韓　偉，汪佳丹，徐　婷

(華東理工大學(xué) 藥學(xué)院 中藥現(xiàn)代化工程中心，上?！?00237)

?

Folin-Ciocalteu法測(cè)定金針菇多酚的條件優(yōu)化

韓偉，汪佳丹，徐婷

(華東理工大學(xué) 藥學(xué)院 中藥現(xiàn)代化工程中心，上海200237)

摘要：采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定金針菇多酚，在單因素基礎(chǔ)上，利用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，優(yōu)化測(cè)定金針菇多酚含量的條件.結(jié)果表明，利用Folin-Ciocalteu法測(cè)定金針菇多酚含量的最佳條件：添加2 mL的福林酚試劑以及2.4 mL的15% Na2CO3溶液，反應(yīng)時(shí)間為70 min，溫度45 ℃，測(cè)定波長為730 nm.

關(guān)鍵詞：金針菇；多酚；Folin-Ciocalteu法；二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)

金針菇(Flammulinavelutipes)隸屬于真菌界(Eumycophyta)，為菌藻地衣類[1]，其性寒、味咸、滑潤，歸肝、胃、腸三經(jīng)，具有利肝臟、益腸胃、增智慧和抗癌瘤等功效，食用和藥用價(jià)值較高[2].金針菇活性成分的研究多集中于多糖類物質(zhì)，而其所含多酚化合物的相關(guān)報(bào)道較少，因植物多酚是一類強(qiáng)活性的可再生資源，具有抗衰老、抗腫瘤、抗炎、提高免疫力等多種藥理功效[3]，研究開發(fā)金針菇多酚具有一定的理論意義和實(shí)用價(jià)值.

目前，植物多酚的測(cè)定方法主要有高錳酸鉀法、福林酚法(Folin-Ciocalteu method,FC法)、紫外分光光度法、普魯士藍(lán)法、酒石酸亞鐵法、香草醛鹽酸法等[4].因Folin-Ciocalteu法對(duì)儀器設(shè)備要求低，靈敏度及穩(wěn)定性高，操作簡便快速，在植物多酚含量測(cè)定的應(yīng)用上最為普遍，但對(duì)于不同供試品的測(cè)定，F(xiàn)olin-Ciocalteu法的顯色條件會(huì)有所差異[5-6]，即某顯色條件體系對(duì)特定植物供試品顯色靈敏而穩(wěn)定，但運(yùn)用于另一種植物多酚含量測(cè)定時(shí)卻達(dá)不到應(yīng)有的效果，這可能與不同植物所含多酚種類相關(guān)[7].本文考察了Na2CO3溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)和用量、福林酚試劑用量以及顯色溫度和時(shí)間對(duì)金針菇多酚顯色后吸光度值的影響，并采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)對(duì)影響較大的顯色條件進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，以期建立靈敏、穩(wěn)定、準(zhǔn)確且高效的測(cè)定金針菇多酚含量的Folin-Ciocalteu法，旨在為金針菇多酚提取純化等工藝研究和進(jìn)一步的開發(fā)利用提供參考.

1材料與方法

1.1材料與試劑

金針菇(鮮品)購自上海雪榕生物科技股份有限公司，自然陰干至恒重，避光保存?zhèn)溆茫粵]食子酸對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%)，J&K chemical百靈威科技有限公司；福林酚試劑，上海荔達(dá)生物科技有限公司；去離子水，上海華震科技有限公司；95%乙醇(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水碳酸鈉(分析純)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司.

1.2主要儀器與設(shè)備

AL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；ER-692型微波提取裝置，中國電子器件工業(yè)總公司；多功能高速粉碎機(jī)，江西贛云食品機(jī)械有限公司；UV1900PC型紫外-可見分光光度計(jì)，上海亞研電子科技有限公司；RJ-TGL-16C型臺(tái)式高速離心機(jī)，無錫市瑞江分析儀器有限公司.

1.3金針菇多酚供試液的制備

準(zhǔn)確稱取80目金針菇干粉3.0 g于250 mL三口燒瓶中，加入50 mL70%乙醇溶液，輕搖至藥材浸潤，置于微波提取裝置間歇提取3 min，于冷水浴中冷卻后減壓抽濾，相應(yīng)溶劑定容于50 mL棕色容量瓶中，搖勻，6000 r/min離心8 min，即得金針菇多酚供試液.

1.4Folin-Ciocalteu法測(cè)定流程

精密移取適量供試液于25 mL棕色容量品中，依次加入2.0 mL去離子水和一定體積福林酚試劑，靜置3 min后再加入Na2CO3溶液，迅速用去離子水定容至刻度，混勻后水浴靜置一段時(shí)間，以去離子水作空白參比，在檢測(cè)波長處測(cè)定并記錄吸光度值，平行測(cè)定3次[8].

1.5檢測(cè)波長的確定

分別移取適量對(duì)照品溶液和供試品溶液于25 mL棕色容量瓶中，按照1.4中測(cè)定方法依次加入試劑進(jìn)行顯色，用紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行全波長掃描；同樣條件下取適量對(duì)照品溶液和供試品溶液不加顯色劑進(jìn)行全波長掃描，記錄掃描數(shù)據(jù).

1.6條件優(yōu)化試驗(yàn)

1.6.1單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別單獨(dú)考察Na2CO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)(2%，3.5%，5%，7.5%，10%，12.5%，15%，17.5%，20%)、Na2CO3溶液用量(0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL)、福林酚試劑用量(0.2，0.5，0.8，1.1，1.4、1.7，2.0，2.3 mL)、顯色溫度(25，35，45，55，65 ℃)和顯色時(shí)間(15，30，45，60，75，90，105，120，135，150 min)對(duì)金針菇多酚顯色后吸光度值的影響.單因素試驗(yàn)條件如表1所示.

表1　單因素試驗(yàn)條件

1.6.2二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以福林酚試劑用量(X1)、15%Na2CO3溶液用量(X2)以及顯色時(shí)間(X3)三個(gè)影響較大的因素進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)并確定相應(yīng)零水平值.以吸光度值(Y)作為響應(yīng)值，采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)顯色條件進(jìn)行優(yōu)化.試驗(yàn)相關(guān)參數(shù)[9]：自變量p=3；二水平正交試驗(yàn)點(diǎn)mc=23=8；組合的星號(hào)臂值γ=2p/4=1.681 79且星號(hào)點(diǎn)試驗(yàn)共2p=6；由二次正交組合設(shè)計(jì)參數(shù)表查得，中心試驗(yàn)點(diǎn)m0=9，總試驗(yàn)數(shù)N=mc+2p+m0=23組.試驗(yàn)因素水平值及編碼見表2.

表2　三元二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)因素水平編碼表

2結(jié)果與分析

2.1最佳檢測(cè)波長

比較對(duì)照品溶液與供試品溶液顯色及不顯色紫外可見光譜圖(如圖1)，可以看出金針菇多酚在顯色與未顯色情況下，均與沒食子酸對(duì)照品溶液相同處理后的全波長掃描光譜圖相一致.在顯色反應(yīng)后，供試液和對(duì)照品溶液在可見光區(qū)有一較為平緩的吸收峰，在730 nm處吸光度值最強(qiáng)，相比下未加顯色劑的供試液及對(duì)照品溶液在可見光區(qū)不存在吸收，因此其他非目標(biāo)組分在可見光區(qū)對(duì)多酚含量測(cè)定的干擾性小，選擇730 nm作為Folin-Ciocalteu法的最佳檢測(cè)波長.

2.2Folin-Ciocalteu法條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1單因素試驗(yàn)

1)Na2CO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)

測(cè)定中，多酚要被福林酚試劑氧化，需在弱堿性條件下解離成酚鹽離子，當(dāng)顯色體系pH值與酚類pKa值相近時(shí)，多酚離子化程度大，反應(yīng)迅速且完全[10]，Na2CO3被用于調(diào)節(jié)比色體系的酸堿環(huán)境，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)Na2CO3溶液的顯色效果也不一.由圖2及實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象可知，Na2CO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于5%時(shí)，顯色液呈草綠色，顯色效果不佳，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過5%時(shí)，顯色液呈深藍(lán)色，吸光度值緩慢增大，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時(shí)吸光度值達(dá)到最大值，后呈下降趨勢(shì)，考慮到高質(zhì)量分?jǐn)?shù)Na2CO3溶液易析出晶體從而影響分析，選擇Na2CO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%.

2)Na2CO3溶液用量

圖3為Na2CO3溶液用量對(duì)金針菇多酚顯色后吸光度值的影響.由圖可見：隨著碳酸鈉溶液用量的增加，吸光度呈先增大后降低趨勢(shì)，當(dāng)用量達(dá)到2 mL時(shí)吸光度值(0.4679)最大，說明顯色反應(yīng)比較完全；用量超過2 mL，堿性過強(qiáng)影響反應(yīng)，吸光度值下降.綜上，15%Na2CO3溶液用量選為2 mL.

圖2　Na2CO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)金針菇多酚顯色后吸光度值的影響

圖3　Na2CO3溶液用量對(duì)金針菇多酚顯色后吸光度值的影響

3)福林酚試劑用量

福林酚試劑作為顯色劑，其用量對(duì)顯色效果影響較大，如圖4所示.隨福林酚試劑用量增加，金針菇多酚顯色后吸光度值呈先上升后降低趨勢(shì).當(dāng)福林酚試劑用量為1.7 mL時(shí)，顯色效果最好，再增加福林酚試劑用量，吸光度值下降，這可能是由于過大加入量使顯色反應(yīng)體系不穩(wěn)定所造成的.因此，福林酚試劑用量選擇為1.7 mL.

圖4　福林酚試劑用量對(duì)金針菇多酚顯色后吸光度值的影響

4)顯色溫度和時(shí)間

在一定溫度下，供試液顯色完全需一定時(shí)間，而升高溫度可加速反應(yīng)，促進(jìn)特異性有色物質(zhì)生成，且溫度越高，達(dá)到最大吸光度值的時(shí)間越短.但溫度過高將導(dǎo)致多酚類物質(zhì)或顯色生成物被破壞；而溫度過低顯色反應(yīng)進(jìn)行緩慢且顯色不充分，均影響測(cè)定結(jié)果[11].

圖5為溫度和時(shí)間對(duì)多酚顯色后吸光度值的影響結(jié)果，分析圖5可知，溫度低時(shí)顯色緩慢，相同顯色時(shí)間下吸光度值較?。粶囟容^高時(shí)，顯色迅速，但吸光度值隨時(shí)間降低也較快，表明顯色體系在高溫下穩(wěn)定性差.在25 ℃和35 ℃下，吸光度值隨時(shí)間呈上升趨勢(shì)，但在測(cè)定的150 min內(nèi)還未達(dá)到最大吸光度值；在55 ℃和65 ℃下，約顯色30 min，吸光度值即可達(dá)到最大，但其隨時(shí)間降低的趨勢(shì)也顯著；45 ℃條件下的顯色曲線最符合測(cè)定要求，反應(yīng)進(jìn)行到105 min時(shí)，吸光度值已趨于平穩(wěn)，且在隨后測(cè)定的45 min內(nèi)保持穩(wěn)定.

圖5　溫度和時(shí)間對(duì)多酚顯色后吸光度值的影響

2.2.2二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)結(jié)果

1)試驗(yàn)方案及數(shù)據(jù)結(jié)果

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)顯色影響較大的因素——福林酚試劑用量(X1)、15%Na2CO3溶液用量(X2)及顯色時(shí)間(X3)，采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)對(duì)條件參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)方案及數(shù)據(jù)結(jié)果見表3.

表3　三元二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)方案及結(jié)果分析

優(yōu)化設(shè)計(jì)共有23個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中，1～8號(hào)為兩水平正交試驗(yàn)，9～14號(hào)為星號(hào)點(diǎn)處試驗(yàn)，中心點(diǎn)試驗(yàn)為15～23號(hào)，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差.

2)模型建立與方差分析

表4　回歸模型方差分析

3)模型各項(xiàng)顯著性檢驗(yàn)

表5顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，一次項(xiàng)中Na2CO3溶液用量對(duì)模型影響極顯著(P<0.01)，顯色時(shí)間影響顯著(P<0.05)，說明這兩者為顯色測(cè)定中的關(guān)鍵因素；福林酚試劑用量和Na2CO3溶液用量的交互項(xiàng)影響極顯著(P<0.01)，Na2CO3溶液用量和顯色時(shí)間交互項(xiàng)影響顯著(P<0.05)，表明顯色各因素間存在交互作用影響，不呈簡單線性關(guān)系.通過比較模型一次項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小來判斷3個(gè)因素對(duì)金針菇多酚顯色效果影響的主次性順序?yàn)椋篘a2CO3溶液用量>顯色時(shí)間>福林酚試劑用量.

表5　回歸模型各項(xiàng)顯著性檢驗(yàn)

4)單因子效應(yīng)分析

由于二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)滿足正交設(shè)計(jì)要求，模型中各效應(yīng)項(xiàng)可線性相加，偏回歸系數(shù)彼此獨(dú)立，可采用“降維法”進(jìn)行分析[12]，即將回歸方程中任意兩因素固定于零水平，得到另一因素對(duì)吸光度值影響的關(guān)系曲線，如圖6所示.圖中，曲率幅度直觀表現(xiàn)了各因素對(duì)多酚顯色效果的影響程度，吸光度值隨Na2CO3溶液用量的變化幅度最大，影響最顯著，其次為顯色時(shí)間，這與模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果相一致.

圖6　單因子效應(yīng)分析圖

5)雙因子交互作用分析

固定回歸模型任一變量于零水平，由SAS 9.0軟件處理另兩變量間交互作用關(guān)系得等高線圖及響應(yīng)面圖，如圖7～9所示.等高線圖及響應(yīng)面圖可直觀反映兩因素間交互作用的顯著程度，等高線圖中橢圓越扁平，兩因素間的交互作用越顯著，而在響應(yīng)面圖中，單一因素軸向的曲面越陡峭，曲率半徑越大，則這一因素對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著，并且在因素不同水平值下，另一因素的響應(yīng)值變化程度的不同表明兩者間交互作用顯著.

在圖7和圖9中，X1X2和X2X3的等高線圖呈扁平橢圓形，響應(yīng)面圖中，兩兩因素間在不同水平值下，響應(yīng)值的變化程度不同，如X1X2響應(yīng)曲面圖中，當(dāng)X1處于低水平時(shí)，響應(yīng)值隨X2的增大呈先增大后減小趨勢(shì)，而X1處于高水平時(shí)，響應(yīng)值隨X2顯著升高后呈小幅下降，這些變化均說明X1和X2以及X2和X3間的交互作用顯著，而X1X3等高線圖近乎圓形，表明交互作用不顯著.

圖7　福林酚試劑用量(X1)與Na2CO3溶液用量(X2)的交互作用

圖8　福林酚試劑用量(X1)與顯色時(shí)間(X3)的交互作用

圖9　Na2CO3溶液用量(X2)與顯色時(shí)間(X3)的交互作用

根據(jù)響應(yīng)面圖中因素軸向曲面的陡峭程度進(jìn)行判斷可知，3個(gè)因素對(duì)顯色效果的影響由大到小依次為：Na2CO3溶液用量>顯色時(shí)間>福林酚試劑用量.模型直觀分析結(jié)果與顯著性檢驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步說明了各因素間的交互作用關(guān)系.

6)最佳顯色條件的確定及驗(yàn)證

利用SAS 9.0軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行典型分析模擬尋優(yōu)，得到最佳顯色條件理論值，即經(jīng)典型分析后得到一個(gè)穩(wěn)定點(diǎn)以及最大臨界響應(yīng)值，如表6所示.

表6　回歸模型典型分析

根據(jù)理論顯色條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，考慮到實(shí)際可操作性，將驗(yàn)證顯色參數(shù)微調(diào)為：福林酚試劑用量2 mL，15% Na2CO3溶液用量2.4 mL，時(shí)間70 min，驗(yàn)證所得吸光度值為0.6564±0.0059(n=3)，比表5中的最大理論值低1%，重復(fù)試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2%，說明實(shí)際值與理論值相接近，該模型可較好模擬顯色條件對(duì)金針菇多酚顯色效果的影響，優(yōu)化結(jié)果可用于實(shí)際含量測(cè)定.

3結(jié)語

1)經(jīng)二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)對(duì)金針菇多酚顯色條件進(jìn)行優(yōu)化，所得方差分析結(jié)果表明：模型擬合極顯著(P<0.0001)，失擬項(xiàng)影響不顯著(P>0.05)，說明所得回歸模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果擬合度高，能代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析.由模型各項(xiàng)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果結(jié)合單、雙因子效應(yīng)分析圖譜可知，各因素對(duì)顯色效果影響的主次性順序?yàn)椋篘a2CO3溶液用量>顯色時(shí)間>福林酚試劑用量，并且因素間存在一定交互作用，不呈簡單線性關(guān)系.

2)由SAS 9.0軟件對(duì)模型進(jìn)行典型分析并經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證后得到最佳顯色參數(shù)為：福林酚試劑用量2 mL，Na2CO3溶液用量2.4 mL，時(shí)間70 min.在此條件下金針菇多酚顯色后吸光度值最大，可達(dá)0.6564±0.0059(n=3)，以此提高測(cè)定靈敏度.

參考文獻(xiàn)：

[1] 吳興亮,卯曉嵐,圖力古爾,等.中國藥用真菌[M].北京:科學(xué)出版社,2013:1-10,306.

[2] 楊瑞長,劉康乾.食用菌保健功能與食療方[M].北京:金盾出版社,2000:4-17,124.

[3] 姚瑞祺.植物多酚的分類及生物活性的研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊),2011(4):99-100.

[4] 石碧,狄瑩.植物多酚[M].北京:科學(xué)出版社,2000.

[5] 李寶偉,孫曉華.淺析金針菇價(jià)值與培育[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù),2014(6):146.

[6] 張梅梅,魏志文,劉玉冰,等.Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定樺褐孔菌多酚的條件優(yōu)化[J].菌物學(xué)報(bào),2011,30(2):295-304.

[7] 向莉,王琪,徐遠(yuǎn)陽,等.Folin-Ciocalteu法測(cè)定黑粒小麥麩皮中多酚含量的研究[J].糧食與飼料工業(yè),2012(1):57-60.

[8] SINGLETON V L,OTTHOFER R,LAMUELA-RAVENTOS R M.Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent[J].Methods in Enzymology,1999,229(14):152-178.

[9] 上海師范大學(xué)數(shù)學(xué)系概率統(tǒng)計(jì)教研組.回歸分析及其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[M].上海:上海教育出版社,1978.

[10] 徐國前,欒麗英,焦旭亮,等.測(cè)定葡萄與葡萄酒總酚的二次回歸正交旋轉(zhuǎn)優(yōu)化設(shè)計(jì)[J].果樹學(xué)報(bào),2011,28(3):531-535.

[11] 張梅梅,魏志文,劉玉冰,等.Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定樺褐孔菌多酚的條件優(yōu)化[J].菌物學(xué)報(bào),2011,30(2):295-304.

[12] 徐靜,張井,李燕,等.二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)在鳀魚蒸煮液酶解工藝中的應(yīng)用研究[J].食品科學(xué),2009,30(22):221-225.

(編輯崔思榮)

Optimization on Determination Conditions of Polyphenol in

FlammulinVelutipesby Folin-Ciocalteu Method

HAN Wei,WANG Jiadan,XU Ting

(Engineering Center for Traditional Chinese Medicine Modernization,School of pharmacy, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)

Abstract:The total polyphenol in Flammulina velutipes was determined by Folin-Ciocalteu method,and the stuitable chromogenic conditions for determination were optmized by quadratic orthogonal rotation combination design which was based on the single-factor experiments.Results showed that the optimum chromogenic conditions were as follows:2 mL Folin phenol reagent,2.4 mL 15% Na2CO3 at 45 ℃ for 70 min,and the detection wavelength was 730 nm.

Key words:Flammulina velutipes; total polyphenol; Folin-Ciocalteu method; quadratic orthogonal rotation combination design

收稿日期：2016-03-20

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20006003);上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目[滬農(nóng)科攻字(2012)第2-9號(hào)]

作者簡介：韓偉(1968-)，男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物的提取、分離及功能研究.

中圖分類號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674-358X(2016)02-0026-09