齊耀程，鄒 禹，許大鳳，高正良

(1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，安徽合肥 230031;2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，安徽合肥 230031;3.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技產(chǎn)業(yè)處，安徽合肥 230031)

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三生煙葉片與煙花的原生質(zhì)體制備研究

齊耀程1，鄒 禹2，許大鳳1，高正良3*

(1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，安徽合肥 230031;2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，安徽合肥 230031;3.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技產(chǎn)業(yè)處，安徽合肥 230031)

摘要[目的]探討三生煙葉片及煙花的高質(zhì)量原生質(zhì)體制備方法。[方法]通過優(yōu)化纖維素酶和離析酶濃度配比、酶解時(shí)間、滲透調(diào)節(jié)劑甘露醇濃度等參數(shù)，研究三生煙葉片與煙花原生質(zhì)體的最優(yōu)制備方法。[結(jié)果]三生煙煙葉材料最佳制備條件為1%纖維素酶和0.5%離析酶、甘露醇濃度0.6 mol/L、酶解時(shí)間4 h，完整率達(dá)88.22%。煙花材料最佳制備條件為0.8%纖維素酶和0.4%離析酶、甘露醇濃度0.7 mol/L、酶解時(shí)間2 h，完整率達(dá)83.59%。 [結(jié)論]三生煙葉片與煙花原生質(zhì)體由于材料來源不同，酶解條件存在差異，制備時(shí)需要針對(duì)不同組織材料予以優(yōu)化。

關(guān)鍵詞煙葉；煙花；原生質(zhì)體；分離純化；完整率

植物原生質(zhì)體是由脫去細(xì)胞壁，僅由質(zhì)膜包圍的，具有生活力的裸露細(xì)胞。植物原生質(zhì)體應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，涉及基因表達(dá)調(diào)控與定位、與宿主蛋白質(zhì)相互作用、細(xì)胞融合[1-5]，以及克服有性雜交不親和性、花期不育[6-8]等領(lǐng)域的研究。原生質(zhì)體可在細(xì)胞水平上進(jìn)行基因重組，特別是細(xì)胞器，內(nèi)含基因控制的農(nóng)藝性狀改良，如線粒體所控制的細(xì)胞質(zhì)雄性不育等性狀。目標(biāo)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位是通過目標(biāo)基因載體和熒光表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化，在特定種類的原生質(zhì)體中得以表達(dá)[9]。在信號(hào)通路研究中，原生質(zhì)體表面膜系統(tǒng)的信號(hào)受體蛋白是信號(hào)受體研究材料[10]，可有效避免細(xì)胞性狀差異導(dǎo)致的研究障礙。原生質(zhì)體由于純度高、細(xì)胞狀態(tài)相近，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中可極大程度地解決細(xì)胞蛋白質(zhì)響應(yīng)差異問題，提高低豐度蛋白質(zhì)的提取純化效率等問題。

煙草研究中通常以煙葉為材料，極少涉及其他組織。以煙葉為材料制備原生質(zhì)體對(duì)煙草生長(zhǎng)期要求嚴(yán)格，取材后嚴(yán)重影響煙草幼苗的生長(zhǎng)，而煙花具備花期長(zhǎng)、生物產(chǎn)量相對(duì)較高、生育進(jìn)程容易控制、生理狀態(tài)差異小等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，三生煙也是研究煙草花葉病毒病的重要材料[11]，可以在細(xì)胞水平研究其抗性機(jī)理，因此，高質(zhì)量的原生質(zhì)體是多領(lǐng)域深入研究的基礎(chǔ)。鑒于此，筆者研究了三生煙葉片及煙花的高質(zhì)量原生質(zhì)體制備方法，旨在為煙草病理研究提供技術(shù)手段。

1材料與方法

1．1材料

1.1.1供試品種。煙草品種三生煙(NicotianatabacumL., cv.Samsun NN)種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。原生質(zhì)體的提取是以三生煙的四葉期葉片和盛花期煙花為試驗(yàn)材料。

1.1.2試劑。纖維素酶(Cellulase R-10)、離析酶(Macerozyme R-10)均為日本Yakult原裝進(jìn)口，甘露醇、MES( 2-N-嗎啉乙烷磺酸)、臺(tái)盼藍(lán)。

1.2方法

1.2.1材料的培養(yǎng)。將三生煙種子在75%乙醇中浸泡30 s，在 10%雙氧水中消毒 10 min，用無菌水沖洗2～3次。搓揉去除種子的表面蠟質(zhì)成分，培養(yǎng)皿中25 ℃催芽2～3 d，移植至9孔板培養(yǎng)容器的培養(yǎng)基質(zhì)中，每個(gè)小孔放置2～3顆已發(fā)芽種子，十字期移栽進(jìn)入花盆。培養(yǎng)箱中晝夜溫度分別為28和20 ℃，培養(yǎng)至四葉期，取用幼嫩葉片制備原生質(zhì)體，進(jìn)入花期后以煙花為材料制備原生質(zhì)體。

1.2.2原生質(zhì)體的分離。煙葉取材四葉期葉片，煙花為盛開期[12](開花3 d，花冠開裂成平面)煙花。在超凈工作臺(tái)上將取植物材料剪碎為1 mm×1 mm碎片，置于10 mL 酶解液中，酶解液為CPW鹽溶液 (KH2PO427.200 mg/L、KNO3101.000 mg/L、CaCl2·2H2O 1 480.000 mg/L、MgSO4·7H2O 246.000 mg/L、KI 0.160 mg/L、CuSO4·5H2O 0.025 mg/L),包含Cellulase R-10、Macerozyme R-10、滲透調(diào)節(jié)劑甘露醇0.6 mol/L、質(zhì)膜穩(wěn)定劑MES 濃度為5 mmol/L[13]，pH 5.8。材料碎片與酶解液充分接觸混勻，真空泵抽氣30 min，封口后置于26 ℃氣浴恒溫振蕩器內(nèi)40 r/min回旋振蕩，避光酶解。

1.2.3酶濃度及酶解時(shí)間的優(yōu)化。前期研究顯示纖維素酶和離析酶的最適質(zhì)量比為2∶1[14]，由于幼嫩葉片和煙花的纖維素含量較低，所以設(shè)置葉片的酶濃度梯度為1.50%/0.75%、1.00%/0.50%、0.50%/0.25%，煙花的酶濃度梯度分別為1.60%/0.80%、1.20%/0.60%、0.80%/0.40%，酶解體系均為10 mL。電子顯微鏡下觀察原生質(zhì)體酶解情況。酶解煙葉每2 h觀察一次酶解效果，設(shè)置時(shí)間2、4、6和8 h;酶解煙花每1 h觀察一次酶解效果,設(shè)置時(shí)間1、2、3和4 h。

1.2.4滲透壓穩(wěn)定劑甘露醇的濃度優(yōu)化。2種材料在最佳酶濃度及酶解基礎(chǔ)上，設(shè)置甘露醇濃度梯度為0.5、0.6、0.7和0.8 mol/L。原生質(zhì)體洗滌液中使用含有同濃度的甘露醇洗滌溶液，純化后觀察記錄原生質(zhì)體的產(chǎn)率和完整率。

1.2.5原生質(zhì)體的純化。2種原生質(zhì)體均用 300 目不銹鋼細(xì)胞篩過濾，濾液經(jīng) 700 r/min離心 5 min，去掉上清液，加 CPW洗滌液5 mL,700 r/min離心 5 min，洗去酶液，棄上清液，預(yù)留2 mL 原生質(zhì)體懸液緩慢覆蓋在 5 mL 20%蔗糖溶液上表面，500 r/min離心 5 min，吸取中間層原生質(zhì)體轉(zhuǎn)入干凈離心管，用洗滌緩沖液輕輕洗滌2次，用刻度離心管稀釋到1 mL。

用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)純化后細(xì)胞膜完整的原生質(zhì)體數(shù)量，計(jì)算同一計(jì)數(shù)板上、下2個(gè)計(jì)數(shù)室所測(cè)定的原生質(zhì)體平均值。利用臺(tái)盼藍(lán)染色可將死細(xì)胞染成藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染的性質(zhì)，用0.4%臺(tái)盼藍(lán)對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行活體染色。原生質(zhì)體完整率=未染成藍(lán)色的完整原生質(zhì)體數(shù)/原生質(zhì)體總數(shù) ×100%。3 次重復(fù)取平均值，每次重復(fù)統(tǒng)計(jì)5個(gè)視野。

2結(jié)果與分析

2.1原生質(zhì)體分離及完整性鑒定三生煙葉片原生質(zhì)體產(chǎn)量和完整性指標(biāo)在3個(gè)酶解液組合中表現(xiàn)趨勢(shì)基本相同。隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，完整原生質(zhì)體數(shù)量逐漸增大后降低。由表1、圖1～2可知，E1在酶解 4 h 時(shí)原生質(zhì)體的產(chǎn)量達(dá)到最大值，葉片細(xì)胞碎片趨于完全脫離，原生質(zhì)體完整率為80.59%，隨后2個(gè)指標(biāo)下降且趨勢(shì)相同。E2在反應(yīng)4 h時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，為2.09×106c/g，完整率達(dá)88.22%，6 h則原生質(zhì)體產(chǎn)量稍有下降，完整性下降但幅度變化較緩。E3酶解產(chǎn)量于6 h時(shí)最高，完整率下降明顯，也不適合后續(xù)復(fù)雜研究要求。因此，3種組合以E2綜合指標(biāo)較好，酶解時(shí)間以 4 h為宜。

表1　三生煙葉片不同濃度酶解液組合的酶解效率比較

注： c/g表示細(xì)胞數(shù)/克鮮重。

Note：c/g indicated cell count/fresh weight per gram.

注：a～d分別為三生煙葉片酶解2、4、6和8 h的原生質(zhì)體。Note：a-d were protoplasts of N.tabacum leaves after enzymolysis for 2, 4, 6 and 8 h, respectively.圖1　三生煙葉片最適制備條件的原生質(zhì)體形態(tài)Fig.1　Protoplast morphology of the optimum preparation conditions for N.tabacum leaf

注：a～d分別為三生煙葉片酶解2、4、6和8 h的臺(tái)盼藍(lán)染色原生質(zhì)體。Note：a-d were protoplasts of N.tabacum leaves stained by trypan blue after enzymolysis for 2, 4, 6 and 8 h, respectively.圖2　三生煙葉片原生質(zhì)體完整性變化Fig.2　Integrity change of protoplasts of N.tabacum leaves

注：a～d分別為1、2、3和4 h的煙花原生質(zhì)體。Note：a-d were protoplasts of N.tabacum petal after enzymolysis for 1, 2, 3 and 4 h, respectively.圖3　三生煙煙花最適制備條件的原生質(zhì)體形態(tài)Fig.3　Protoplast morphology of the optimum preparation conditions for N.tabacum petal

注：a～d分別為1、2、3和4 h臺(tái)盼藍(lán)染色原生質(zhì)體。Note：a-d were protoplasts of N.tabacum petals stained by trypan blue after enzymolysis for 1, 2, 3 and 4 h, respectively.圖4　三生煙煙花原生質(zhì)體完整性變化Fig.4　Integrity change of protoplasts of N.tabacum petal

三生煙煙花的酶解組合顯示(表2、圖3～4)，E1和E2酶液組合呈現(xiàn)相似的趨勢(shì)，酶解反應(yīng)2 h左右，原生質(zhì)體產(chǎn)量和完整率指標(biāo)增長(zhǎng)到頂峰，隨后下降，在4 h表現(xiàn)出較大的衰退幅度。高酶濃度的組合E1酶解效率一直較高，但原生質(zhì)體完整率低。低濃度酶組合E3的酶解效率低，完整率指標(biāo)前期較高，后期有降低趨勢(shì)，但下降幅度較緩。E2酶組合在酶解2～3 h時(shí)煙花原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高(2.0×106c/g)，煙花碎片解離基本完畢，除少數(shù)原生質(zhì)體含紅色素之外，其余細(xì)胞均為透明原生質(zhì)球，2 h的完整率最高達(dá)83.59%，形態(tài)最完整，隨著酶解時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，原生質(zhì)體產(chǎn)量平緩下降，產(chǎn)生原生質(zhì)體的質(zhì)量穩(wěn)定，所以指標(biāo)表現(xiàn)最適宜。

2.2不同材料原生質(zhì)體分離滲透壓條件優(yōu)化在已知最適酶解條件下篩選三生煙葉片最適滲透壓參數(shù)。由表3可知，甘露醇在不同濃度下對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量和完整率有一定影響，煙葉原生質(zhì)體在0.5 mol/L甘露醇濃度下產(chǎn)量和完整率最低，可能是由于0.5 mol/L甘露醇滲透壓過低導(dǎo)致原生質(zhì)體產(chǎn)量較低，部分原生質(zhì)體發(fā)生破裂，形成碎片或死細(xì)胞，使完整率僅為77.94%。甘露醇濃度在0.6～0.8 mol/L時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量和完整率較好。0.6 mol/L甘露醇的原生質(zhì)體產(chǎn)量略低于0.7 mol/L甘露醇條件，但完整率高達(dá)87.04%。0.8 mol/L甘露醇濃度下原生質(zhì)體產(chǎn)量和完整率都低于0.6～0.7 mol/L濃度下，而且原生質(zhì)體存在一定比例的皺縮，表明已經(jīng)超過了適宜的滲透濃度。因此，三生煙的原生質(zhì)體的適宜滲透壓水平對(duì)應(yīng)的甘露醇濃度應(yīng)為0.6～0.7 mol/L，過高與過低濃度均造成原生質(zhì)體產(chǎn)率低下，綜合考慮以0.6 mol/L最佳。

經(jīng)滲透壓濃度篩選顯示，煙花材料的原生質(zhì)體在0.5 mol/L甘露醇濃度時(shí)產(chǎn)生的原生質(zhì)體量少且完整率低(僅為76.36%)。隨甘露醇濃度提高，原生質(zhì)體的產(chǎn)量得以提升，0.7 mol/L甘露醇的產(chǎn)量為2.26×106c/g，完整率為85.64%。甘露醇濃度為0.6 mol/L時(shí)原生質(zhì)體的產(chǎn)量稍低，而甘露醇濃度為0.8 mol/L時(shí)原生質(zhì)體的完整率稍低，總體差異不大。0.7 mol/L甘露醇處理的原生質(zhì)體的產(chǎn)量和完整率均較高，優(yōu)勢(shì)明顯。因此，煙花材料制備的原生質(zhì)體適宜的甘露醇濃度為0.7 mol/L。

3結(jié)論與討論

3.1煙草不同組織的原生質(zhì)體純化條件差異制備原生質(zhì)體的基本要求是原生質(zhì)體產(chǎn)量高、完整性好、活力水平高。使用酶解法制備原生質(zhì)體需要保證適宜的酶解條件，滿足2或2種以上酶的最適酶解條件，包括底物濃度、反應(yīng)溫度、酶解液pH等。由于植物材料的細(xì)胞壁主要成分是纖維素和果膠，所以一般選用纖維素酶、離析酶、果膠酶等。酶解條件為避光環(huán)境，酶解溫度 26～28 ℃，恒溫?fù)u床轉(zhuǎn)數(shù)為40 r/min左右，酶解時(shí)間不宜過長(zhǎng)，根據(jù)材料特異性需要優(yōu)化酶解時(shí)間和酶濃度組合。

注： c/g表示細(xì)胞數(shù)/克鮮重。

Note：c/g indicated cell count/fresh weight per gram.

表3　三生煙不同材料來源原生質(zhì)體滲透壓條件優(yōu)化

注： c/g表示細(xì)胞數(shù)/克鮮重。

Note：c/g indicated cell count/fresh weight per gram.

該研究顯示，以三生煙煙葉為材料，不同酶組合濃度處理煙葉原生質(zhì)體產(chǎn)率差異顯著。隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，煙葉原生質(zhì)體在3種酶濃度下趨勢(shì)基本一致，酶解時(shí)間不能超過4 h，超過6 h原生質(zhì)體的產(chǎn)量及完整率都明顯下降，且趨勢(shì)明顯，幅度很大。高酶濃度組合雖然在2 h就獲得較高的原生質(zhì)體產(chǎn)率，但是其原生質(zhì)體的完整率起點(diǎn)偏低，中濃度酶組合在4～6 h都能獲得較高的原生質(zhì)體產(chǎn)量。低濃度酶組合在酶解過程中起點(diǎn)低，獲得原生質(zhì)體少，原生質(zhì)體間碰撞少、融合作用小，所以獲得較好的完整性，但不適合大量制備。在酶解葉片過程中，可選擇中濃度的酶液組合纖維素酶與離析酶為1.00%/0.50%，在4 h左右為酶解終點(diǎn)，可迅速進(jìn)入純化階段，獲得高質(zhì)量的原生質(zhì)體。

煙花單位質(zhì)量的原生質(zhì)體產(chǎn)量低于葉片，但煙花酶解速度較葉片快。原生質(zhì)體產(chǎn)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，在2 h時(shí)3種酶濃度組合的原生質(zhì)體都基本達(dá)到各自產(chǎn)量最高峰。0.80%/0.40%酶液組合多指標(biāo)顯示其綜合性能較好，酶解時(shí)間在2～3 h差異不顯著，原生質(zhì)體完整率下降較平緩。經(jīng)過4 h的處理，低濃度酶組合在4 h原生質(zhì)體完整率僅達(dá)71.4%，長(zhǎng)時(shí)間酶液處理的酶解產(chǎn)物對(duì)原生質(zhì)體確實(shí)有毒害作用，可能使其質(zhì)膜損傷，造成原生質(zhì)體的破裂。煙葉和煙花的適宜酶解條件差異也表明，由于材料的性質(zhì)差異，不同組織間原生質(zhì)體酶解條件最適指標(biāo)也存在差異。煙花含纖維素較低，在酶液選擇上纖維素酶的使用量較少，離析酶相應(yīng)可作調(diào)整。酶解時(shí)間也顯示出煙花的酶解效率比煙葉高，但單位質(zhì)量的產(chǎn)量低于煙葉，所以在大規(guī)模純化煙花原生質(zhì)體時(shí)，還需要增加煙花材料的鮮重。

3.2煙花原生質(zhì)體利用價(jià)值及意義原生質(zhì)體的分離純化是繁瑣且細(xì)致的工作，不同的研究材料和研究目的都是優(yōu)化純化條件的前提。煙草是常見的模式生物，煙葉的應(yīng)用研究以推廣品種為主，如云煙87、K326、紅花大金元以及香料煙品種等[15-17]，而基礎(chǔ)研究一般根據(jù)研究目的而選用特殊品種，如本氏煙(Nicotianabenthamiana)、心葉煙(Nicotianaglutinosa)、三生煙等。三生煙是研究煙草病理的優(yōu)良材料，煙葉感染不同亞種病毒時(shí)，產(chǎn)生的病征也不相同[18]，而在不同的生理病理?xiàng)l件下，不同的組織細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)應(yīng)答反應(yīng)差異明顯。在深入研究煙草病害的應(yīng)答機(jī)制，豐富煙草蛋白質(zhì)逆境響應(yīng)等基礎(chǔ)理論時(shí)，不能僅僅局限于對(duì)煙葉的研究。煙花作為煙草生長(zhǎng)后期重要的組織器官，對(duì)環(huán)境應(yīng)答敏感，蛋白質(zhì)表達(dá)譜的表現(xiàn)也不盡相同，可能蘊(yùn)含對(duì)環(huán)境等因素的應(yīng)答的特殊機(jī)制，所以也必須作為植物逆境響應(yīng)研究的重要材料。

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基金項(xiàng)目安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長(zhǎng)青年基金項(xiàng)目(13B0941)；安徽省煙草公司科研項(xiàng)目(20120551008);公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203091)。

作者簡(jiǎn)介齊耀程(1983- )，男，安徽滁州人，助理研究員，博士，從事煙草栽培生理生化研究。*通訊作者，研究員，從事煙草和玉米病蟲害研究。

收稿日期2016-04-08

中圖分類號(hào)S 572

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)14-011-04

Preparation of Protoplast of Leaf and Petal ofNicotianatabacumL., cv.Samsun NN

QI Yao-cheng1, ZOU Yu2, XU Da-feng1, GAO Zheng-liang3*

(1.Tobacco Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei, Anhui 230031; 2.Rice Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei, Anhui 230031; 3.Department of Science and Technology Industry, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei, Anhui 230031)

Abstract[Objective] To discuss the preparation method of protoplast of leaf and petal of Nicotiana tabacum L., cv.Samsun NN.[Method] Several parameters were optimized, such as cellulase concentration, macerozyme concentration, enzymatic hydrolysis time and mannitol concentration.The optimal preparation method of N.tabacum leaf and petal was researched.[Result] The optimal preparation condition for N.tabacum leaf was 1% cellulose, 0.5% macerozyme, 0.6 mol/L mannitol concentration, and 4 h enzymatic hydrolysis time.Under this condition, the integrity rate was 88.22%.The optimal preparation condition for N.tabacum petal was 0.8% cellulose, 0.4% macerozyme, 0.7 mol/L mannitol concentration, and 2 h enzymatic hydrolysis time.Under this condition, the integrity rate was 83.59%.[Conclusion] Due to the different sources of N.tabacum leaf and petal, there are certain differences in enzymatic hydrolysis condition.Enzymatic hydrolysis condition should be optimized according to the tissue materials.

Key wordsTobacco leaf; N.tabacum petal; Protoplast; Isolation and purification; Integrity