楊 陽，劉光澤，李秀梅，孔祥平，顧為望

（1.南方醫(yī)科大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究所暨實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣州 510515；2.解放軍第458醫(yī)院全軍肝病中心，廣州 510602）

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HBV轉(zhuǎn)基因小鼠尿液中乙肝病毒相關(guān)指標(biāo)的分析

楊 陽1，2，劉光澤2，李秀梅2，孔祥平2，顧為望1

（1.南方醫(yī)科大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究所暨實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣州 510515；2.解放軍第458醫(yī)院全軍肝病中心，廣州 510602）

【摘要】目的 檢測分析HBV轉(zhuǎn)基因小鼠尿液中HBV相關(guān)指標(biāo)表達(dá)情況，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)轉(zhuǎn)基因小鼠的生物學(xué)特性；并通過多種實(shí)驗(yàn)方法確定尿液中HBV相關(guān)指標(biāo)的組織來源。方法 使用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和熒光定量PCR（real-time PCR）檢測轉(zhuǎn)基因小鼠尿液中HBV相關(guān)指標(biāo)；并通過水動(dòng)力轉(zhuǎn)染的小鼠實(shí)驗(yàn)、RNA干擾方法抑制HBV表達(dá)轉(zhuǎn)基因鼠實(shí)驗(yàn)、乙肝患者HBV陽性血清感染正常小鼠實(shí)驗(yàn)等多種實(shí)驗(yàn)方法確定其復(fù)制表達(dá)組織來源。結(jié)果 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠尿液中存在HBsAg、HBeAg、及HBV-DNA表達(dá)，其中HBsAg的表達(dá)水平較高（6674± 619.8 IU/mL），但低于血清中HBsAg的表達(dá)水平（16470±2704 IU/mL），尿液HBsAg雄性小鼠的表達(dá)水平高于雌性小鼠；而尿液HBeAg表達(dá)水平較低，且尿液中HBeAg的陽性率高于血液，HBeAg的表達(dá)水平個(gè)體間和性別間有明顯差異；尿液中存在HBV-DNA含量達(dá)到103～105copy/mL；未檢測到相關(guān)抗體表達(dá)。通過水動(dòng)力轉(zhuǎn)染等實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)基因鼠尿液中的HBV相關(guān)指標(biāo)來源于腎臟的復(fù)制表達(dá)，而不是由肝臟分泌進(jìn)入血液循環(huán)以尿液排出，腎臟是HBV獨(dú)立的表達(dá)場所。結(jié)論 轉(zhuǎn)基因小鼠尿液中存在HBV相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)，并隨月齡長期表達(dá)，其中HBsAg及HBV-DNA表達(dá)水平較高且比較穩(wěn)定，雄性小鼠尿液HBsAg的滴度高于雌性小鼠；HBeAg雄性鼠表達(dá)水平相對雌性鼠較高且比較穩(wěn)定；尿液中無各類抗體表達(dá)；腎臟也是HBV獨(dú)立的復(fù)制表達(dá)場所。

【關(guān)鍵詞】肝炎病毒，乙型；轉(zhuǎn)基因小鼠；模型，動(dòng)物；尿液；生物學(xué)特性

目前轉(zhuǎn)基因小鼠在乙型肝炎的研究中得到了廣泛地應(yīng)用，綜合國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)表明［1-5］，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)表達(dá)的組織特異性及與病毒元件和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性子的相互作用有關(guān)。此外，其它還有許多因素影響轉(zhuǎn)錄，包括激素、組織特異性轉(zhuǎn)錄子及各種修飾細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平相互作用均影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)。轉(zhuǎn)基因小鼠出生前就能在內(nèi)源性HBV啟動(dòng)子的控制下，主要在肝臟內(nèi)持續(xù)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。康愛君等［6］觀察血清HBsAg為陽性的15只小鼠，肝組織有HBsAg的存在，且HBsAg的分布呈胞質(zhì)型，但不存在于脾、肺、心等組織中。Burk RD也有報(bào)道只有在肝和腎有 HBV基因表達(dá)［7］。Chisari實(shí)驗(yàn)室［8］和我們實(shí)驗(yàn)室建立1.3拷貝全基因HBV轉(zhuǎn)基因鼠模型［9］，只有在肝和腎組織有HBsAg/HBcAg表達(dá)，免疫組化陽性，但對腎組織進(jìn)行HBV基因表達(dá)特性及與肝、外周血乙肝病毒指標(biāo)關(guān)系等缺少相關(guān)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，已廣泛應(yīng)用于HBV的復(fù)制、表達(dá)及小型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的免疫發(fā)病機(jī)制研究，同時(shí)也是篩選和評價(jià)抗HBV藥物理想工具［9，10］。對該轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行更深入生物學(xué)特性研究時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠的尿液也有HBV相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)復(fù)制，為此展開了對轉(zhuǎn)基因小鼠泌尿系統(tǒng)的研究。本研究對進(jìn)一步深入了解HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的生物學(xué)特性有重要意義，豐富了轉(zhuǎn)基因小鼠生物學(xué)特性研究的內(nèi)容，為1.3copyD基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)際應(yīng)用于臨床前藥物評價(jià)時(shí)提供更多的理論依據(jù)，而且目前國內(nèi)外未見相關(guān)方面的研究報(bào)道。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級血清HBsAg檢測陽性的1.3copyD基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠【SCXK（軍）2012-0018】，由本科研室提供。

SPF級C57BL/6小鼠12只（18～20）g，均為雄性鼠【SCXK（粵）2013-0002】，BAL B/c小鼠6只（18～20）g，雌雄各半【SCXK（粵）2013-0002】購于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，分別用于1.3.2水動(dòng)力轉(zhuǎn)染的小鼠實(shí)驗(yàn)和1.3.4乙肝患者HBV陽性血清感染正常小鼠實(shí)驗(yàn)。

SPF級 1.3copyD基因型 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠（HBsAg測定值吸光度相近）10只（18～20）g，均為雄性，用于1.3.3 RNA干擾方法抑制HBV表達(dá)轉(zhuǎn)基因鼠實(shí)驗(yàn)。

以上實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于解放458醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF飼養(yǎng)設(shè)施【SYXK（軍）2012-0059】。動(dòng)物自由進(jìn)食進(jìn)水，室內(nèi)溫度：（23～25）℃，相對濕度：（55±10）%。維持12 h光照/12 h黑暗的晝夜節(jié)奏。購買的實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)環(huán)境1周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

HBsAg、HBeAg、抗HBeAg、抗HBsAg、抗HBcAgELISA檢測試劑盒購自上海科華生物公司，HBsAg、HBcAg免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，Omega組織DNA抽提試劑盒購自廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司。

目的質(zhì)粒PCDNA3.1（+）-1.3 HBVC，由302醫(yī)院徐東平教授惠贈(zèng)。目的質(zhì)粒 pU6-siHBVll （HBV特異性的shRNA表達(dá)載體），由本科研室提供。乙肝患者HBV陽性血清，于本院采集。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.3.1 轉(zhuǎn)基因小鼠尿液、血清ELISA酶聯(lián)檢測及HBV-DNA定量檢測：用玻璃采血管通過眼眶后靜脈叢采血，5 000 r/min離心10 min。將分離血清收集于0.5 mL無菌EP管內(nèi)，置于-20℃凍存。行按壓膀胱法采集尿液，5 000 r/min離心5 min，置于4℃保存（尿液 4℃存放時(shí)間不超過 48 h）。按ELISA試劑盒說明分別進(jìn)行 HBsAg、HBeAg、抗HBeAg、抗HBsAg、抗HBcAg檢測（其中HBsAg血清和尿液樣本取原液和1/5 000稀釋兩種），并進(jìn)行結(jié)果判定。

取保存的尿液和血清樣本進(jìn)行real-time PCR檢測HBV-DNA的表達(dá)。

1.3.2 水動(dòng)力轉(zhuǎn)染的小鼠實(shí)驗(yàn)：取實(shí)驗(yàn)C57BL/6小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（10只）和對照組（2只），將目的質(zhì)粒PCDNA3.1（+）-1.3HBVC溶于生理鹽水中，生理鹽水的體積為小鼠體重的10%，通過水動(dòng)力轉(zhuǎn)染方法初步建立HBV轉(zhuǎn)染C57BL/6小鼠模型［11-17］。在注射結(jié)束后7 d采集實(shí)驗(yàn)小鼠血清和尿液進(jìn)行 HBsAg、HBeAg、HBV-DNA檢測，方法同前。

1.3.3 RNA干擾方法［18-22］抑制HBV表達(dá)轉(zhuǎn)基因鼠實(shí)驗(yàn)：取實(shí)驗(yàn)1.3copyD基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組（各5只），將目的質(zhì)粒pU6-siHBVll溶于生理鹽水中，生理鹽水的體積為小鼠體重的10%，采用水動(dòng)力轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行質(zhì)粒注射［11-17］。在注射結(jié)束后5 d采集實(shí)驗(yàn)小鼠血清和尿液進(jìn)行HBsAg檢測（樣本進(jìn)行1/1 600稀釋），方法同前。

1.3.4 乙肝患者HBV陽性血清感染正常小鼠實(shí)驗(yàn)：取實(shí)驗(yàn)BAL B/c小鼠經(jīng)尾靜脈注射人HBV陽性血清［11-17］。在注射結(jié)束后2 d采集實(shí)驗(yàn)小鼠血清和尿液進(jìn)行HBsAg、HBeAg、HBV-DNA定量檢測，由本院檢驗(yàn)中心完成。

1.3.5 轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟、膀胱免疫組化特性及病理觀察：斷頸處死血清HBsAg陽性的轉(zhuǎn)基因小鼠8只（雌性4只，雄性4只）和正常小鼠2只（雌性1只，雄性1只）取腎臟、膀胱。以10% 中性甲醛固定48 h，石蠟包埋，常規(guī)切片，脫蠟，HE染色，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。按免疫組化試劑盒操作說明檢測轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟、膀胱中HBsAg、HBcAg的表達(dá)情況。

1.3.6 轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟、肝臟 HBV-DNA定量檢測：斷頸處死血清HBsAg陽性的轉(zhuǎn)基因小鼠26只取腎臟、肝臟。按組織DNA抽提試劑盒操作說明進(jìn)行肝臟、腎臟組織DNA提取，并進(jìn)行real-time PCR檢測HBV-DNA，分析腎臟和肝臟HBV-DNA的陽性率及復(fù)制水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HBV相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果

ELISA檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因小鼠尿液中可檢測到HBsAg、HBeAg，以血清HBsAg陽性為基數(shù)尿液HBsAg陽性率達(dá)100%、HBeAg達(dá)66.99%，未檢測到相關(guān)抗體（HBsAb、HBeAb、HBcAb）；血液中可檢測到HBcAb，且陽性率達(dá)100%。Real-time PCR結(jié)果顯示尿液和血液中存在HBV-DNA的復(fù)制，拷貝數(shù)可達(dá)103～105（表1）。

2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠尿液中HBsAg滴度特點(diǎn)

對血清HBsAg陽性的轉(zhuǎn)基因小鼠120只（雌性60只，雄性60只）尿樣進(jìn)行ELISA分析，樣本做1/ 5 000稀釋，檢測尿液和血清中HBsAg的陽性率的關(guān)系及表達(dá)水平的高低。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，尿液和血清中HBsAg的陽性率均為100%，但血清比尿液滴度高（表1），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），且主要由于雌鼠尿液HBsAg滴度過低導(dǎo)致（圖1）。雌性轉(zhuǎn)基因鼠尿液HBsAg滴度低于血液，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.0001），雄性轉(zhuǎn)基因鼠尿液與血液滴度相當(dāng)（圖1），不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。尿液雄性小鼠比雌性小鼠滴度高（圖1），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001），血清雄性小鼠比雌性小鼠滴度略高（圖1），但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這表明，轉(zhuǎn)基因小鼠尿液中HBsAg的含量與性別有關(guān)，雄性高于雌性。

2.3 轉(zhuǎn)基因小鼠尿液中HBeAg表達(dá)特點(diǎn)

2.3.1 轉(zhuǎn)基因小鼠尿液中HBeAg陽性率及與性別關(guān)系：對血清HBsAg陽性的轉(zhuǎn)基因小鼠541只（雌性291只，雄性250只）進(jìn)行ELISA分析檢測尿液和血清中HBeAg的陽性率及與性別關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，尿液 HBeAg陽性率為 66.99%，血清為9.17%。雌鼠尿液和血清陽性率分別為48.17%、8.66%，雄鼠尿液和血清陽性率分別為87.84%、9.8%。（表2）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，尿液和血液陽性率的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；雌性小鼠和雄性小鼠血清HBeAg陽性率的差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但雌性小鼠和雄性小鼠尿液HBeAg陽性率的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001）。

2.3.2 轉(zhuǎn)基因小鼠尿液中HBeAg表達(dá)滴度水平及性別的影響：對尿液HBeAg陽性的轉(zhuǎn)基因小鼠209只（雌性79只，雄性130只）進(jìn)行A值比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雄性小鼠比雌性小鼠滴度高（圖2），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001）。這表明，轉(zhuǎn)基因小鼠血清中HBeAg的含量與性別有關(guān)，雄性鼠HBeAg滴度高于雌性鼠，且可長期穩(wěn)定表達(dá)，隨月齡變化滴度水平變化不顯著。

2.4 轉(zhuǎn)基因小鼠尿液中HBV-DNA的復(fù)制水平

對血清HBsAg陽性的轉(zhuǎn)基因小鼠30只進(jìn)行real-time PCR檢測分析尿液和血清中HBV-DNA的陽性率及復(fù)制水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HBV-DNA陽性率尿液和血清陽均為100%，拷貝數(shù)達(dá)103～105。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，轉(zhuǎn)基因小鼠尿液和血清HBV-DNA復(fù)制水平的差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

為確定HBV轉(zhuǎn)基因鼠尿液中乙肝病毒指標(biāo)組織來源，我們又進(jìn)一步進(jìn)行了下面項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)研究。

2.5 水動(dòng)力轉(zhuǎn)染HBV的小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對所有實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行ELISA分析和real-time PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組小鼠血清、尿液未檢測到HBsAg、HBeAg和HBV-DNA。實(shí)驗(yàn)組的小鼠尿液中未檢測到HBsAg、HBeAg和HBV-DNA，而血清中則有檢測到，且處于高水平。表明HBV質(zhì)粒經(jīng)水動(dòng)力可以轉(zhuǎn)染到正常鼠肝細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制表達(dá)，并且相關(guān)蛋白可以釋放進(jìn)入血液，但血液中的HBV相關(guān)指標(biāo)正常情況下不能通過腎小球?yàn)V過進(jìn)入尿液中。

2.6 RNA干擾方法抑制HBV表達(dá)轉(zhuǎn)基因鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對所有實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)基因小鼠于實(shí)驗(yàn)前和試驗(yàn)后5 d進(jìn)行ELISA分析檢測血清和尿液HBsAg的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RNAi組血清HBsAg的表達(dá)水平變化明顯，HBsAg平均A值同對照組相比大幅降低（圖3），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001）；但尿液中RNAi組和對照組HBsAg的滴度沒有明顯改變，差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖3）。表明 RNAi在hydrodynamic肝臟靶向性的作用下能夠抑制轉(zhuǎn)基因小鼠肝細(xì)胞內(nèi)HBV的表達(dá)，進(jìn)而影響血液中HBV相關(guān)指標(biāo)的滴度，但影響不了轉(zhuǎn)基因鼠尿液中HBV相關(guān)指標(biāo)的滴度。這表明HBV轉(zhuǎn)基因鼠血液中HBV相關(guān)指標(biāo)的顯著變化并沒有影響其尿液中HBV相關(guān)指標(biāo)。

2.7 乙肝患者HBV陽性血清感染正常小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 HBV相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果Tab.1 Detection of HBV-related indexes in the blood and urine

表2 轉(zhuǎn)基因小鼠血液和尿樣中HBeAg陽性率比較Tab.2 Comparison of HBeAg positive rates in the blood and urine of transgenic mice

對所有實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行ELISA分析和 real-time PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)尾靜脈注射人HBV陽性血清的小鼠尿液中未檢測到HBsAg、HBeAg和HBV-DNA，而血清中則有檢測到，且處于較高水平。表明血液中的HBV相關(guān)指標(biāo)不能通過腎小球?yàn)V過進(jìn)入尿液中，進(jìn)一步表明HBV轉(zhuǎn)基因鼠血液和尿液中HBV相關(guān)指標(biāo)來源于兩個(gè)獨(dú)立的復(fù)制表達(dá)體系。

A：雌性鼠尿液和血清中HBsAg滴度，B：雄性鼠尿液和血清中HBsAg滴度，C：雌雄性轉(zhuǎn)基因小鼠尿液HBsAg表達(dá)水平，D：雌雄性轉(zhuǎn)基因小鼠血清HBsAg表達(dá)水平圖1 轉(zhuǎn)基因小鼠尿液和血清中HBsAg的陽性率和滴度水平比較（均以1/5 000稀釋樣本）Figure A shows HBsAg titer in urine and serum of female mice；Figure B shows HBsAg titer in urine and serum of male mice；Fig.C shows HBsAg expression level in the urine of female transgenic mice；Fig.D shows HBsAg expression level in the serum of female transgenic mice.Fig.1 Comparison of HBsAg positive rate and titer level in the urine and serum of transgenic mice（1/5 000 diluted samples）

A：不同性別轉(zhuǎn)基因小鼠尿液HBeAg，B：不同性別轉(zhuǎn)基因小鼠尿液HBeAg滴度隨月齡的變化。圖2 轉(zhuǎn)基因小鼠尿液中HBeAg陽性A值與各月齡HBeAg陽性結(jié)果A值Figure A shows the urine HBeAg in the male and female transgenic mice；Figure B shows changes along with age in month of urine HBeAg titer in the male and female transgenic mice.Fig.2 HBeAg positive A value in the urine of transgenic mice at each age in months.

（A：對照組和RNAi組血清HBsAg的A值，B：對照組和RNAi組尿液HBsAg的A值）圖3 對照組和RNAi組血清和尿液HBsAg中的A值比較（均以1/1 600稀釋樣本）Figure A shows HBsAg A values in the urine of control and RNAi groups.Figure B shows HBsAg A values in the urine of control and RNAi groups.Fig.3 Comparison of A values of HBsAg in the serum and urine between control group and RNAi group（1/5 000 diluted samples）.

A、B：腎臟HBsAg免疫組化，C、D；腎臟HBcAg免疫組化圖4 轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟HBsAg、HBcAg免疫組化A，B：Kidney，HBsAg staining.C，D：Kidney，HBcAg staining.Fig.4 The expression of HBsAg and HBcAg in kidney tissues of the transgenic mice.Immunohistochemical staining.

2.8 轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟、膀胱組織HE染色及免疫組化結(jié)果

血清HBsAg陽性的轉(zhuǎn)基因小鼠和正常小鼠進(jìn)行腎臟、膀胱組織經(jīng)HE染色后，在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)其腎臟和膀胱組織的形態(tài)、結(jié)構(gòu)無明顯的病理改變。轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟、膀胱組織HBsAg、HBcAg免疫組化檢測結(jié)果顯示腎臟有HBsAg、HBcAg的表達(dá)（圖4），其中HBsAg的以胞漿型為主分布于靠近腎髓質(zhì)區(qū)的腎皮質(zhì)區(qū)；HBcAg多呈核型分布于腎臟髓質(zhì)區(qū)。膀胱中均未檢測到 HBsAg、HBcAg的表達(dá)。

2.9 轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟中HBV-DNA的復(fù)制表達(dá)水平

血清HBsAg陽性的轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟、肝臟組織HBV-DNA定量PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HBV-DNA陽性率尿液和血清陽均為100%，拷貝數(shù)達(dá)105～107。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟和肝臟組織HBV-DNA復(fù)制水平的差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

本研究對該轉(zhuǎn)基因小鼠尿液中HBV相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了檢測分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠尿液中存在HBsAg、HBeAg、及 HBV-DNA，未檢測到 HBsAb、HBeAb、HBcAb的存在。其中HBsAg的表達(dá)水平較高，血清中HBsAg的表達(dá)水平高于尿液中HBsAg的表達(dá)水平，尿液HBsAg雄性小鼠的表達(dá)水平高于雌性小鼠；而血液HBeAg表達(dá)水平低與尿液且尿液中HBeAg的陽性率高于血液，HBeAg的表達(dá)水平個(gè)體間和性別間有明顯差異，雄性小鼠HBeAg的表達(dá)水平高于雌性小鼠；尿液中存在HBV-DNA含量達(dá)到103～105copy/mL。轉(zhuǎn)基因小鼠年尿液中 HBsAg、HBeAg的含量與性別有關(guān)，雄性高于雌性，主要是由于HBV基因的表達(dá)受到雌激素和雄激素的共同作用，雌激素能抑制 HBV轉(zhuǎn)錄和 HBV-DNA復(fù)制［23］。A1omg等［24］發(fā)現(xiàn)，雌激素能抑制雄性鼠HBV-DNA的表達(dá)，還能抑制HBsAg的合成，補(bǔ)充雌激素可抑制雄性鼠HBeAg的產(chǎn)生，對雌性鼠HBVDNA表達(dá)的作用甚微。

腎小球?yàn)V過膜具有一定的“有選擇性”的通透性，分子半徑小于14 nm通過濾過膜不受限制；半徑大于20 nm濾過則受到一定限制，半徑大42 nm則不能通過。而且濾過膜所帶電荷對其通透性有很大影響，帶負(fù)電荷的分子不易通過。HBsAg的分子大于42 nm且?guī)ж?fù)電荷，因此不能通過腎小球?yàn)V出；HBeAg及其所形成的復(fù)合物分子小于14 nm但因其是帶負(fù)電荷，所以也不能夠通過腎小球?yàn)V出［25］。本研究通過不同實(shí)驗(yàn)方法表明血液中HBV相關(guān)指標(biāo)不能通過腎小球的濾過進(jìn)入尿液，尿液中HBV相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)情況不受血液變化的影響，腎臟是HBV的獨(dú)立的表達(dá)復(fù)制場所。

本研究使用正常小鼠通過水動(dòng)力轉(zhuǎn)染方法建立HBV急性轉(zhuǎn)染模型，使目的質(zhì)粒在肝臟獲得高水平的復(fù)制表達(dá)，分泌HBV相關(guān)指標(biāo)入血，在造模小鼠尿液中未檢測到HBsAg、HBeAg和HBV-DNA，而血清中能檢測到，且處于高水平表達(dá)，表明血液中的HBV相關(guān)指標(biāo)正常情況下不能通過腎小球?yàn)V過進(jìn)入尿液中。接著，選取HBV轉(zhuǎn)基因小鼠采用水動(dòng)力轉(zhuǎn)染方法將肝臟作為靶器官，使shRNA表達(dá)質(zhì)粒被肝細(xì)胞攝取從而對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠HBV產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致血清中HBsAg減少，而不影響尿液中HBsAg，反過來表明血液中HBV相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)對尿液中的沒有影響。最后，我們進(jìn)行了乙肝患者HBV陽性血清感染正常小鼠實(shí)驗(yàn)，也進(jìn)一步表明血液中的HBV相關(guān)指標(biāo)不能通過腎小球?yàn)V過進(jìn)入尿液中。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血液和尿液中HBV相關(guān)指標(biāo)來源于兩個(gè)獨(dú)立的復(fù)制表達(dá)體系。

而且HBV并非嚴(yán)格的嗜肝病毒，目前已有研究證實(shí)HBV可以在包括腎臟在內(nèi)的多種肝外組織復(fù)制［26］。在對本研究HBV轉(zhuǎn)基因小鼠前期的生物學(xué)特性研究中也表明乙肝病毒基因在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟具有較高水平轉(zhuǎn)錄［9］。同時(shí)，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的腎組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)無明顯的病理改變，表明轉(zhuǎn)基因小鼠尿液中的出現(xiàn)HBV相關(guān)指標(biāo)并非由于腎臟病變所致；腎組織檢測到 HBsAg、HBcAg （HBsAg的以胞漿型為主分布于靠近腎髓質(zhì)區(qū)的腎皮質(zhì)區(qū)，HBcAg多呈核型分布于腎臟髓質(zhì)區(qū)）表明腎臟本身存在HBV相關(guān)指標(biāo)的復(fù)制表達(dá)，這進(jìn)一步加深我們對乙型肝炎病毒的認(rèn)識(shí)。

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〔修回日期〕2016-03-28

【中圖分類號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856（2016）06-0053-08

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.06.011

［基金項(xiàng)目］國家科技重大專項(xiàng)課題—艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治—HBV細(xì)胞和動(dòng)物模型的建立和應(yīng)用（課題編號(hào)：2012ZX10004503010）.

［作者簡介］楊陽（1987-），女，碩士，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)研究。E-mail：yangya726@qq.com。

［通訊作者］顧為望（1656-），男，教授，研究方向：從事比較醫(yī)學(xué)研究。E-mail：guww@163.com；劉光澤（1962-），男，主任技師，研究方向：疾病基因工程動(dòng)物模型的制備和應(yīng)用研究，E-mail：lgze68@163.com。lower than that in the serum（16470±2704 IU/mL）.The level of HBsAg expression in the urine of male mice was higher than that in female mice.The level of HBeAg expression in the urine was lower and the HBeAg positive rate of urine was higher than that of blood，and the levels of HBeAg expression showed significant inter-individual and inter-sexual differences.HBV-DNA level reached 103-105copy/mL in the urine，but no related antibody expression was detected.The experiments such as hydrodynamic infection test indicated that the HBV-related indexes in the urine are derived from replication in the kidneys rather than secreted from the liver，entered into the blood circulation，and discharged from the urine.The kidneys are an independent expression site of HBV.Conclusions The expression of HBV-related indexes is present in the urine of transgenic mice and it is a long-term expression along with the age in months，of which the expression levels of HBsAg and HBV-DNA are rather high and stable.HBsAg titer in the urine of the male mice is higher than that of female mice.HBeAg expression level in the male mice is more stable compared with that in female mice.No expressions of various kinds of antibodies have been found in the urine.The kidneys are an independent expression site of HBV.

Analysis of hepatitis B virus-related indexes in the urine of HBV transgenic mice

YANG Yang1，2，LIU Guang-ze1，LI Xiu-mei2，KONG Xiang-ping2，GU Wei-wang1
（1.Institute of Comparative Medicine&Center of Experimental Animals，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China；2.Liver Disease Center of PLA，No.458 Hospital of PLA，Guangzhou 510602）

【Abstract】Objective To detect and analyze the HBV-related indexes in the urine of HBV transgenic mice and further understand the biological characteristics of transgenic mice，and to clarify the tissue sources of HBV-related indexes.Methods HBV-related indexes in the urine of transgenic mice were tested using enzyme-linked immune sorbent assay（ELISA）and fluorescence quantitative PCR（real-time RCR）.The tissue sources were confirmed by several experiments，i.e.hydrodynamic transfection of mice，RNA interference to inhibit HBV-expression in the transgenic mice，and to infect normal mice with HBV-positive serum from patients.Results Expression of HBsAg，HBeAg and HBV-DNA was present in the urine of transgenic mice，of which the HBsAg expression level was high（6674±619.8 IU/mL），but

【Key words】Hepatitis B virus；Transgenic mice；Model，animal；Urine；Biological indexes