8)溶解并稀釋至刻度，得濃度為600.0 μg/mL?？颂婺醿?chǔ)備液，于冰箱4 ℃保存；精密稱取舒尼替尼12.5 mg于50 mL量瓶中，用去離子水(pH6.8)溶解并稀釋至刻度，得濃度為250.0 μg/mL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，于冰箱4 ℃保存。臨用時(shí)稀釋成25 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。
1.2.3 血漿樣品和組織：取血漿樣品或勻漿后的組織樣品100 μL，加25 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液150 μL，混勻，加甲醇-乙腈(1:9)3mL，渦旋1 min后放置5 min，于3500 r/min離心10 min，取上清液于60 ℃水浴放置，氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?.5 mL流動(dòng)相溶解，離心(r=10cm，15000 rpm，10 min)，取上清液，進(jìn)樣20 μL。
1.2.4 線性關(guān)系：分別配制0.05、0.1、0.5、2.5、5、10、25 μg/mL的埃克替尼對照品血漿或組織樣品，進(jìn)樣20 μL檢測，以?？颂婺岷蛢?nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，埃克替尼的濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。
1.2.5 回收率、準(zhǔn)確度和精密度的考察：分別配制?？颂婺釢舛葹榈?、中、高(0.5、5、25 μg/mL)的樣品各5份，按樣品處理方法操作后測定，計(jì)算方法回收率。另用流動(dòng)相配制相應(yīng)系列的?？颂婺崛芤海唤?jīng)提取直接測定，以此為標(biāo)準(zhǔn)，將2組峰面積相比，計(jì)算埃克替尼的提取回收率。同法配制?？颂婺釢舛葹榈?、中、高(0.5、5、25 μg/mL)的樣品各5份，同日處理進(jìn)行測定，計(jì)算日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)差。以后取低、中、高(0.5、5、25 μg/mL)的樣品各1份，連續(xù)測定5d。
作為戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)，傳統(tǒng)商貿(mào)企業(yè)應(yīng)用電子商務(wù)對區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展至關(guān)重要。近年來，全市雖然安排了一定的財(cái)政資金用于扶持電子商務(wù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展，但與杭州、深圳等發(fā)達(dá)地區(qū)設(shè)立專項(xiàng)資金支持傳統(tǒng)商貿(mào)企業(yè)應(yīng)用電子商務(wù)相比，全市對電商的扶持力度還不夠大，政府對傳統(tǒng)商貿(mào)企業(yè)線上線下發(fā)展的引導(dǎo)作用沒有充分發(fā)揮。
1.2.6 穩(wěn)定性考察
① 儲(chǔ)備液的穩(wěn)定性考察 取?？颂婺岷蛢?nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，分別在1、10、25、45、60 d用流動(dòng)相配制成60和25 μg/mL的溶液直接進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積。
② ?？颂婺峒觾?nèi)標(biāo)血漿的穩(wěn)定性考察 按“1.2.3”項(xiàng)下方法分別配制低、中、高3種濃度(0.5、5、25 μg/mL)的血漿樣品各5份，分別在短期(0、6、12、18、24 h)，長期(-20 ℃凍存1、5、10、20、30d)和凍融(1、2、3、4、5次)條件下進(jìn)行色譜測定，記錄?？颂婺岷蛢?nèi)標(biāo)的峰面積。
1.3 大鼠體內(nèi)藥物濃度測定
1.3.1 分組及給藥方法：分組：按照采樣時(shí)間點(diǎn)即給藥前和給藥后0.5、1、2、3、4、8、12、24和48 h，將55只大鼠隨機(jī)分為11組，每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)物數(shù)為5。
給藥方法：精密稱取?？颂婺釋φ掌?00.0 mg于100 mL量瓶中，用去離子水(pH6.8)溶解并稀釋至刻度，得濃度為2 mg/mL?？颂婺崛芤骸４笫笤诮o藥前12 h禁食，按照70 mg/kg的劑量口服灌胃給予埃克替尼。
1.3.2 標(biāo)本提取及處理：標(biāo)本提?。河诮o藥前和給藥后0.5、1、2、3、4、8、12、24和48 h，將大鼠抓取固定后，使其頸部充分暴露，剪開頸部皮膚、肌肉，充分暴露血管，自頸靜脈取血5 mL；然后將大鼠斷頭，剪開顱骨，取腦組織1 g，標(biāo)本放置于-20 ℃冰箱凍存待測。
標(biāo)本處理：血液于3000 rpm/min離心10 min后取血漿。每份組織標(biāo)本加入乙酸銨緩沖液2 mL，使用研缽充分研磨后，3000 r/min離心10 min后提取上清液，-20 ℃冰箱凍存。
2 結(jié)果
圖2 空白樣本、血漿和腦組織樣本及內(nèi)標(biāo)的HPLC圖譜1：?？颂婺?；2：舒尼替尼Fig.2 HPLC chromatogram of negative samples, plasma and brain tissue samples, sunitinib1：icotinib; 2：sunitinib
2.2 線性關(guān)系 埃克替尼血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=0.793X+0.101，r=0.9986，組織樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程Y=0.84X+0.0818，r=0.9965。顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.05～25 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。
2.3 回收率，準(zhǔn)確度和精密度考察 按“1.2.5”項(xiàng)下方法計(jì)算方法回收率，提取回收率和日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果顯示，?？颂婺岬姆椒ɑ厥章示?90%，日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)差均<10%。見表1。
表1 回收率和日內(nèi)、日間精密度(n=5)
2.4 穩(wěn)定性考察
2.4.1 儲(chǔ)備液的穩(wěn)定性考察：?？颂婺岷蛢?nèi)標(biāo)的峰面積的RSD均<5%，表明?？颂婺岷蛢?nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液至少在60 d內(nèi)穩(wěn)定。
2.4.2 ?？颂婺峒觾?nèi)標(biāo)血漿的穩(wěn)定性考察：埃克替尼和內(nèi)標(biāo)的穩(wěn)定性結(jié)果見表2。短期、長期及凍融條件下2者峰面積的RSD均<10%。
表2 ?？颂婺岷蛢?nèi)標(biāo)的穩(wěn)定性(n=5)
2.5 大鼠血漿和腦組織中的藥物濃度測定結(jié)果 大鼠灌胃給藥后，測定給藥前和給藥后0.5、1、2、3、4、8、12、24和48 h血漿及腦組織中的藥物濃度，結(jié)果見表3。
表3 ?？颂婺嵩诖笫笱獫{和腦組織中的藥物濃度±s，n=5)
3 討論
?？颂婺嵘鲜泻螅S著研究的不斷深入，其在血漿和多種組織中的藥動(dòng)學(xué)研究已有報(bào)道[7-8]。但藥物能否透過血腦屏障分布至腦組織，目前尚未見報(bào)道。因此本研究建立的?？颂婺嵩谀X組織中的HPLC測定方法，為進(jìn)一步研究藥物在腦組織中的藥動(dòng)學(xué)特征及進(jìn)行臨床研究奠定基礎(chǔ)。
藥物即使可透過血腦屏障進(jìn)入腦組織，其含量也會(huì)相對較低，只有借助高靈敏度和高分辨力的測定方法才能滿足臨床和科研實(shí)驗(yàn)的檢測要求。因此在探索該檢測方法時(shí)，基于既往研究的基礎(chǔ)上[9-10]，本研究建立的測定方法，藥物濃度在0.05～25 μg/mL之間具有良好的線性關(guān)系。回收率，批內(nèi)、批間差異及穩(wěn)定性均符合檢測要求。因此該方法靈敏、準(zhǔn)確且簡便。
通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，若柱平衡時(shí)間較短，連續(xù)進(jìn)樣時(shí)對保留時(shí)間有所影響，因此柱平衡很重要。測定藥物在腦組織的含量時(shí)，為了將更多的藥物游離出來，蛋白質(zhì)的去除是很關(guān)鍵的。本研究采用甲醇-乙腈沉淀蛋白法，簡單快捷，沉淀完全，色譜峰峰形良好，且獲得了較高的回收率，準(zhǔn)確度和精密度考察結(jié)果。流動(dòng)相的選擇參考相關(guān)文獻(xiàn)[10-11]，采用醋酸銨與乙腈或甲醇的不同配比進(jìn)行分離，但均未達(dá)到完全分離。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，采用本文所選的流動(dòng)相配比分離效果最佳，樣品與內(nèi)標(biāo)在10 min內(nèi)便可完全分離，且不受內(nèi)源性雜峰的干擾。
本實(shí)驗(yàn)建立了埃克替尼在血漿和腦組織中的HPLC檢測方法，本方法簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好。
通過本實(shí)驗(yàn)建立的方法測定了藥物在大鼠血漿和腦組織中的濃度，表明藥物可部分透過血腦屏障進(jìn)入腦組織，為藥物的臨床合理應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
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(編校：王冬梅)
Determination of icotinib in rat plasma and brain tissue by HPLC
YANG MeiΔ
(Department of Pharmacy, Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Mdeical College, Beijing 100021, China)
ObjectiveTo establish a HPLC method for the determination of icotinib in rat plasma and brain tissue.MethodsFifty-five rats were randomly divided into 11 groups, each group was five rats. Administration of 12 h before fasting, oral intragastric administration of icotinib 70 mg/kg. The plasma and brain tissue samples were pretreated by protein precipitation,and the separation was performed on a Waters X Terra RP C18column (2.1 mm×150 mm，5 μm)before and after administration 0.5, 1, 2, 3, 4, 8, 12, 24, 48 h.The mobile phase consisted of water-acetonitrile(25:75), at a flow rate of 0.12 mL/min.Detection was carried out at the wave length of 334 nm and the column temperature of 25 ℃.The sample size was 20 μL.ResultsThe linear range of calibration curve was 0.05-25 μg/mL, the lowest limit of detection was 0.05 μg/mL,Y=0.793X+0.101 andr=0.9986(plasma),Y=0.84X+0.0818 andr=0.9965(tissue). The method recoveries and extraction recoveries of three concentrations were respectively 98.1%, 102.1%, 101.5% and 64.3%, 69.5%, 75.8%; RSD%(n=5)were respectively 7.3, 9.2, 6.6 and 3.5, 2.3, 2.1. The intra- and inter- day precisions(RSD%,n=5) were respectively 7.14, 5.82, 3.79 and 8.08, 6.24, 4.43, less than 10%. Administration of before and after 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 24, 48 h, icotinib concentrations of plasma and brain tissue in rats were respectively 0, 0.25±0.04, 2.77±0.23, 2.54±0.61, 2.89±0.72, 3.94±0.77, 6.45±1.60, 0.33±0.09, 0.56±0.11, 0.45±0.03, 0.43±0.03 μg/mL and 0, 0.20±0.07, 0.14±0.06, 0.11±0.01, 0.15±0.08, 0.11±0.03, 0.13±0.04, 0.07±0.01, 0.08±0.02, 0.06±0.02, 0.05±0.01 μg/mL.ConclusionThe HPLC method is simple, rapid, sensitive, accurate, highly specific and reproductive.
icotinib; HPLC; plasma; brain tissue
中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院臨床課題(LC2011B39)
楊梅，通信作者，女，碩士，主管藥師，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)，臨床藥學(xué)，E-mail：yangmei910@163.com。
R927.2;O657.72
A
10.3969/j.issn.1005-1678.2016.03.55
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