劉曉雨，譚 文

（華南理工大學生物科學與工程學院/生物醫(yī)藥前孵化器研究中心/廣東省發(fā)酵與酶工程重點實驗室，廣州 510006）

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用壓力-容積環(huán)評價大鼠心功能方法的改進及注意事項

劉曉雨，譚 文

（華南理工大學生物科學與工程學院/生物醫(yī)藥前孵化器研究中心/廣東省發(fā)酵與酶工程重點實驗室，廣州 510006）

【摘要】目的 探討應用壓力-容積環(huán)（pressure-volume loop，PV Loop）評價大鼠心功能過程中的影響因素及方法改進原則，分析主動脈弓縮窄（transverse aortic constriction，TAC）誘導的壓力負荷對大鼠心臟功能的影響，從而為大鼠健康或疾病狀態(tài)下的心功能分析提供更為科學全面的方法。方法 采用壓力容積傳感器從大鼠的頸動脈插入左心室，調整傳感器到合適位置來改善壓力-容積環(huán)的形狀，結合配套軟件對心功能進行多方面的評價，分別從壓力及容積的定標、導管在左心室腔內的位置、呼吸機對測定的影響等方面分析應用壓力-容積環(huán)測定大鼠心功能時的操作要點。結果 （1）通過頸靜脈注射適量的高滲鹽水定標，扣除心室壁平行電導率引起的容積，可以獲得準確的左心室容積。（2）適度調節(jié)壓力-容積導管，使傳感器的位置完全進入心室但又不接觸心室壁，可以得到更好的壓力-容積信號。（3）停止呼吸機適當時間，消除非自主呼吸對測定的影響，有助于獲得更穩(wěn)定的數據。采用這一方法對主動脈縮窄手術（誘導心肌肥大）后1個月的大鼠進行分析，可以更好地評價大鼠在正常和疾病狀態(tài)下的心功能。結論 本研究從容積定標、導管位置和呼吸機等方面對大鼠心臟的壓力-容積環(huán)測定方法進行了改進和完善，并通過分析正常和心肌肥大的大鼠心功能驗證了該方法的可靠性。

【關鍵詞】壓力-容積環(huán)；主動脈弓縮窄；心功能；方法改進

左心室壓力-容積環(huán)分析［1］在嚙齒類動物生理、病理狀態(tài)下的心功能評價中應用廣泛，已經成為基礎研究中公認的評價動物心功能變化的“金標準”之一。采用壓力-容積關系比較負荷和變力性對心室收縮的影響，表明負荷變化對心臟各項指數的影響與其對變力刺激敏感性接近，并且壓力-容積關系參數理論分析的結果與試驗數據一致［2］。通過這一方法對心肌梗塞引起的心衰進行功能評價，表明心肌缺血后，隨著時間推移，從代償性重構逐步發(fā)展為失代償的心衰，心臟收縮和舒張功能均發(fā)生一系列顯著變化［3］，在衰老相關的晚期心衰大鼠中也可以觀察到心臟各項參數的變化［4］。目前，基于清醒小鼠的壓力-容積環(huán)分析檢測也被建立起來［5］，從而可以連續(xù)觀察清醒狀態(tài)下心臟收縮的變化情況。

壓力-容積環(huán)分析也廣泛用于大型動物或臨床人體心功能的評價［6-12］。采用這一方法，結合超聲心動圖等技術，對具有正常射血分數的心衰病人（HFNEF）進行分析，表明不同病人之間具有不同的生理病理學機制［6-7］。近期一項研究將這一技術測定各種心血管疾病病人的心功能，表明壓力-容積關系能更好地區(qū)分不同的臨床癥狀的病人［8］。細胞移植是一種治療心衰的新方法，采用壓力-容積檢測可以長期觀察這種治療對心衰病人的恢復效果［9］。對諸如狗等相對較為大型的動物，選擇合適型號的壓力-容積導管，也可以測定各種疾病狀態(tài)下的心臟功能［10-11］。

盡管壓力-容積關系已經廣泛用于心臟功能評價，相關的操作流程已經較為完善［13］，然而，對這項技術是否能科學、客觀地反映心功能的狀態(tài)尚有爭議，相關方法學也需要進一步完善［14］，與左心室功能檢測相關的各種實驗技術也需要不斷提升［15］。為此，本研究分別從壓力和容積的定標、壓力容積導管在左心室腔的位置、呼吸機對評價的影響等方面改進這一心功能評價方法，探討應用導管測定心功能過程中的操作原則和注意事項，并應用這一改進的方法測定主動脈弓縮窄手術（TAC）誘導的大鼠心肌肥大模型的心功能參數變化，為大鼠健康或疾病狀態(tài)下的心功能分析提供更為科學全面的方法。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：Wistar大鼠，雄性，8～10周齡，體重200±20 g，購買于廣東省中山大學動物實驗中心【SCXK（粵）2011-0029】，在中山大學動物實驗中心進行實驗【SYXK（粵）2011-0112】。

1.1.2 主要儀器：外科手術設備及器械（廣州器化醫(yī)療設備有限公司）、小動物呼吸機（Harvard Apparatus，Holliston，MA，USA）、恒溫加熱墊（廣州飛迪生物科技有限公司，型號：PLS-20A）、PowerLab數據采集分析系統(tǒng)（AD Instruments Inc.）、Millar壓力容積導管SPR-838（Millar Instruments Inc.）、光纖冷光源（F-150S）、小動物電子秤（永康市華鷹衡器有限公司，型號：ASC-30）、恒溫加熱墊（廣州飛迪生物科技有限公司，型號：PLS-20A）。

1.2 實驗方法

1.2.1 主動脈弓縮窄手術建立大鼠心肌肥大模型：對大鼠實施主動脈縮窄手術，制造壓力負荷誘導的大鼠心肌肥大模型［16］。其過程如下：大鼠稱重后腹腔注射3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，讓其仰臥于手術臺上（恒溫墊控溫37℃），固定大鼠四肢，頭部。行經口氣管插管，連接上小動物呼吸機，設置潮氣量為4～6 mL/200 g，頻率為65～70次/min。手術區(qū)域備皮，碘伏消毒，鋪無菌紗布，用眼科彎鑷和剪刀從左胸部位斜向把皮剪開，用眼科彎鑷鈍性分離兩邊的皮，暴露更多的肌肉。然后用彎頭止血鉗鈍性分離胸大肌和胸小肌，暴露出肋骨。用眼科彎鑷在第二和第三肋骨間無菌操作下開胸，并小心撥開左右兩片胸腺，暴露主動脈弓。把4-0號的醫(yī)用真絲編織線從右無名動脈和左頸總動脈之間穿過胸主動脈（結扎部位如圖1所示）［17］，將主動脈結扎于21 G（外徑為0.8 mm）的針頭上，隨后把針頭抽出。結扎牢固后，將胸腺輕輕回位蓋住結扎部位。由胸腔引出一根消毒的塑料管，逐層關胸，縫好肌肉后，用注射器經塑料管吸出胸腔內的氣體，使肺部能較好地擴張，然后拔掉塑料管并縫合傷口。繼續(xù)通呼吸機15 min，待大鼠自主呼吸恢復后，拔出氣管插管，放回籠子飼養(yǎng)。假手術組（SHAM）實施完全相同的操作，只是編織線穿過血管后不行結扎。

1.2.2 大鼠心功能的測定：左心室壓力和容量測定的原理：Millar壓力容積導管是一根末端帶有一個微型壓力感受傳感器（PS）和四個感受容積的環(huán)狀電極（E1-E4）的導管（圖2）。其中導管兩端的電極是興奮性電極，中間的一對電極是干預記錄電極。導管插進心臟后，四個電極可以跨距整個心室的長軸。通過微型壓力感受器可以檢測心室壓力的變化。興奮性電極之間經過高頻低振幅的恒定電流，產生局部的電場。干預電極之間的電勢與血液的電阻成正比，與血液的電導率成反比。干預電極可以記錄心室內血液的電導率。一個心動周期內不同的時相中心室的血容量不同導致干預電極記錄的電導率也不同。根據檢測心室內的電導，轉換為心室容積，轉化公式：Volume=（1/α）×ρ×L2×G，其中Volume表示心室容積，α表示容積校正系數，ρ表示血液的電阻，L表示干預電極之間的距離，G表示檢測的總電導。由于導管檢測心室內血液的電導率是以電勢值信號輸出的，因此需要進行單位轉換。將相對容積電導信號（以電勢V表示）轉化為絕對容積（μL）。此外，由于檢測的總電導其實包含了血液、心室壁和周圍的組織產生的電導，所以為了準確地得到心室容積，需要進行高滲鹽水定標，以扣除心室壁和周圍組織產生的電導［13］。

圖1 實施TAC手術的主動脈弓縮窄部位［17］Fig.1 The site of transverse aortic constriction［17］

1.2.2.1 壓力容積導管電導信號單位（ms）向容積單位（μL）轉換：使用由廠家提供的絕緣體容積校準容器（見圖3），置于37℃恒溫加熱墊上，往5個深1 cm、直徑在5～9 mm范圍內的孔中加入1%的肝素（生理鹽水配制）進行潤洗，然后抽出肝素，迅速往里面加入用1%的肝素抗凝的新鮮大鼠血液，將導管插入到孔中，保證導管的4個電極均浸沒在血液中，保持10～20 s，此時，屏幕上可看見容積信號上升并維持一段時間。然后插入到下一個孔中，由于這五個孔的體積不一樣，會產生不同的電導信號，直到采集完5個梯度的電導信號，然后重復2次。根據每個孔測得的實際容積信號V）與標示的容積（μL）數據（表1），擬合出校正標準曲線，由此得到線性方程的斜率和截距（圖4），將斜率和截距代入方程即可將電導信號單位（ms）向絕對體積單位（μL）轉換［13］。

圖2 SPR-838 Millar導管Fig.2 A picture of SPR-838 Millar catheter

1.2.2.2 左心室內插入導管：將TAC手術后飼養(yǎng)4周的大鼠麻醉后，固定于37℃的恒溫手術臺上。經口插入氣管導管，通上呼吸機，具體步驟參考模型制備的步驟（1.2.1部分）。對大鼠頸部周圍進行備皮，行頸正中切口約3 cm，鈍性分離皮下組織和頸前正中肌肉，找到呈“T”型的三塊肌肉，在肌肉下找到右側頸總動脈，用玻璃分針小心將動脈周圍的神經分離，避免分離右側頸動脈時牽拉迷走神經。然后在動脈下穿線，結扎右側頸動脈遠心端，并在近心端置小動脈夾，并穿線備用。在靠近近心端結扎處用眼科剪朝向心端呈45℃剪一“V”型小口，插入導管后，用靠近心端的線扎一個松結，松開動脈夾，并觀察電腦屏幕上波形的變化。當導管往心臟方向前進時遇到助力，可以適度地將其往回退，然后再繼續(xù)前進，直到屏幕上出現典型的心室內壓波形，即可停止前進，為把近心端的松結扎緊，避免導管脫落，此時要適度地調整導管在左心室內的位置，直到出現穩(wěn)定且漂亮的壓力-容量環(huán)［18］。

圖3 絕緣體校準容器Fig.3 Insulated calibrating container

表1 使用絕緣體校準容器平衡3次測得的實際容積Tab.1 The real volume measured by the insulated calibrating container

圖4 校正標準曲線Fig.4 Calibrated standard curve（Volume）

1.2.2.3 采用平行電導對容積進行校正：用玻璃分針鈍性分離大鼠右頸靜脈，小心牽拉迷走神經。然后在頸靜脈下穿線，結扎頸靜脈遠心端，并在近心端置小動脈夾，并穿線備用。在靠近近心端結扎處用眼科剪朝向心端呈45℃剪一“V”型小口，插入PE50導管后，用靠近心端的線扎緊，松開動脈夾，用注射器往PE50導管里推進約40μL 30%的高滲鹽水，此時可見左心室容量迅速增大，壓力-容積環(huán)往右移動（電導發(fā)生明顯改變）且不伴隨壓力信號幅度的降低。等左心室容量恢復到給高滲鹽水前的水平，再次重復推進高滲鹽水，如此進行2～3次高滲鹽水定標。選取左心室容量增大的一段數據，可得出給高滲鹽水后左心室的舒張末容積-收縮末容積的線性關系，此直線與當左心室舒張末容積與收縮末容積相等時的直線（此直線表示心室沒有血液）相交于一點，此點對應的體積為平行體積（Vp），即心室壁和周圍組織產生的電導所引起的心室容量誤差。所以最終表示左心室的容積要扣除這容量誤差。相關研究表明［4，18］，注射20～40 μL的30%高滲鹽水，Vp一般為130～280 μL。

2 結果

2.1 高滲鹽水定標對平行電導校正的影響

采用高滲鹽水注射來確定心室壁的平行電導引起的容積是獲得心室真實容積的有效方法。由圖5A可知，大鼠靜脈注射高滲鹽水后，心室容量增加的同時會引起心室壓力的降低。在此區(qū)域里，推算出的Vp值超出文獻公認的規(guī)定值。選取容量增加同時心室壓力沒有明顯變化的區(qū)域（壓力容積曲線只發(fā)生左右平移，無上下移動，圖5B中），推算出的Vp值在文獻公認的范圍內。由此可知，注射高滲鹽水對平行電導進行校正時需要選取容量增加的同時心室壓力沒有明顯變化的數據，如圖5B上所示。

2.2 壓力容積導管在左心室腔內的位置對壓力-容積環(huán)測定的影響

圖5 注射高滲鹽水進行平行電導校正Fig.5 Parallel conductance corrected by hypertonic saline

研究發(fā)現，導管的位置對于容積的測定影響較大，如圖6所示。調整前，左心室等容舒張期和等容收縮期中的容積發(fā)生明顯變化，呈現不等容現象。經適度調整后，壓力-容積環(huán)的等容舒張期和等容收縮期偏移減少，并且心室收縮末容積與調整前發(fā)生明顯改變。此時壓力容積導管前端的傳感器器應該位于左心室內，并且不應該與心室壁有接觸。導管末端進入心室長度隨大鼠體重變化而稍有不同，例如體重約300 g的大鼠，導管進入長度約為6.3 mm，體重約400 g的大鼠，導管進入長度約6.8 mm。

2.3 呼吸機對壓力-容積環(huán)測定的影響

研究發(fā)現，呼吸機會顯著引起左心室壓力和容積的波動，從而導致每個心動周期測定的壓力-容積環(huán)發(fā)生偏移（圖7）。而暫停呼吸機后，壓力-容積環(huán)的位置變得相對穩(wěn)定，并且心室壓沒有明顯變化，因此為獲得穩(wěn)定的壓力-容積環(huán)，可采集停呼吸機5～10 s的數據，然后再繼續(xù)通上呼吸機。

2.4 主動脈縮窄手術誘發(fā)大鼠心肌肥大的壓力-容積環(huán)測定

主動脈弓縮窄手術（TAC）可通過壓力負荷誘導心肌肥大，由圖8可知，正常組（圖8左）具有正常的心功能，而實施TAC手術一個月的肥大組（圖8右）心功能下降，舒張功能惡化，收縮有關的dp/ dtmax、EF等參數與對照組沒有明顯差異，說明TAC手術后一個月大鼠心室明顯擴張，但尚處于代償期，心臟功能總體處于良好狀態(tài)，壓力-容積環(huán)右移。而大鼠實施TAC手術兩個月后，dp/dtmax和EF均顯著降低，Ped和Tau均明顯增加，表明心臟收縮功能和舒張功能均受損，此時心臟進入失代償階段，壓力-容積環(huán)右移且環(huán)的上下邊沿均朝中心移動（數據未顯示）。

3 討論

圖6 壓力容積導管位置對壓力-容積環(huán)測定的影響Fig.6 The infection of catheters position to PV-loop assessing

3.1 使用絕緣體校準容器進行校正

目前，使用Millar壓力容積導管進行壓力-容積環(huán)測定評價心功能時，多采用絕緣體校準容器將電導率信號轉換為容積信號，以避免容器本身所具有的電導對信號的影響。絕緣體校準容器具有多個不同容積的孔，當往這些不孔內注射滿大鼠血液后，將Millar管依次插入其中，通過不同孔的容積與電導率信號讀數，繪制出兩者的關系曲線。根據這一曲線，可以方便地見所測得的電導率數據轉換為真實的容積。由于不同大鼠的血液理論上具有不同的電導率，因此每檢測一只動物，均應該用該動物的血液進行電導率-容積的轉換，即每只動物應該有自己的電導率-真實容積曲線。

圖7 呼吸機對壓力-容積環(huán)測定的影響Fig.7 The infection of respirator on the PV-loop assessment

圖8 正常生理狀態(tài)及代償性心肌肥大狀態(tài)下的壓力-容積曲線Fig.8 PV-loop curves in normal status and compensatory cardiac hypertrophy status

3.2 高滲鹽水定標對平行電導校正的影響

平行電導是心室壁和周圍組織產生的電導率。干預電極測定心室容積時實際上包含了這部分的電導率，因此需要靜脈注射高滲生理鹽水改變心室血液的電導率進行平行電導校正［13］。動物注射高滲鹽水會增加容量負荷或引起收縮性改變，此時使容積信號發(fā)生改變。在收縮末容積-舒張末容積關系圖上，收縮末容積與舒張末容積相等時的直線代表心室沒有血液（容積信號僅由心室壁及周圍組織的平行電導率產生），注射高滲鹽水時的容積曲線與此曲線的交點即代表平行電導率引起的容積Vp。

3.3 Millar導管在左心室腔內的位置對壓力-容積環(huán)測定的影響

壓力-容積環(huán)的建立關鍵在于心室容積的測定。由于心室腔本身的形狀是不規(guī)則的，Millar導管在心室腔內不同的位置，干預電極檢測的電導率信號也隨之變化。因此對Millar導管在心室腔內的位置進行調整，對于壓力-容積環(huán)的測定非常重要。測定過程中導管末端的傳感器如果與心室壁有接觸，將會對信號產生極大干擾，使壓力-容積環(huán)形狀不規(guī)則，心功能參數不準確，因此測定時含傳感器的導管應完全進入左心室，但又不能接觸心室壁。

3.4 呼吸機對壓力-容積環(huán)測定的影響

Millar導管進入左心室的方式有兩種，分別是經右頸總動脈插管（關胸）以及經心尖頂端插管（開胸）。其中經心尖頂端插管必須通上呼吸機，而右頸總動脈插管可選擇自由呼吸。但由于此過程必須使用麻醉藥，稍微過量的麻醉藥會顯著抑制心率和心功能而導致測定的數據不準確，例如，動物實驗常用的麻醉藥戊巴比妥鈉還會顯著增加呼吸道粘液的分泌導致呼吸暫停甚至窒息死亡。因此，一般建議Millar導管經右頸總動脈插入左心室的過程也通上呼吸機。本研究發(fā)現，呼吸機對于左心室壓力-容積環(huán)的測定會產生顯著影響，特別是對左心室容積的測定。因此，為保證心功能測定的順利進行，可記錄停呼吸機幾秒的數據，然后繼續(xù)通上呼吸機。

本研究分別從壓力和容積的定標、壓力容積導管在左心室腔的位置、呼吸機對評價的影響等方面對大鼠壓力容積環(huán)測定心功能的方法進行了完善和改進，并以心肌肥大模型進行驗證，從而為大鼠健康或疾病狀態(tài)下的心功能分析提供更為科學全面的分析手段。

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〔修回日期〕2016-03-09

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）06-0075-08

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.006.014

［基金項目］廣州市重大專項科技項目（201300000051）。

［作者簡介］劉曉雨（1990-），男，碩士生，主要研究方向：心肌肥大與心衰相關疾病，Email：513688273@qq.com。

［通訊作者］譚文，男，教授，主要從事醫(yī)藥生物學研究，Email：went@scut.edu.cn。better PV loops，it's important to adjust the position of the catheter in the left ventricle until all of the pressure and volume sensors were located in the ventricle as well as out of touch with the ventricular wall.3.Suspension the ventilator during the test is conducive to stable and reasonable data acquisition.We further assessed the cardiac functions of healthy rats and rats with cardiac hypertrophy with this improved method，which showed better performances.Conclusions This study we have evaluated the influences of calibration of volume，position of the catheter in the left ventricle（LV）and ventilator on measurements of rats PV loops，and further improved this method.Moreover，we have validated this method with measurements of cardiac functions of normal rats and cardiac hypertrophic rats.

Improvements and key points in the assessment of rat cardiac function using pressure-volume loop

LIU Xiao-yu，TAN Wen
（School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Pre-Incubator for Innovative Drugs and Medicine Center，South China University of Technology，Guangdong Provincial Key Laboratory of Fermentation and Enzyme Engineering，Guangzhou 510006，China）

【Abstract】Objective To investigate the key factors for PV Loop evaluation in rats and to improve this method.To provide examples of cardiac function measurements obtained from normal rats and from rats with cardiac hypertrophy induced by transverse aortic constriction（TAC）.To establish a more reliable method for rats heart measurements. Methods Rats underwent left ventricular catheterization through the right carotid artery.Through adjustments of the position of the pressure-volume conductance catheter，the optimal PV Loops and a number of cardiac functional parameters were acquired.The key influencing factors，calibration of volume，position of the catheter in the left ventricle（LV）and suspension of ventilator were assessed.Results 1.The real volume of left ventricle were acquired by injecting appropriate volume of hypertonic saline through jugular vein，which deducted the parallel conductivities of ventricular wall.2.To get

【Key words】Pressure-volume loop；Transverse aortic constriction；Cardiac function；Method improvement