張登基，郭慧琳，楊　明，賀奮義，高　靜*，孟林明，王世泰

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鴿Ⅰ型副粘病毒免疫膠體金診斷試劑條的靈敏性和特異性試驗(yàn)

張登基1*，郭慧琳1，楊明2，賀奮義1，高靜1**，孟林明1，王世泰3

（1.甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州730046；2. 甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?44000；3. 甘肅省畜牧業(yè)產(chǎn)業(yè)管理局，甘肅 蘭州730030）

摘要：為建立一種快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)鴿Ⅰ型副粘病毒（PPMV-1）的膠體金免疫層析方法，采用檸檬酸鈉還原法制備膠體顆粒，膠體金用抗PPMV-1 F蛋白單克隆抗體標(biāo)記并純化，包被在玻璃纖維膜上，另外將純化抗PPMV-1 F蛋白單克隆抗體和羊抗鼠的二抗包被在NC膜上作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，組裝成PPMV-1快速檢測(cè)條。通過(guò)對(duì)雞新城疫、雞傳染性支氣管炎、雞減蛋綜合征、雞馬立克、豬瘟、豬傳染性胃腸炎、羊痘、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等幾種樣品用試紙條進(jìn)行靈敏性和特異性檢測(cè)，結(jié)果表明，試劑條只能與新城疫發(fā)生交叉反應(yīng)，而與上述其他樣品不發(fā)生交叉反應(yīng)，該試紙條的特異性強(qiáng)，靈敏性高。

關(guān)鍵詞：鴿Ⅰ型副粘病毒；膠體金；診斷試紙條；特異性試驗(yàn)

鴿Ⅰ型副粘病毒是一種由禽Ⅰ型副粘病毒引起的、流行于鴿群的高度接觸性急性傳染病，它以腸炎、嚴(yán)重腹瀉和神經(jīng)癥狀為特征，是危害養(yǎng)鴿業(yè)的主要疫病之一。該病于1981年首次在蘇丹和埃及的信鴿中發(fā)現(xiàn)，隨后迅速傳播到歐洲、美國(guó)和加拿大等地，1985年就已經(jīng)傳到了亞洲。在1986年前后，我國(guó)的鴿群中也發(fā)現(xiàn)了該病。該病已經(jīng)給肉鴿養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1-8］。因此，對(duì)該病的診斷技術(shù)和防制措施的研究具有重要意義。現(xiàn)今該病的診斷主要根據(jù)臨診癥狀、病理變化和流行病學(xué)進(jìn)行初步診斷，確診須經(jīng)病毒的分離和鑒定。目前常用的診斷方法有ELISA和RT-PCR［9-15］，這些方法往往需要必要的儀器設(shè)備和試劑，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，基層獸醫(yī)部門(mén)往往不具備工作條件和技術(shù)力量。膠體金快速免疫層析技術(shù)是20世紀(jì)90年代國(guó)外興起的一種快速診斷技術(shù)。國(guó)內(nèi)近年來(lái)在醫(yī)學(xué)上研究成功了許多診斷試劑盒或紙條，我們利用單克隆抗體技術(shù)和金標(biāo)免疫層析技術(shù)研制快速診斷試劑盒，建立了一種針對(duì)鴿Ⅰ型副粘病毒的快速診斷技術(shù)?，F(xiàn)將該試劑條靈敏性和特異性試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器

干燥箱、電子天平（上海天呈）、生化培養(yǎng)箱、臺(tái)式冷凍離心機(jī)（HEALFORCE）、普通離心機(jī)（湖南）、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海）、恒溫磁力攪拌器（上海）。

1.1.2主要試劑與材料

氯化金、檸檬酸三鈉、碳酸鉀、牛血清白蛋白、PEG20000、海藻糖、Tween-20；硝酸纖維素薄膜whatman AE 99和Millipore 135購(gòu)自上海捷寧生物科技有限公司；玻璃纖維、聚酯膜、PVC板、吸水紙均由上海金標(biāo)生物科技有限公司提供；羊抗鼠抗體（solabio）、鴿Ⅰ型副粘病毒單克隆抗體，由課題組自制。

1.1.3病料及毒菌株

鴿Ⅰ型副粘病毒病料（腦、脾、肺）38份，雞新城疫病料16份、雞傳染性支氣管炎、雞減蛋綜合征、雞馬立克、豬瘟、豬傳染性胃腸炎、羊痘、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌樣品若干，以上樣品由課題組收集保存。

1.2主要試劑配制

1.2.1樣品墊處理液含l %（w/v） BSA、l %（w/v）PVP、0.5 % Tween-20 和0.02 %（w/v）疊氮鈉的 Tris（0.05 M pH 8.5）。

1.2.2金標(biāo)復(fù)溶液

含20 %（w/v）蔗糖、l %（w/v）BSA、l %（w/v）PVP和0.02 %（w/v）疊氮鈉的PBS（0.015 M pH 7.4）。

1.3方法

1.3.1膠體金標(biāo)記物的制備及純化［16，17］

用檸檬酸還原法制備金溶液，用0.1 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)膠體金的pH至8.5～9.0。確定膠體金與待標(biāo)記蛋白質(zhì)用量比例：將膠體金溶液調(diào)至pH 8.5～9.0后，分裝10管，每管1 mL，將抗PPMV-1 F蛋白McAb用適合的稀釋液系列稀釋成100 μg/mL～800 μg/mL，分別取0.1 mL加入1管金溶膠內(nèi)，對(duì)照管加0.1 mL稀釋液，混合均勻。放置5 min后，在上述各管內(nèi)加入0.1 mL 10 %NaCl溶液，混勻后靜置2 h，觀察結(jié)果（表1）。

確定膠體金標(biāo)記最適pH：將膠體金用1 mol/L HCl或0.1 mol/L K2CO3調(diào)整pH，分別達(dá)到6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和9.5，各取1 mL，加入最適抗原量，再加入0.1 mL 10 %NaCl溶液，混勻后靜置8 h，觀察結(jié)果（表2）。

在膠體金最低穩(wěn)定量的基礎(chǔ)上再加20 %作為穩(wěn)定膠體金所需的實(shí)際抗體量，調(diào)膠體金pH稍高于最適pH，分別取所需量的膠體金和相應(yīng)量的抗PPMV-1 F蛋白McAb，在攪拌下將金溶膠液和抗體蛋白混合，40 min后再加5 % BSA使其最終濃度為1 %，防止抗體蛋白和膠體金聚合和沉淀。以3 000 r/min離心20 min，棄去由凝聚的金膠粒形成的沉淀。然后4 ℃ 12 000 rpm離心30 min，仔細(xì)吸出上清，沉淀物用含1 %BSA的膠體金復(fù)溶液溶解，加至原體積的1/10，在4 ℃下保存。

1.3.2鴿Ⅰ型副粘病毒診斷試劑條制作

（1）樣品墊預(yù)處理。裁剪玻璃纖維或聚酯膜材質(zhì)樣品墊大小為40 cm×15 mm；將樣品墊浸泡于處理液中，使處理液能均勻覆蓋全部后取出；37 ℃干燥后，用裝有干燥劑的密封袋室溫保存。

（2）金標(biāo)墊處理。裁剪合適大小的玻璃纖維或聚醋膜作為金標(biāo)墊，干燥保存?zhèn)溆谩?biāo)記上抗PPMV-1 F 蛋白單克隆抗體的膠體金溶液噴于玻璃纖維，37 ℃干燥后，轉(zhuǎn)至裝有干燥劑的密封袋，室溫保存。

（3）NC膜處理。用 0.01 M pH 7.4 的PBS將抗PPMV-1 F蛋白的單克隆抗體與羊抗鼠二抗分別稀釋成不同稀釋度。將稀釋好的單抗與二抗分別包被于NC膜上的檢測(cè)線（T線）和質(zhì)控線（C線），晾干，然后置于封閉液中，封閉4 h后陰干，裝在有干燥劑的密封袋，室溫保存。

（4）試紙條組裝。將樣品墊、膠體金標(biāo)記抗PPMV-1 F蛋白單抗的玻璃纖維、包被有抗PPMV-1 F蛋白單抗和羊抗鼠抗體的二抗的NC膜，吸水紙，按順序自上而下粘于雙面膠板上，且以相互重疊約l mm左右。組裝成后，切割成4 mm寬的紙條，轉(zhuǎn)成膠體金免疫層析試紙條。

1.3.3鴿Ⅰ型副粘病毒膠體金層析試紙條靈敏性和特異性試驗(yàn)

（1）靈敏性試驗(yàn)。將3份不同血凝價(jià)的鴿Ⅰ型副粘病毒尿囊液進(jìn)行倍比稀釋后用試紙條檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可以看出，當(dāng)血凝效價(jià)為28樣品稀釋32倍，血凝效價(jià)為27樣品稀釋16倍后，用所制備的試紙條可以檢測(cè)為陽(yáng)性，也就是說(shuō)所研制的試紙條可以檢測(cè)血凝效價(jià)≥23的病毒液。

（2）特異性試驗(yàn)。將雞新城疫、雞傳染性支氣管炎、雞減蛋綜合征、雞馬立克、豬瘟、豬傳染性胃腸炎、羊痘、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等幾種樣品用試紙條進(jìn)行檢測(cè)，只有雞新城疫與鴿Ⅰ型副粘病毒檢測(cè)結(jié)果一樣，都出現(xiàn)兩條紅色條帶，其余樣品只有質(zhì)控線出現(xiàn)紅色條帶，而檢測(cè)線沒(méi)有條帶出現(xiàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明所制備的膠體金檢測(cè)試紙條可與新城疫發(fā)生交叉反應(yīng)，而與上述其他樣品不發(fā)生交叉反應(yīng)，該試紙條的特異性強(qiáng)。

（3）動(dòng)物試驗(yàn)。在發(fā)病后第3天，每天采集棉拭子，并對(duì)死亡情況進(jìn)行記錄，及時(shí)采集病料，在發(fā)病后第5天，對(duì)存活的雞進(jìn)行捕殺，采集病料，把所采集的病料和棉拭子化開(kāi)混勻，進(jìn)行膠體金試紙條的檢測(cè)（圖1），并進(jìn)行病毒的分離，進(jìn)行血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

圖1　試紙條對(duì)臨床樣品的檢測(cè)

由表4可知，應(yīng)用病毒增殖，收集尿囊液進(jìn)行HA、HI試驗(yàn)，結(jié)果與試紙條檢測(cè)棉拭子的符合率為97.5 %，與試紙條檢測(cè)病料的符合率為100 %，試紙條檢測(cè)棉拭子的符合率略低于檢測(cè)病料的符合率，主要與棉拭子含毒量有關(guān)，可能與在棉拭子采集時(shí)沒(méi)有采到有效病料有關(guān)。盡管如此，試紙條檢測(cè)的符合率和病毒分離的符合率也達(dá)到97 %以上，說(shuō)明其特異性是比較強(qiáng)的，可以作為臨床檢測(cè)鴿Ⅰ型副粘病毒和新城疫的方法應(yīng)用。

2　分析與討論

本研究建立的鴿Ⅰ型副粘病毒或新城疫病毒的免疫層析快速檢測(cè)方法靈敏性較強(qiáng)，不與雞傳染性支氣管炎、雞減蛋綜合征、雞馬立克、豬瘟、豬傳染性胃腸炎、羊痘、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等其他樣品發(fā)生交叉反應(yīng)，準(zhǔn)確性高；通過(guò)對(duì)臨床樣品應(yīng)用試驗(yàn)，結(jié)果表明試紙條與HA、HI試驗(yàn)檢測(cè)方法相比，與檢測(cè)棉拭子的符合率為97.5 %，與檢測(cè)病料的符合率為100 %。試紙條檢測(cè)的符合率和病毒分離的符合率達(dá)到97 %以上，說(shuō)明其靈敏性較高，特異性是比較強(qiáng)的，可以作為臨床檢測(cè)鴿Ⅰ型副粘病毒和新城疫的方法應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：（9篇，略）

中圖分類(lèi)號(hào)：S854.4+3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-0769（2016）06-0090-03

基金項(xiàng)目：甘肅省科技計(jì)劃項(xiàng)目（GNKJ-2010-26）。

*作者簡(jiǎn)介：張登基（1979- ），高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事獸醫(yī)新技術(shù)研究與推廣工作。

** 通信作者：高靜（1970- ），高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事獸醫(yī)新技術(shù)研究與推廣工作。