梁成剛， 陳晴晴， 石桃雄， 陳其皎， 孟子燁， 陳慶富

(貴州師范大學(xué) 蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心/貴州省蕎麥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550001)

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普通蕎麥種內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶序列分析

梁成剛， 陳晴晴， 石桃雄， 陳其皎， 孟子燁， 陳慶富

(貴州師范大學(xué) 蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心/貴州省蕎麥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550001)

摘要：【目的】比較普通蕎麥Fagopyrum esculentum種內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶基因(MAPK)序列的差異，研究MAPK基因序列在普通蕎麥栽培進化過程中的變化?！痉椒ā恳云胀ㄊw麥的9個栽培品種和3個落花落果野生種質(zhì)為材料，PCR特異性擴增獲得MAPK基因的保守片段，對基因片段序列進行差異分析和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測?！窘Y(jié)果】蕎麥MAPK基因cDNA全長為2 835 bp，開放閱讀框1 827 bp,編碼609個氨基酸，含有TDY的三肽模塊，為植物D組MAPK蛋白。PCR擴增獲得12個供試材料的MAPK序列，其單型不變位點為723個，多態(tài)位點為70個。9個栽培品種間開放閱讀框(ORF)區(qū)域無序列差異，3個野生種質(zhì)間ORF區(qū)域也無序列差異。栽培品種與野生品種的ORF區(qū)域序列含有8個差異位點，編碼3個差異氨基酸。其中，ORF區(qū)域第13位點組氨酸(H)→酪氨酸(Y)發(fā)生置換，導(dǎo)致1個α-螺旋構(gòu)象發(fā)生變化。【結(jié)論】普通蕎麥MAPK基因序列高度保守，栽培馴化對ORF區(qū)域第13位點差異氨基酸的選擇具有高度一致性。

關(guān)鍵詞：普通蕎麥；絲裂原活化蛋白激酶；序列分析；氨基酸位點；蛋白結(jié)構(gòu)

蕎麥Fagopyrum起源于中國的西南地區(qū)，是我國重要的雜糧作物之一[1]。蕎麥具有食藥兼用特性，營養(yǎng)價值豐富、藥用保健效果較好[2-3]。例如蕎麥所富含的黃酮類化合物，尤其是蘆丁具有明顯的降血糖、降血脂和降血壓功效[4]。由于蕎麥具有生育期短、耐貧瘠特性，特別適合在高寒地區(qū)種植[5]。普通蕎麥Fagopyrum esculentum又名甜蕎，包含栽培和野生類型。栽培甜蕎種植面積較廣，在我國南北地區(qū)均有栽培。野生甜蕎是栽培甜蕎的祖先，主要分布于中國西南地區(qū)，特別是西藏、云南和四川，其形態(tài)與栽培甜蕎非常相似，但具有落花、落果習(xí)性[1, 6-7]。植物絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)是生物信號傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要信號分子[8-10]。MAPK級聯(lián)途徑通過調(diào)節(jié)植物細(xì)胞分裂、分化及凋亡等過程，調(diào)控植株生長和發(fā)育[9, 11-12]。不僅如此，MAPK信號通路還在植物激素代謝以及逆境脅迫應(yīng)答調(diào)控方面發(fā)揮重要作用[11, 13-15]。高華健等[16]研究發(fā)現(xiàn)MAPK通過調(diào)節(jié)H2O2和生長素的平衡可以調(diào)控水稻幼苗根系的生長。梁衛(wèi)紅等[17]研究發(fā)現(xiàn)逆境脅迫如高鹽、低溫和脫落酸能使OsMAPK14基因表達(dá)上調(diào)，進而降低逆境對水稻生長發(fā)育的影響。此外，有研究指出MAPK可與IDA(Inflorescence deficient in abscission)、HAE(受體蛋白激酶HAESA)和HSL2(HAESA-like 2)共同作用，調(diào)控離層細(xì)胞的程序化死亡，進而參與調(diào)控植物花器官的脫落過程[18]。目前鮮見有關(guān)蕎麥MAPK基因的相關(guān)報道。本試驗根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組基因測序所得到MAPK的Unigene 序列，設(shè)計特異性引物，經(jīng)PCR擴增測序分析普通蕎麥栽培品種與野生種質(zhì)間此基因片段序列的差異，以期為蕎麥MAPK基因功能研究與蕎麥的花果器官脫落、起源與進化等相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

普通蕎麥：9個栽培品種， 3個具有落花、落果習(xí)性的野生種質(zhì)，均由貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心提供(表1)。使用1.25 mL· L-1新潔爾滅溶液對種子消毒后放置于25 ℃光照培養(yǎng)箱，待種子發(fā)芽后播種于含腐殖土的花盆。

表1供試的普通蕎麥材料

Tab.1The common buckwheat materials used in this study

編號材料花果脫落習(xí)性收集地E1榆林甜蕎不落陜西E2寧蕎1號不落寧夏E3信農(nóng)1號不落寧夏E4赤甜1號不落內(nèi)蒙古E5定甜2號不落甘肅E6平蕎2號不落甘肅E7威甜1號不落貴州E8自花甜蕎不落貴州E9綜甜1號不落貴州WE1野生甜蕎1易落西藏WE2野生甜蕎2易落云南WE3野生甜蕎3易落云南

1.2PCR擴增與測序

根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組基因測序所得到的蕎麥Unigene序列，進行基因功能注釋和數(shù)據(jù)庫基因序列比對，獲得蕎麥MAPK序列片段。根據(jù)MAPK基因序列片段的保守區(qū)域，利用Primer5.0軟件設(shè)計正向特異性引物5′-GTGTTGCTCACCAGTTGGATT-3′和反向特異性引物5′-GTCAGTGGGGTGACCTATCTT-3′。幼苗期對供試材料植株嫩葉進行取樣，使用改良CTAB法提取DNA，PCR擴增參考陳晴晴等[19]的方法。PCR反應(yīng)體系總體積為60 μL，包含2×Taq PCR MasterMix 30 μL，5 μmol·L-1引物各6 μL，40 ng·μL-1DNA模板和ddH2O 9 μL。擴增反應(yīng)體系為：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性60 s， 退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.3序列分析與進化樹的構(gòu)建

在本地數(shù)據(jù)庫(未發(fā)表)對前期轉(zhuǎn)錄組測序所獲得的蕎麥MAPK 基因的Unigene序列進行Nucleotide blast，獲得蕎麥MAPK基因的cDNA序列；在NCBI數(shù)據(jù)庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)上使用Nucleotide blast對測序獲得的基因片段序列進行在線比對；使用Protein blast進行氨基酸序列的在線比對。使用ClustalW軟件進行多序列比對分析；使用DNAssist2.2和MEGA6軟件進行核酸和氨基酸序列差異分析；使用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。在網(wǎng)頁(http://swissmodel.expasy.org/workspace)上使用Swiss-model對MAPK片段進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測[20-22]。

2結(jié)果與分析

2.1蕎麥MAPK基因序列

對蕎麥轉(zhuǎn)錄組基因測序所得到的Unigene進行基因功能注釋和數(shù)據(jù)庫基因序列比對，獲得MAPK的Unigene序列。在本地基因組數(shù)據(jù)庫中對該Unigene基因序列進行Nucleotide blast分析，獲得蕎麥MAPK序列。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該基因cDNA序列全長為2 835 bp，堿基組成為A占29.5%、C占20.6%、G占22.1%、T占27.8%。蕎麥MAPK基因含有1個1 827 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼609個氨基酸。從圖1可知，該ORF區(qū)域編碼的氨基酸包含TDY的三肽模塊，為植物D組MAPK蛋白的典型結(jié)構(gòu)。NCBI數(shù)據(jù)庫在線使用Nucleotide blast對所獲得的蕎麥MAPK基因序列進行比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn)蕎麥MAPK基因序列與陸地棉Gossypiumhirsutum、煙草Nicotianatabacum、可可Theobromacacao等數(shù)十個物種上百個已知MAPK家族基因序列的相似性高于70%，屬于高度同源。因此，認(rèn)為該基因為植物MAPK基因D組中的一員。

*標(biāo)記MAPK典型的TDY結(jié)構(gòu)。

2.2絲裂原活化蛋白激酶的PCR擴增

提取普通蕎麥9個栽培品種和3個野生種質(zhì)植株幼嫩葉片的DNA，利用特征引物擴增MAPK基因序列。瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，12個供試材料中PCR擴增得到的產(chǎn)物在約900 bp處產(chǎn)生特異性條帶；測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E1中產(chǎn)生的特異條帶序列片段為886 bp(圖2)。對序列片段進行本地數(shù)據(jù)庫Nucleotide blast比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該片段部分序列與普通蕎麥MAPK基因cDNA片段部分序列相似性達(dá)到100%(圖3)，說明PCR擴增產(chǎn)物即為普通蕎麥MAPK基因片段。

M：Marker條帶；P:陽性對照。

圖2普通蕎麥特異引物PCR擴增結(jié)果

Fig.2Amplification products of common buckwheat DNA using specified primers

圖3　普通蕎麥DNA序列比對結(jié)果

2.3絲裂原活化蛋白激酶的進化分析

利用DNAssist軟件對E1中目標(biāo)片段基因序列進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該片段含有1個序列為300 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼1個MAPK蛋白保守結(jié)構(gòu)域，與煙草、陸地棉、桑樹等20余個物種中上百個已知的MAPK家族蛋白序列相似性達(dá)78%～88%。通過Protein blast比對得到與普通蕎麥MAPK蛋白片段序列相似性較高的煙草(AFP20229.1)、陸地棉(AJA29662.1；AAZ83349.1)、中棉(ACC63895.1)、野芭蕉(ABF69963.1；AIU98489.1)、苜蓿(XP 013445445.1)、楊樹(XP 002298926.1)、花生(ABI95363.1)、蓖麻(XP 002528477.1)、桑樹(AIE11757.1)MAPK蛋白片段序列。利用MEGA6軟件對其進行系統(tǒng)進化分析，從聚類圖可知，同一物種或親緣關(guān)系較近物種的MAPK序列差異較小，被聚在一起。由圖4可知，普通蕎麥栽培品種與野生種質(zhì)的MAPK蛋白被聚在一起，親緣關(guān)系近。

2.4普通蕎麥絲裂原活化蛋白激酶序列差異分析

對12個供試材料擴增得到的目標(biāo)基因片段序列進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該片段序列的相對堿基組成頻率差別不大，A為28.81%、T(U)為32.73%、C為18.30%，G為20.15%，A+T含量(61.54%)明顯高于C+G(38.46%)。使用ClustalW對該片段序列進行多重比較分析，去掉序列兩端缺失導(dǎo)致排列不整齊的位點，對其中793個位點進行多態(tài)性統(tǒng)計，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在12個供試材料中該基因序列片段的不變位點為723個，多態(tài)位點為70個(包含簡約信息位點數(shù)43個)。其中，在9個栽培品種間多態(tài)位點僅為22個(包含簡約信息位點數(shù)10個)，3個野生材料間多態(tài)位點為25個。

使用ClustalW對12個供試材料MAPK基因片段序列進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)普通蕎麥9個栽培品種ORF區(qū)域序列無位點差異，高度保守；3個野生材料中ORF區(qū)域序列也無位點差異，高度保守；但栽培品種與野生材料ORF區(qū)域序列含有8個差異位點。對ORF編碼的氨基酸序列進行分析發(fā)現(xiàn)，普通蕎麥栽培品種與野生材料ORF結(jié)構(gòu)域氨基酸序列存在3個變異位點(表2)。

圖4　不同植物MARK蛋白序列的聚類分析

Tab.2The differential sites of the nucleotides and amino acids in MARK ORF fragments between cultivars and wild types of common buckwheat

樣品編號堿基位點氨基酸位點8376712918920421024931323E1GTAATGGCYHME2GTAATGGCYHME3GTAATGGCYHME4GTAATGGCYHME5GTAATGGCYHME6GTAATGGCYHME7GTAATGGCYHME8GTAATGGCYHME9GTAATGGCYHMWE1ACTGGACTCYLWE2ACTGGACTCYLWE3ACTGGACTCYL

2.5普通蕎麥絲裂原活化蛋白激酶結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用Swiss-model對MAPK的ORF片段進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)普通蕎麥栽培品種和野生種質(zhì)材料間ORF蛋白結(jié)構(gòu)存在明顯的構(gòu)象差異。從圖5中可知，與栽培品種相比，3個氨基酸差異位點導(dǎo)致野生種質(zhì)材料ORF蛋白的1個α-螺旋構(gòu)象發(fā)生改變。進一步對3個氨基酸位點單位點置換后進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ORF第13位點組氨酸(H)→酪氨酸(Y)發(fā)生轉(zhuǎn)換導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)域發(fā)生構(gòu)象變化(圖5D)，而其余2個氨基酸位點的轉(zhuǎn)換并不影響蛋白的構(gòu)象(圖5C、5E)。

A：栽培品種； B: 野生種質(zhì); C、D、E分別為栽培品種MAPK蛋白第3位點Y→C(C)、第13位點H→Y(D)和第23位點M→L(E)發(fā)生轉(zhuǎn)換后的結(jié)構(gòu)域；箭頭指向結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的區(qū)域。

圖5普通蕎麥MARK蛋白結(jié)構(gòu)域分析

Fig.5Domain analysis of MAPK protein of common buckwheat

3討論與結(jié)論

蕎麥起源于我國西南地區(qū)，種植歷史悠久。蕎麥生育期短、生長適應(yīng)性強、抗逆性較強，在歷史上一直作為一種重要的救災(zāi)糧食作物[5]。植物MAPK基因是MAPK級聯(lián)信號途徑中的關(guān)鍵信號分子，在逆境脅迫應(yīng)答方面具有重要調(diào)控作用[10-11]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)蕎麥MAPK序列全長為2 835 bp，包含1個1 827 bp的ORF，編碼609個氨基酸。植物MAPK具有典型的TEY區(qū)或TDY區(qū)的模塊，其中，TEY類分為A、B、C 3組，TDY類則單獨為D組[11]。蕎麥MAPK序列中含有2個TDY模塊，屬于D組MAPK蛋白。

通過PCR擴增和目標(biāo)片段測序得到的目標(biāo)基因片段的部分序列與MAPK基因部分序列相似性達(dá)到100%，因此認(rèn)為PCR擴增得到的產(chǎn)物即為普通蕎麥MAPK基因片段。特定基因序列間的差異可作為研究物種進化關(guān)系的依據(jù)[23]。在線Blast比對發(fā)現(xiàn)，普通蕎麥MAPK片段序列與近緣植物，例如陸地棉的MAPK1基因(KM190106.1)序列相似性高于80%，其ORF區(qū)域編碼1個MAPK蛋白保守結(jié)構(gòu)域，與陸地棉(AJA29662.1；AAZ83349.1)MAPK蛋白等序列相似性均高于80%，說明植物MAPK基因序列在進化過程中較為保守。李鳳梅[25]研究發(fā)現(xiàn)植物絲裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)基因序列高度保守。本研究發(fā)現(xiàn)12個供試材料間MAPK基因片段序列793個位點中多態(tài)位點為70個，ORF區(qū)域序列多態(tài)位點僅為8個。尤其是9個栽培甜蕎間MAPK基因片段ORF區(qū)域序列無差異位點，3個野生甜蕎間MAPK基因片段ORF區(qū)域序列無位點差異，說明栽培馴化過程中普通蕎麥MAPK基因序列高度保守。

Cho等[18]研究發(fā)現(xiàn)，MAPK基因參與調(diào)控了植物花器官的花梗離層細(xì)胞程序化死亡的過程，進而介導(dǎo)花器官的脫落。Meng等[26]研究指出，擬南芥中MAPK級聯(lián)信號下游ERECTA受體蛋白激酶通過促進細(xì)胞增殖進而調(diào)控花梗形態(tài)建成。野生甜蕎是栽培甜蕎的祖先，易落花落果[1]。克服落花落果習(xí)性一直是普通蕎麥栽培馴化的一個主要目標(biāo)。對普通蕎麥MAPK基因片段ORF區(qū)域序列分析發(fā)現(xiàn)，栽培甜蕎與野生甜蕎間存在8個堿基差異位點，編碼3個差異氨基酸，導(dǎo)致1個α-螺旋構(gòu)象發(fā)生改變。此外，研究還發(fā)現(xiàn)9個栽培甜蕎間ORF區(qū)域序列高度一致，3個野生甜蕎間ORF區(qū)域序列也保持高度一致。說明人工栽培馴化對這3個差異氨基酸位點的選擇具有高度一致性。與9個栽培甜蕎相比，供試的3個野生甜蕎均具有落花落果習(xí)性。對3個差異氨基酸位點進行單位點置換的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)α-螺旋構(gòu)象變化是由ORF區(qū)域第13位點組氨酸(H)→酪氨酸(Y)發(fā)生置換所導(dǎo)致，暗示其可能與野生甜蕎落花進化為不落花型栽培甜蕎事件有關(guān)。研究結(jié)果為進一步研究蕎麥MAPK基因功能以及栽培進化提供了理論基礎(chǔ)。

致謝：感謝貴州師范大學(xué)黎瑞源老師給予的支持和幫助！

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【責(zé)任編輯莊延，周志紅】

Sequence analysis of mitogen-activated protein kinases of common buckwheat, Fagopyrum esculentum

LIANG Chenggang, CHEN Qingqing, SHI Taoxiong, CHEN Qijiao, MENG Ziye, CHEN Qingfu

(Research Center of Buckwheat Industry Technology, Guizhou Normal University / Buckwheat Engineering Research Center of Guizhou Province, Guiyang 550001, China)

Abstract：【Objective】To identify the difference of mitogen-activated protein kinase gene (MAPK) sequences among intraspecific common buckwheat, Fagopyrum esculentum, and study the sequence change during the chronical domestication process. 【Method】 The common buckwheat varieties, containing nine cultivars and three wild types with shattering habit, were selected for PCR amplification of the conservative fragments of MAPK gene. Sequences were analyzed and protein conformations were predicted. 【Result】 The full length of buckwheat MAPK cDNA was 2 835 bp, the length of the open readling frame (ORF) was 1 827 bp, and 609 amino acids containing the TDY tripeptide module were encoded. The buckwheat MARK belonged to the group D of plant MARK proteins. A total of 723 invariable sites and 70 polymorphic sites in MAPK sequence of common buckwheat were identified in 12 tested materials. We did not find difference among the ORF sequences of nine cultivars, neither among three wild types. There were eight differential nucleotides in the ORF of MAPK gene which encoded three amino acid polymorphisms between the cultivars and wild types. We found a change of α-helix conformation which was induced by transforming histidine (H) to tyrosine (Y) at the 13th site in the ORF of MARK. 【Conclusion】 The MAPK sequence is highly conserved and the 13th amino acid site has been highly consistently selected during the chronical process of domestication.

Key words：Fagopyrum esculentum; MAPK; sequence analysis; amino acid site; protein conformation

收稿日期：2015- 11- 04優(yōu)先出版時間：2016- 06- 01

作者簡介：梁成剛(1985—)，男，助理研究員，博士，E-mail: jesselcg@163.com；通信作者：陳慶富(1966—)，教授，博士，E-mail: cqf1966@163.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金 (31471562，31171609)；國家燕麥?zhǔn)w麥現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(CARS- 08-A4)；貴州省高層次創(chuàng)新型人才培養(yǎng)對象十百千計劃(2014GZ97588)；貴州省蕎麥工程技術(shù)研究中心項目(黔科合農(nóng)G字【2015】4003號)。

中圖分類號：S517；S321

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001- 411X(2016)04- 0090- 07

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梁成剛，陳晴晴，石桃雄， 等.普通蕎麥種內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶序列片段分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2016,37(4):90- 96.