高正琴，李曉波，馮育芳，王 吉，付 瑞，邢 進(jìn)，王淑菁，魏 杰，王 洪，鞏 薇，李冠民，賀爭鳴，岳秉飛

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

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技術(shù)方法

中國實驗動物中鼠管狀線蟲的分子鑒定和感染調(diào)查

高正琴，李曉波，馮育芳，王 吉，付 瑞，邢 進(jìn)，王淑菁，魏 杰，王 洪，鞏 薇，李冠民，賀爭鳴，岳秉飛

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

【摘要】目的 對鼠管狀線蟲進(jìn)行分子鑒定和感染調(diào)查，為國家標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供參考依據(jù)。方法 923批5199只SPF動物（包括：1批5只猴，3批25只小型豬，28批55只兔，13批248只地鼠，37批198只豚鼠，93批459只大鼠，742批4179只小鼠，5批25只雞和1批5只鴨）和145批1389只清潔動物（包括：1批3只兔，4批31只地鼠，16批157只豚鼠，32批268只大鼠和92批930只小鼠）來自全國50個不同的廠家。應(yīng)用直接鏡檢實時動態(tài)顯微視屏攝錄技術(shù)結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定方法，進(jìn)行鼠管狀線蟲感染篩查。應(yīng)用多重PCR和測序技術(shù)，鑒定分離的鼠管狀線蟲ITS（內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）、28S rRNA（28S核糖體RNA）、nad1（NADH脫氫酶亞單位1）和cox1（細(xì)胞色素C過氧化物酶亞基1）基因，從分子水平上確證鼠管狀線蟲感染。結(jié)果 應(yīng)用直接鏡檢實時動態(tài)顯微視屏攝錄技術(shù)，從動物中檢出鼠管狀線蟲的蟲卵、幼蟲和成蟲。根據(jù)鼠管狀線蟲的卵細(xì)胞、幼蟲、雌雄成蟲的大小和形態(tài)來鑒定蟲種。應(yīng)用多重PCR測序技術(shù)，能從分離的單個鼠管狀線蟲的蟲卵、幼蟲和成蟲中鑒定出ITS、28S rRNA、nad1和cox1基因，與其他不同種屬的寄生蟲無交叉反應(yīng)。應(yīng)用直接鏡檢實時動態(tài)顯微視屏攝錄技術(shù)，從5199份SPF和1389份清潔動物樣本中分別檢出鼠管狀線蟲陽性樣本285份和135份。應(yīng)用多重PCR和測序技術(shù)，鑒定證明這些陽性樣本中確實含有鼠管狀線蟲特異性的DNA。測序結(jié)果顯示，不同動物分離的鼠管狀線蟲的ITS、28S rRNA、nad1和cox1部分基因序列核苷酸相似性達(dá)100%。SPF和清潔動物的鼠管狀線蟲感染率分別為5.5%（285/5199）和9.7%（135/ 1389）。結(jié)論 應(yīng)用直接鏡檢實時動態(tài)顯微視屏攝錄技術(shù)聯(lián)合多重PCR測序技術(shù)能夠快速精準(zhǔn)檢測鑒定出鼠管狀線蟲。鼠管狀線蟲的人獸共患本質(zhì)可以視作為公共衛(wèi)生的一個預(yù)警。良好的動物質(zhì)量控制對保護(hù)人類身體健康和保障人民用藥安全具有重要作用。本研究對中國SPF和清潔動物的鼠管狀線蟲進(jìn)行了分子鑒定和感染調(diào)查。

【關(guān)鍵詞】實驗動物；鼠管狀線蟲；分子鑒定；感染調(diào)查

鼠管狀線蟲隸屬于線蟲綱（Nematoda）、尖尾目（Oxyurida）、管 狀 科 （Syphaciidae）、管 狀 屬（SyPhacia），也稱蟯蟲（Pinworm），寄居于腸道，輕度感染時無明顯臨床癥狀，重度感染時引起神經(jīng)精神癥狀、生長發(fā)育障礙、腹痛腹瀉、腸炎等［1，2］。鼠管狀線蟲感染一方面損壞宿主的神經(jīng)系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、皮膚黏膜功能，另一方面影響宿主的腸道生理學(xué)、血液學(xué)指標(biāo)，干擾免疫學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、傳染病學(xué)、自生免疫性疾病等的研究，感染還可傳播擴(kuò)散，增加宿主感染其他病原體的機(jī)會［3-6］。國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了清潔及以上動物中不得檢出全部蠕蟲［7，8］，但未見鼠管狀線蟲（SyPhacia muris）檢測方法，至今尚無精準(zhǔn)快速檢測鑒定方法，更缺乏全面監(jiān)測感染數(shù)據(jù)。本研究應(yīng)用直接鏡檢實時動態(tài)顯微視屏攝錄技術(shù)檢測和形態(tài)學(xué)鑒定方法聯(lián)合多重 PCR（multiple polymerase chain reaction，multiple-PCR）和測序技術(shù)，對我國無特定病原體（specific pathogen-free，SPF）和清潔動物的鼠管狀線蟲進(jìn)行快速檢測和分子鑒定并開展感染調(diào)查，對豐富完善國家標(biāo)準(zhǔn)、防控實驗動物疫病暴發(fā)、維護(hù)社會公共安全具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 儀器設(shè)備

生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，美國）；LEICA DM2500生物顯微鏡（Leica Microsystems，德國）；倒置顯微鏡及成像系統(tǒng)（Nikon，日本）；二氧化碳培養(yǎng)箱（北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）；基因擴(kuò)增儀（Applied Biosystyem，美國）；凝膠成像分析系統(tǒng)（東樂自然基因生命科學(xué)公司）。

1.2 樣品來源

923批5199只SPF動物（包括：1批5只猴，3 批25只小型豬，28批55只兔，13批248只地鼠，37 批198只豚鼠，93批459只大鼠，742批4179只小鼠，5批25只雞和1批5只鴨）和145批1389只清潔動物（包括：1批3只兔，4批31只地鼠，16批157只豚鼠，32批268只大鼠和92批930只小鼠）來自全國50個不同的廠家。對于猴、小型豬、兔等活體采集其直腸內(nèi)容物或新鮮糞便樣本，對于地鼠、豚鼠、大鼠、小鼠等則安樂死后采集其回盲部內(nèi)容物樣本。

1.3 直接鏡檢實時動態(tài)顯微視屏攝錄技術(shù)檢測和形態(tài)學(xué)鑒定鼠管狀線蟲

在負(fù)壓生物安全柜內(nèi)，分別將采集的直腸內(nèi)容物、回盲部內(nèi)容物和新鮮糞便樣本，置潔凈離心管中，加生理鹽水充分混勻，棄上清液，沉淀置于新的潔凈離心管中，洗滌數(shù)次后重新懸浮，迅速連續(xù)滴片，應(yīng)用直接鏡檢實時動態(tài)顯微視頻攝錄技術(shù)和形態(tài)學(xué)鑒定方法進(jìn)行蠕蟲檢定。根據(jù)蠕蟲的蟲卵、幼蟲、成蟲的形態(tài)和大小等進(jìn)行蟲種鑒定。

1.4 鼠管狀線蟲離體生存能力試驗

在負(fù)壓生物安全柜內(nèi)，無菌移取新分離的鼠管狀線蟲，置培養(yǎng)瓶中，加入新鮮配制的含10%胎牛血清和1%青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置37℃5% CO2實驗條件下培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察，實時拍攝記錄結(jié)果。

1.5 多重PCR和測序技術(shù)鑒定鼠管狀線蟲

為了后續(xù)鼠管狀線蟲DNA條形碼分子鑒定體系的建立，本研究選定的靶標(biāo)基因是鼠管狀線蟲內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）、28S核糖體RNA（28 S ribosomal RNA，28 S rRNA）、NADH脫氫酶亞單位1（NADH dehydrogenase subunits 1，nad1）和細(xì)胞色素C過氧化物酶亞基1（cytochrome c oxidase subunit 1，cox1）基因，設(shè)計合成四對引物（表1）。建立優(yōu)化多重PCR檢測體系和反應(yīng)條件，進(jìn)行特異性、靈敏性、穩(wěn)定性試驗和方法評價驗證，應(yīng)用于SPF和清潔動物鼠管狀線蟲檢測。將直接鏡檢實時動態(tài)顯微視屏攝錄技術(shù)檢出，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為鼠管狀線蟲的單個蟲卵、幼蟲、雌性成蟲和雄性成蟲，提取DNA。分別以抽提的蟲卵、幼蟲和成蟲DNA為模板，同時用已知鼠管狀線蟲、四翼無翅線蟲（AsPiculuris tetraPtera）、隱匿管狀線蟲（SyPhacia obvelata）基因組DNA作陽性和陰性對照。鼠管狀線蟲PCR檢測總反應(yīng)體系為50 μL，包括5.0 μL 10 ×buffer（Mg2+Plus）、4.0 μL dNTP mixture、各0.5 μL正反向引物、0.25 μL EX Taq、2.0 μL模板DNA、37.75 μL nuclease-free water。循環(huán)參數(shù)：95℃1 min 1 cycle；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，40 cycles；72℃ 10 min 1 cycle。瓊脂糖凝膠電泳檢測多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。提取SPF和清潔動物樣本DNA，作為模板DNA同上進(jìn)行多重PCR檢測。陽性樣本進(jìn)一步作多基因測序鑒定。

表1 鼠管狀線蟲多重PCR引物Tab.1 Multiplex-PCR primers of SyPhacia muris

2 結(jié)果

2.1 直接鏡檢實時動態(tài)顯微視屏攝錄技術(shù)檢測和形態(tài)學(xué)鑒定鼠管狀線蟲結(jié)果

鏡下可見：許多細(xì)小、乳白色蟲體游走蠕動，雌蟲較活潑且個體比雄蟲大，同時可見處于不同發(fā)育階段的幼蟲和蟲卵。雌蟲長2.8～4.0 mm，口孔在蟲體頭部頂端，有3片唇瓣環(huán)繞，頭端的角皮向周圍膨起形成頭翼，食管下部膨大成球狀（圖1A），陰門開口于蟲體前1/4處的腹側(cè)，陰門上方為一較長的陰道，陰道與前后排列的2根子宮相接，交配后有雄蟲射精管腺體分泌的棕黃色物質(zhì)栓塞雌蟲陰門，子宮與輸卵管、卵巢相接，內(nèi)部充滿卵（圖1B），蟲體中部膨大，尾端直而尖細(xì)，肛門開口于蟲體后1/6處（圖1C）。雄蟲長1.2～1.3 mm，射精管與直腸末端共同構(gòu)成泄殖腔，經(jīng)肛門通向外界，尾端明顯向腹側(cè)彎曲，尾端有引帶、交合刺，尾端角皮上有乳突（圖1D）。蟲卵大小為（72～82）μm×（25～36）μm，無色透明，殼薄，兩側(cè)稍不對稱，一側(cè)扁平，一側(cè)隆起，呈腎形，內(nèi)含物為發(fā)育中的幼蟲，在卵一端的凹面有一粗糙小區(qū)，是幼蟲孵化出口或稱卵蓋（圖1E）。依據(jù)雌雄成蟲、幼蟲的形態(tài)、大小、構(gòu)造和蟲卵的大小、形狀、顏色、卵殼、內(nèi)含物特征，鑒定為鼠管狀線蟲。應(yīng)用實時動態(tài)顯微視屏攝錄直接鏡檢技術(shù)檢測和形態(tài)學(xué)鑒定鼠管狀線蟲，結(jié)果從5199份SPF動物樣本中分離鑒定獲得285份鼠管狀線蟲活體陽性樣本，陽性率5.5%（285/5199）；從1389份清潔動物樣本中分離鑒定獲得135份鼠管狀線蟲活體陽性樣本，陽性率9.7%（135/1389）。自SPF和清潔動物中分離獲得，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為鼠管狀線蟲的活體陽性樣本中，精心挑選出形態(tài)完整、特征典型的新鮮的鼠管狀線蟲單個蟲卵、幼蟲、雌性成蟲和雄性成蟲，特殊方法固定，保存?zhèn)溆谩Ｔ谘芯恐?，筆者發(fā)現(xiàn)了一些動物個體同時自然感染鼠管狀線蟲與其他種屬寄生蟲（如：隱匿管狀線蟲、四翼無刺線蟲、鞭毛蟲、纖毛蟲、體外寄生蟲）的現(xiàn)象（另文報道）。形態(tài)學(xué)鑒定經(jīng)驗不足者極易將鼠管狀線蟲誤判為隱匿管狀線蟲，筆者鑒別二蟲要點(diǎn)有五：第一，蟲卵：兩者均呈腎形，但前者較小且兩端鈍圓，后者較大且兩端尖銳；第二，成蟲：前者雌雄成蟲個體均小于后者，前者雌蟲陰門在蟲體前1/4處，交配后陰門有栓塞，而后者在蟲體前1/6處，陰門前后緣均有唇狀隆起；第三，蟲體頭端：前者角皮向周圍膨起形成頭翼，后者頸翼膜窄小而平緩；第四：食道：兩者食道前部皆為棒狀，但前者食管下部膨大如容量瓶樣球形，而后者恰似燒瓶樣球狀；第五，蟲體：前者中部膨大而尾部直且尖細(xì)，后者中部勻稱而尾部長且細(xì)尖。

2.2 鼠管狀線蟲離體生存能力試驗結(jié)果

對鼠管狀線蟲培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)：37℃5%CO2實驗條件下，鼠管狀線蟲離體至少能存活10 d。第2天時，鼠管狀線蟲的幼蟲可見包絡(luò)鞘，說明蛻皮發(fā)生。第3天，雌雄特征已清晰可辨。第4天，雌性成蟲陰門有深色陰道栓塞封閉，表明已發(fā)生交配。第5天，雄性成蟲行動遲緩出現(xiàn)死亡，雌性成蟲子宮中可見少量蟲卵。第6天，雌性成蟲子宮中可見大量蟲卵。第7天，雌性成蟲子宮中充滿成熟的卵。第8天，妊娠的雌性成蟲在暴露的空氣中產(chǎn)卵。第9天，產(chǎn)卵后的雌蟲形體萎縮死亡，蟲卵中含有發(fā)育完全的、活動的、有感染性的幼蟲。

圖1 中國SPF和清潔動物鼠管狀線蟲鏡檢形態(tài)（A：雌性成蟲前部；B：雌性成蟲腹部；C：雌性成蟲尾部；D：雄性成蟲尾部；E：蟲卵）Fig.1 Microscopic morphology of SyPhacia muris isolated from SPF and clean animals in China. A，Anterior portion of a female adult；B，Ventral side of a female adult；C，Posterior portion of a female adult；D，Posterior portion of a male adult；E，egg）

2.3 多重PCR和測序技術(shù)鑒定鼠管狀線蟲結(jié)果

對鼠管狀線蟲蟲卵、幼蟲、成蟲DNA分別進(jìn)行多重PCR檢測，結(jié)果在單個蟲卵、幼蟲、雌性成蟲和雄性成蟲DNA樣本中，均可檢出鼠管狀線蟲靶標(biāo)基因ITS（702 bp）、28S rRNA（507 bp）、nad1（396 bp）和cox1（296 bp）特異性目的片段，而作為陰性對照的四翼無翅線蟲、隱匿管狀線蟲卻未見特異性片段。將目的條帶回收純化后進(jìn)行測序鑒定。將所獲得的鼠管狀線蟲多基因測序數(shù)據(jù)，在線提交NCBI，通過BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示本研究分離獲得的鼠管狀線蟲靶標(biāo)基因ITS、28 S rRNA、nad1和cox1序列，與國際上已公布的不同國家不同來源的鼠管狀線蟲ITS、28 S rRNA、nad1和cox1基因核苷酸同源性達(dá)99% ～100%（GenBank登錄號為 EU263106.2、AB500174.1、HM204802.1和HM204808.1）。多重PCR和測序技術(shù)從基因角度證明了實驗動物鼠管狀線蟲感染。多重PCR和測序技術(shù)檢測鼠管狀線蟲結(jié)果與直接鏡檢實時動態(tài)顯微視屏攝錄技術(shù)檢測鼠管狀線蟲結(jié)果相一致。研究結(jié)果說明應(yīng)用直接鏡檢實時動態(tài)顯微視屏攝錄技術(shù)聯(lián)合多重PCR和測序技術(shù)，能夠快速檢測精準(zhǔn)鑒定鼠管狀線蟲。

本研究應(yīng)用該技術(shù)對我國SPF和清潔動物的鼠管狀線蟲自然感染進(jìn)行了監(jiān)測，檢測5199只SPF動物（包括：5只猴，25只小型豬，55只兔，248只地鼠，198只豚鼠，459只大鼠，4139只小鼠，25只雞，5只鴨），檢測結(jié)果顯示，SPF動物的鼠管狀線蟲陽性檢出率為5.5%（285/5199），其中：SPF豚鼠、大鼠和小鼠的鼠管狀線蟲感染率分別為2%（4/198）、12.4%（57/459）和5.4%（224/4179），而SPF猴、小型豬、兔、地鼠、雞和鴨未檢出鼠管狀線蟲；檢測1389只清潔級動物（包括：3只兔，31只地鼠，157只豚鼠，268只大鼠，930只小鼠），檢測結(jié)果顯示，清潔動物鼠管狀線蟲陽性檢出率為9.7%（135/ 1389），其中：清潔豚鼠、大鼠和小鼠的鼠管狀線蟲感染率分別為5.1%（8/157）、10.8%（29/268）和10.5%（98/930），而清潔兔、地鼠未檢出鼠管狀線蟲（表2）。

表2 中國SPF和清潔動物鼠管狀線蟲感染監(jiān)測結(jié)果Tab.2 Prevelance of SyPhacia muris infestation in SPF and clean animals in China

3 討論

鼠管狀線蟲生活史屬直接型，感染期蟲卵被宿主攝食后，在十二指腸內(nèi)經(jīng)消化液的作用，幼蟲孵出，沿小腸下行，經(jīng)幾次蛻皮發(fā)育為成蟲。成蟲寄生在盲腸、結(jié)腸及回腸下部，重度感染時可達(dá)胃和食管等處。雌、雄蟲交配后，雄蟲很快死亡并排出體外，故宿主腸道內(nèi)雌蟲數(shù)比雄蟲多。雌蟲在腸道內(nèi)低氧、溫度及pH等影響下不排卵或僅排少量卵。而在宿主睡眠時肛門括約肌處于松弛狀態(tài)下，妊娠雌蟲便乘機(jī)移行至肛門外，受肛周溫濕度及氧氣的刺激，蟲體頭尾交替收縮蠕動，子宮發(fā)生強(qiáng)有力的收縮，瞬間排出大量蟲卵。粘附在肛周的蟲卵6 h后發(fā)育成熟，蛻皮1次后成為感染期蟲卵，卵細(xì)胞內(nèi)是發(fā)育完全的、活動的、有感染性的幼蟲。排卵后的雌蟲或孵化出的幼蟲可經(jīng)肛門逆行進(jìn)入腸內(nèi)或鉆入陰道、尿道內(nèi)引起新的感染［9-12］。蟲卵輕得可以漂浮在空氣中，造成大面積的環(huán)境污染［13］。蟲卵可經(jīng)空氣中的粉塵、污染的設(shè)備、動物和人進(jìn)行傳播。Stone［14］報道美國研究人員在兒童和猴子的糞便中檢出鼠管狀線蟲卵。Lytvynets［15］報道捷克實驗動物繁育設(shè)施中的灰塵、空調(diào)、飼養(yǎng)籠和技術(shù)人員手的鼠管狀線蟲卵檢出率分別為7.6%、28.7%、50.8%和37.9%。鼠管狀線蟲卵高度耐受各種環(huán)境因素如低溫、干燥和消毒劑［16］，一旦污染不易去除。Meade［17］報道鼠管狀線蟲卵在外界環(huán)境中暴露7個月依然具有活力。本文作者在37℃5%CO2實驗條件下研究發(fā)現(xiàn)，鼠管狀線蟲可在體外存活近十天。本研究獲得的鼠管狀線蟲可作為模式生物，用于抗寄生蟲藥物篩選研究，也可作為人類寄生蟲病動物模型制備材料，進(jìn)一步開展該蟲的致病機(jī)理研究。

鼠管狀線蟲的自然感染在世界各地流行。Tung等［18］報道臺灣野生大鼠的鼠管狀線蟲感染率為28.6%。Paramasvaran等［19］報道馬拉西亞野生大鼠的鼠管狀線蟲感染率為17.6%。Kataranovski等［20］報道南斯拉夫野生大鼠的鼠管狀線蟲感染率為7.4%。Sharma等［21］報道印度野生大鼠和小鼠的鼠管狀線蟲感染率分別為 6.97% 和 8.57%。Kamranrashani等［22］報道伊朗野生小鼠的鼠管狀線蟲感染率為2.89%。Hayashimoto等［23，24］報道日本實驗小鼠和寵物小鼠鼠管狀線蟲感染率分別為6.2%和46.4%。Hussey等［25］報道美國實驗鼠鼠管狀線蟲感染率為100%。Beyhan等［26］報道土耳其實驗大鼠和小鼠的鼠管狀線蟲感染率均為100%。我們的研究調(diào)查結(jié)果顯示：我國SPF和清潔動物鼠管狀線蟲感染率分別為5.5%和9.7%，其中：SPF豚鼠、大鼠和小鼠的鼠管狀線蟲感染率分別為2%、12.4%和5.4%；清潔豚鼠、大鼠和小鼠的鼠管狀線蟲感染率分別為5.1%、10.8%和10.5%。實驗動物寄生蟲感染對人類寄生蟲感染起一定的儲存和傳播作用，在流行病學(xué)上具有重要意義。即使當(dāng)下進(jìn)行的胚胎干細(xì)胞移植也并不能消除所有的感染性的病原體［27］。人獸共患病名錄中人獸共患寄生蟲病69種，我國存在60種［28-30］。最近我國時有SPF或清潔動物因人獸共患寄生蟲感染致病或致死的報道［31-33］。當(dāng)前，我國實驗動物感染人獸共患寄生蟲的現(xiàn)狀不容樂觀。實驗動物攜帶的人獸共患寄生蟲，不僅會污染環(huán)境、飲水、食品、空氣，同時也會對人類健康造成危害，已污染的實驗動物用于食品藥品生物制品醫(yī)療器械檢定或動物種質(zhì)資源收集保存分發(fā)后果不堪設(shè)想。因此，各實驗動物種子中心承擔(dān)單位和動物繁育生產(chǎn)單位一定要高度重視人獸共患寄生蟲病原體的生物安全性問題，切實落實自查抽查工作，及時發(fā)現(xiàn)并處理被污染的動物、糞便、墊料、飼料、飲水、籠器具、通風(fēng)排氣系統(tǒng)，徹底殺滅病原體并作無害化處理，避免污染公共水源和周邊環(huán)境，要認(rèn)真查找、嚴(yán)格控制并切斷污染源，強(qiáng)化公共衛(wèi)生安全防控意識，保證動物質(zhì)量，保障人員安全，保護(hù)生態(tài)環(huán)境。

目前，直接檢查腸道內(nèi)容物仍是蠕蟲檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其局限性是安樂死動物［34］。肛周膠帶法可檢測宿主肛周粘附的蟯蟲卵，但漏檢率較高［35］。糞便漂浮法常用于檢測產(chǎn)糞量較大的動物糞便中蟲卵，不太適合實驗動物［36］。Parel等［37］曾用ITS2區(qū)PCR-RFLP鑒定鼠管狀線蟲，PCR擴(kuò)增后再進(jìn)行酶切和電泳，操作繁瑣且易污染。Leblanc等［38］曾在蟯蟲通用引物PCR中得到了假陽性結(jié)果。Dole等［39］曾認(rèn)為PCR檢蟲卵比糞檢法靈敏，但后來在PCR檢測陰性樣本中竟然發(fā)現(xiàn)了活的蟲體，提示單純PCR方法不適合感染性的寄生蟲病原體檢測。本研究中，我們將直接鏡檢實時動態(tài)顯微視屏攝錄技術(shù)和形態(tài)學(xué)鑒定方法聯(lián)合多重PCR和測序技術(shù)應(yīng)用于鼠管狀線蟲的快速檢測和分子鑒定，進(jìn)行了方法學(xué)研究和驗證，并對動物鼠管狀線蟲感染情況進(jìn)行了監(jiān)測，對鼠管狀線蟲篩查和確認(rèn)的有效性進(jìn)行了評價。應(yīng)用多重PCR能夠檢測出單個鼠管狀線蟲卵、幼蟲、雌性成蟲和雄性成蟲DNA，經(jīng)多基因測序技術(shù)鑒定出鼠管狀線蟲靶標(biāo)基因ITS、28S rRNA、nad1和cox1，與其他不同種屬的寄生蟲無交叉反應(yīng)，尤其是形態(tài)學(xué)鑒定上與鼠管狀線蟲容易混淆的隱匿管狀線蟲和四翼無刺線蟲，表明：多重PCR結(jié)合測序技術(shù)檢測鑒定鼠管狀線蟲具有較高的靈敏度和特異性。對直接鏡檢實時動態(tài)顯微視屏攝錄技術(shù)檢出，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為活體鼠管狀線蟲的285份SPF和135份清潔動物陽性樣本，分別提取DNA后，用多重PCR檢測，均能獲得預(yù)期目的條帶，陽性樣本測序證實獲得的是鼠管狀線蟲靶標(biāo)基因ITS、28S rRNA、nad1和cox1。測序結(jié)果顯示，不同SPF和清潔動物分離獲得的鼠管狀線蟲的ITS、28S rRNA、nad1和cox1基因核苷酸相似性達(dá)100%。應(yīng)用多重PCR和測序技術(shù)檢測SPF和清潔動物樣本中的鼠管狀線蟲，結(jié)果分別檢出285份和135份陽性，SPF和清潔動物鼠管狀線蟲陽性率分別為5.5%（285/5199）和9.7%（135/1389）。診斷靈敏度二者無差異。直接鏡檢實時動態(tài)顯微視屏攝錄技術(shù)通過形態(tài)學(xué)鑒定鼠管狀線蟲聯(lián)合多重PCR和測序技術(shù)通過基因分析方法鑒定鼠管狀線蟲的分子驗證結(jié)果相吻合，顯示多重PCR和測序技術(shù)檢測鑒定鼠管狀線蟲的特異性，提示今后可將ITS、28 S rRNA、nad1和cox1基因作為鼠管狀線蟲快速檢測精準(zhǔn)識別的分子靶標(biāo)，有效擴(kuò)展目前檢疫檢測方法和常規(guī)健康監(jiān)測途徑，為國家標(biāo)準(zhǔn)修訂提供技參考依據(jù)和技術(shù)支撐，獲得的多基因位點(diǎn)數(shù)據(jù)可用于鼠管狀線蟲遺傳多樣性研究，為進(jìn)一步開展分子流行病學(xué)調(diào)查奠定基礎(chǔ)。

歐洲實驗動物學(xué)會聯(lián)合會制定了統(tǒng)一的歐洲標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定腸道蠕蟲是實驗動物要求檢測的病原體［40］。日本中央實驗動物研究所實驗動物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定必檢蟯蟲。隨著中國社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和國內(nèi)外交流合作的增加，實驗動物在諸多領(lǐng)域中的作用日益重要，因此，適應(yīng)全球經(jīng)濟(jì)一體化，研究國外標(biāo)準(zhǔn)，以我國實驗動物寄生蟲監(jiān)測調(diào)研基礎(chǔ)數(shù)據(jù)作為科學(xué)依據(jù)，修訂完善國家標(biāo)準(zhǔn)顯得非常必要，這需要我們今后繼續(xù)開展更多確定的研究予以支持。

綜上所述，直接鏡檢實時動態(tài)顯微視屏攝錄技術(shù)和形態(tài)學(xué)鑒定聯(lián)合多重PCR及測序技術(shù)可有效應(yīng)用于鼠管狀線蟲感染的快速檢定和感染監(jiān)測中。本研究首次對中國SPF和清潔動物的鼠管狀線蟲進(jìn)行了分子鑒定和感染調(diào)查，整體而言調(diào)查的面還不夠?qū)拸V，還需要擴(kuò)大樣本的容量和豐度，以獲得更全面的監(jiān)測數(shù)據(jù)。鼠管狀線蟲作為一種重要的人獸共患病病原，其對動物質(zhì)量和人類健康造成的危害不容忽視，今后一定要加強(qiáng)人獸共患病的防控工作，聯(lián)合使用多種技術(shù)精準(zhǔn)科學(xué)做好監(jiān)測工作，切實保護(hù)人民生命健康，保障人民用藥安全。

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〔修回日期〕2016-02-19

【中圖分類號】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）06-0067-08

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.06.013

［基金項目］國家科技支撐計劃（No.2013BAK11B03）。

［作者簡介］高正琴，副研究員，研究方向：病原生物學(xué)和快檢新技術(shù)研究。

［通訊作者］岳秉飛，研究員，研究方向：實驗動物學(xué)。monkeys，3 batches of 25 mini-pigs，28 batches of 55 rabbits，13 batches of 248 hamsters，37 batches of 198 guinea pigs，93 batches of 459 rats，742 batches of 4179 mice，5 batches of 25 chickens and one batch of 5 ducks）and 145 batches of 1389 clean animals（including one batch of 3 rabbits，4 batches of 31 hamsters，16 batches of 157 guinea pigs，32 batches of 268 rats and 92 batches of 930 mice）came from 50 different manufactures in China.Direct microscopy real-time dynamic video recording techniques in combination with morphological identification method were applied to screen the SyPhacia muris infestation.A multiple polymerase chain reaction（multiple-PCR）testing of the isolate based on amplification of the conserved portions of the SyPhacia muris internal transcribed spacer（ITS），28S ribosomal RNA（28S rRNA），NADH dehydrogenase subunits 1（nad1）and cytochrome c oxidase subunit 1（cox1）genes，and the molecular sequencing of the multiple-PCR amplicons was used to confirm the SyPhacia muris infection.Results SyPhacia muris eggs，larvae and adults were detected by using direct microscopy real-time dynamic video recording technique.SyPhacia muris were detected based on the morphology and size of ovum，larvae，and female and male adult worms.Multiple-PCR and sequencing were performed to identify ITS，28S rRNA，nad1 and cox1 genes of DNA extracted from the single egg，larva and adult parasite SyPhacia muris.This approach allowed the specific identification with no amplicon being amplified from heterogeneous DNA samples，and sequencing confirmed the identity of the amplified sequences.Molecular characterization by multiple-PCR amplification and sequencing of the ITS，28S rRNA，nad1 and cox1 genes demonstrated the presence of SyPhacia muris.Multiple-PCR followed by sequencing confirmed 285 of 5199 SPF and 135 of 1389 clean animal samples classified as positive by using direct microscopy real-time dynamic video recording technique in the study as containing SyPhacia muris-sPecific DNA.Comparison of the partial sequences of the ITS，28S rRNA，nad1 and cox1 genes revealed 100%similarity amongst SyPhacia muris from different animals.The prevalence of SyPhacia muris infection in SPF and clean animals were 5.5% （285/5199）and 9.7% （135/1389），respectively.Conclusions Direct microscopy realtime dynamic video recording technique，multiple-PCR and sequencing can be used to rapidly detect and accurately identify SyPhacia muris.The zoonotic nature of SyPhacia muris can be regard as a public health alter，hence the good quality control of animal has an important role in protecting human health and safeguarding people safety.This is the first molecular identification and infection investigation of SyPhacia muris in SPF and clean animals in China.

Prevalence and molecular identification of Syphacia muris in laboratory animals in China

GAO Zheng-qin，LI Xiao-bo，F(xiàn)ENG Yu-fang，WANG Ji，F(xiàn)U Rui，XING Jin，WANG Shu-jing，WEI Jie，WANG Hong，GONG Wei，LI Guan-min，HE Zheng-ming，YUE Bing-fei
（National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

【Abstract】Objective To acquire the prevalence and molecular identification data on SyPhacia muris and provide reference for the revision of national standard.Methods 923 batches of 5199 SPF animals（including one batch of 5

【Key words】laboratory animal，SyPhacia muris，Molecular identification，Infection investigation