辛伐他汀不同干預(yù)方案對骨質(zhì)疏松大鼠骨質(zhì)量的影響

劉 昊，張 巖，張國彬2，邢 磊，賈忠寶2，田發(fā)明3

（華北理工大學(xué)1附屬醫(yī)院；2研究生學(xué)院；3醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心；唐山063000）

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辛伐他汀不同干預(yù)方案對骨質(zhì)疏松大鼠骨質(zhì)量的影響

劉 昊1，張 巖1，張國彬2，邢 磊1，賈忠寶2，田發(fā)明3

（華北理工大學(xué)1附屬醫(yī)院；2研究生學(xué)院；3醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心；唐山063000）

【摘要】目的 探討和比較不同干預(yù)方案下辛伐他汀對去卵巢大鼠骨丟失和骨質(zhì)量下降的干預(yù)效果。方法 3月齡雌性SD大鼠32只，隨機(jī)分為4組，每組8只：假手術(shù)（A）組、卵巢切除（B）組、卵巢切除加辛伐他汀前半程干預(yù)組（C）和后半程干預(yù)組（D）。除A組接受假手術(shù)外，其余各組大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，C組于術(shù)后給予辛伐他汀（5 mg/kg/d）干預(yù)10周后停藥，D組于術(shù)后10周開始接受辛伐他汀干預(yù)。術(shù)后20周處死所有大鼠，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測血清I型前膠原氨基端前肽（PINP）、I型膠原羧基端交聯(lián)端肽（ICTP）水平，取第3、4、5腰椎，雙能X線法檢測大鼠第3腰椎骨密度，壓縮試驗(yàn)檢測第4腰椎側(cè)最大載荷、彈性模量等生物力學(xué)指標(biāo)，微計算機(jī)斷層掃描技術(shù)（micro-CT）檢測第5腰椎松質(zhì)骨骨量和微觀結(jié)構(gòu)。結(jié)果 （1）血清學(xué)檢測結(jié)果：B、C、D組PINP 和ICTP均顯著高于A組；（2）骨密度：B組顯著低于其余各組，C、D組顯著低于A組（P＜0.05）；（3）生物力學(xué)：最大載荷、彈性模量B組顯著低于其余3組（P＜0.05）、C、D組顯著低于A組（P＜0.05）；4、micro-CT：A組骨容積率（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）顯著高于其余3組，骨小梁分離度（Tb.Sp）顯著低于其余3組（P＜0.05），C、D組Tb.Sp顯著低于B組（P＜0.05）。結(jié)論 大鼠去卵巢20周后發(fā)生明顯骨量丟失和骨質(zhì)量下降，選擇前半程干預(yù)和后半程干預(yù)均能部分阻止該模型骨量丟失、微結(jié)構(gòu)退變和力學(xué)性能下降，但骨密度均不能恢復(fù)到正常水平。

【關(guān)鍵詞】辛伐他??；骨質(zhì)疏松；骨密度；生物力學(xué)；Micro-CT

辛伐他汀是3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A，HMG-CoA）還原酶抑制劑家族成員之一，通過抑制膽固醇合成鏈中的限速酶HMG-CoA還原酶，減少膽固醇合成，目前臨床上主要用于治療高脂血癥。1999年Mundy等［1］首次通過藥物篩選報道了辛伐他汀具有促進(jìn)骨形成的作用潛能，此后大量研究開始關(guān)注辛伐他汀的成骨作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同干預(yù)方式辛伐他汀促骨形成作用效果差異顯著［2-6］。其中以體內(nèi)給藥干預(yù)的實(shí)驗(yàn)中結(jié)果的爭議較多。雖然有部分研究肯定了辛伐他汀系統(tǒng)性給藥的作用潛能［4］，但也有臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，未能發(fā)現(xiàn)辛伐他汀顯著的促進(jìn)成骨作用，則對此提出了質(zhì)疑［5，6］。本研究在同一實(shí)驗(yàn)中采用不同干預(yù)方案，觀察兩者對卵巢切除造成的大鼠骨質(zhì)疏松模型干預(yù)效果及其差別，以期為后續(xù)相關(guān)研究乃至臨床應(yīng)用提供理論參考和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與設(shè)備

本研究應(yīng)用3月齡清潔級雌性SD大鼠32只，（購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號SCXK（京）2013-0002號）體重（250±20）g，動物使用許可證號SYXK（冀）2010-0038。辛伐他?。ㄎ髦_(dá)，浙江瑞邦藥業(yè)有限公司生產(chǎn)），酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（上海史瑞可生物科技有限公司），骨密度分析儀（美國Norland公司），AG-IS型生物力學(xué)分析系統(tǒng)（日本島津公司）。

1.2 動物分組及處理

所有大鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，每組8只：假手術(shù)組（Sham）只暴露卵巢，不予切除，直接縫合；其余大鼠接收雙側(cè)卵巢切除術(shù)，方法參照以往研究［7-12］。術(shù)后給予抗生素3 d，卵巢切除（B）組、卵巢切除加辛伐他汀前半程干預(yù)組（C）和后半程干預(yù)組（D）。除A組接受假手術(shù)外，其余各組大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，B組為模型對照組，C組于術(shù)后給予辛伐他?。? mg/kg.d）灌胃干預(yù)10周后停藥，D組于術(shù)后10周開始接受辛伐他汀干預(yù)。術(shù)后20周處死所有大鼠，采用ELISA法檢測血清骨代謝標(biāo)志物水平，取第3、4、5腰椎，雙能X線法檢測大鼠第3腰椎骨密度，壓縮試驗(yàn)檢測第4腰椎側(cè)最大載荷、彈性模量等生物力學(xué)指標(biāo)，微計算機(jī)斷層掃描技術(shù)（microcomputed tomography，micro-CT）檢測第5腰椎松質(zhì)骨骨量和微觀結(jié)構(gòu)。

1.3 ELISA檢測血清骨代謝指標(biāo)

參照試劑盒說明，采用ELISA法檢測血I型前膠原氨基端前肽（procollagen type I N-terminal propeptide，PINP）、I型膠原羧基端交聯(lián)端肽（crosslinked C-telopeptides of type I collagen，ICTP）血清含量。

1.4 骨密度分析

應(yīng)用 Norland-XR36雙能 X線吸收測量 （dual energy X-ray absorptiometre，DEXA）骨密度儀，采用小物體掃描模式，準(zhǔn)確度0.01%，掃描速度60 mm/ s，分辨率（resolution）1.0 mm ×1.0 mm，掃描寬度5.0 cm的參數(shù)值，檢測第3腰椎，采用小動物掃描模式進(jìn)行掃描。掃描結(jié)束后，用儀器自選工具選定興趣區(qū)，讀出每個標(biāo)本的骨密度值。

1.5 生物力學(xué)分析

參照以往研究［12］，于實(shí)驗(yàn)開始前去除第4腰椎椎體所有附件，包括橫突、上下關(guān)節(jié)突、椎弓根及椎板等附件，僅保留椎體組織。并將椎體上下面進(jìn)行打磨，制作成高度約為5 mm的標(biāo)準(zhǔn)件，椎體上下面應(yīng)與椎體縱軸垂直。假設(shè)椎體為圓柱形，并根據(jù)每個椎體的前后徑，計算出標(biāo)準(zhǔn)件的平均直徑和體界面積。用膠水將椎體下端固定于測試平臺上，以5 mm/min的速度進(jìn)行椎體軸向壓縮，直至椎體出現(xiàn)斷裂，記錄并分析最大壓縮載荷及彈性模量。取所有大鼠的右側(cè)股骨行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，支點(diǎn)跨距（L）為20 mm，中央垂直（股骨與載荷成90°角）施加載荷，速率10 mm/min，直至股骨斷裂，記錄并分析最大壓縮載荷及彈性模量。

1.6 Micro-CT檢測

應(yīng)用 SkyScan 1076Micro-CT（SkyScan，Aartselaar，Belgium）對第5腰椎體進(jìn)行掃描檢測，在40 k Vp及250 μA的條件下對標(biāo)本進(jìn)行掃描，收集數(shù)據(jù)，并利用Micro-CT配套軟件對掃描圖像進(jìn)行三維重建及結(jié)果分析。興趣區(qū)為上端生長板下1 mm至4 mm，直徑為1.5 mm的圓柱體（皮質(zhì)骨內(nèi)側(cè)的松質(zhì)骨）。檢測指標(biāo)有：骨容積率（bone volume fraction，BV/TV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁數(shù)量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁分離度（trabecular separation，Tb.Sp）。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立Excel數(shù)據(jù)庫，資料用SPSS 19.0來處理。各組數(shù)據(jù)經(jīng)過Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)和Bartlett方差齊次檢驗(yàn)后，利用單因素方差分析比較各組之間的差異，LSD-t檢驗(yàn)比較兩組間差異，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 動物死亡情況

A組無大鼠死亡，B組有1只大鼠因腹脹死亡、C組有2只大鼠分別因?yàn)楦腥竞筒幻髟蛩劳?，D組有1只大鼠因麻醉死亡，最終各組分別有8、7、6、7只動物納入最終結(jié)果。

2.2 血清學(xué)檢測結(jié)果

PINP血清水平：A組PINP血清水平均顯著低于其余三組（P＜0.05）；C、D高于B組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；

ICTP血清水平：A組ICTP血清水平均顯著低于其余三組（P＜0.05）；C、D低于B組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

2.3 骨密度

表2示各組第3腰椎骨密度檢測結(jié)果比較：B組顯著低于其余各組（P＜0.05），C、D組顯著低于A組（P＜0.05），與B組比較，C、D組骨密度分別提高6.16%和4.94%；C組高于D組，但差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 生物力學(xué)

表3示生物力學(xué)檢測結(jié)果：各組間比較，第4腰椎最大載荷和彈性模量差異趨勢相同：B組顯著低于其余3組（P＜0.05），C、D組顯著低于A組（P＜0.05），與B組相比，C組最大載荷和彈性模量分別提高45.1%和44.2%，D組最大載荷和彈性模量分別提高了38.4%和40.88%。

2.5 micro-CT檢測結(jié)果

表4示micro-CT分析結(jié)果：BV/TV：A組顯著高于其余各組（P＜0.05），C、D高于B組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；Tb.Th：由高到低依次為A、C、D、B組，但各組間比較差別均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；Tb. N：A組顯著高于B組（P＜0.05），其余組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；Tb.Sp：A組顯著低于其余各組（P＜0.05），C、D組顯著低于B組（P＜0.05）。三維重建結(jié)果見圖1。

表1 血清學(xué)檢測結(jié)果（±s）Tab.1 Results of serum PINP and ICTP analysis（±s）

表1 血清學(xué)檢測結(jié)果（±s）Tab.1 Results of serum PINP and ICTP analysis（±s）

*與A組比較P＜0.05

后半程干預(yù)組（D）（n=7）I型前膠原氨基端前肽PINP（μg/L）　95.17±13.81　170.83±14.43*　176.33±19.78*　175.50±8.66*I型膠原羧基端交聯(lián)端肽ICTP（μg/L）　3.13±0.43　4.52±0.31*　4.35±0.19*　4.20±0.43*假手術(shù)組　卵巢切除組　卵巢切除加辛伐他項(xiàng)目Items （A）（n=8）（B）（n=7）汀前半程干預(yù)組（C）（n=6）

表2 骨密度檢測結(jié)果（±s，n=8）Tab.2 Results of BMD test（±s，n=8）

表2 骨密度檢測結(jié)果（±s，n=8）Tab.2 Results of BMD test（±s，n=8）

Note.*P＜0.05 vs.the group A；#P＜0.05 vs.the group B.

后半程干預(yù)組（D）（n=7）L3（g/cm2）　0.2743±0.0085　0.2367±0.0069*　0.2513±0.0079*#　0.2484±0.0076*#項(xiàng)目Items　　假手術(shù)組（A）（n=8）卵巢切除組（B）（n=7）卵巢切除加辛伐他汀前半程干預(yù)組（C）（n=6）

表3 生物力學(xué)檢測結(jié)果（±s，n=8）Tab.3 Results of biomechanical test.（±s，n=8）

表3 生物力學(xué)檢測結(jié)果（±s，n=8）Tab.3 Results of biomechanical test.（±s，n=8）

Note.*P＜0.05 vs.the group A；#P＜0.05 vs.the group B.

后半程干預(yù)組（D）（n=7）最大載荷（N）　197.2±18.1　121.5±16.4*　176.3±24.9*#　168.2±16.8*#彈性模量（MPa）　815.0±57.7　479.5±76.0*　691.2±70.29*#　675.5±32.6*#項(xiàng)目Items　　假手術(shù)組（A）（n=8）卵巢切除組（B）（n=7）卵巢切除加辛伐他汀前半程干預(yù)組（C）（n=6）

表4 micro-CT檢測結(jié)果（±s，n=8）Tab.4 Results of micro-CT measurement.（±s，n=8）

表4 micro-CT檢測結(jié)果（±s，n=8）Tab.4 Results of micro-CT measurement.（±s，n=8）

Note.*P＜0.05 vs.the group A；#P＜0.05 vs.the group B.

項(xiàng)目Items后半程干預(yù)組（D）（n=7）骨容積率BV/TV　26.13±2.10　19.83±2.24*　22.35±2.35*　21.38±2.26*骨小梁厚度Tb.Th　105.26±6.0　99.62±5.52　102.79±3.26　100.64±4.51骨小梁數(shù)量Tb.N　2.36±0.30　1.88±0.38*　2.12±0.39　2.11±0.34骨小梁分離度Tb.Sp　236.13±28.80　358.08±43.79*　294.33±26.30*#　305.83±51.90*#假手術(shù)組（A）（n=8）卵巢切除組（B）（n=7）卵巢切除加辛伐他汀前半程干預(yù)組（C）（n=6）

A，假手術(shù)組；B，卵巢切除組；C，前半程干預(yù)組；D，后半程干預(yù)組圖1 L5 Micro-CT三維重建圖A，Sham group；B，OVX group；C，first half period treated group；D，latter half period treated group Fig.1 Reconstruction of micro-CT images of L5 vertebrae

3 討論

雙側(cè)卵巢切除大鼠因雌激素衰退導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)換水平增高，且骨吸收活性更加活躍，導(dǎo)致骨量丟失，其表現(xiàn)與人類絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松相似，也因此成為目前最為常用的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動物模型［7-12］。本研究在證實(shí)雌性大鼠卵巢切除后20周發(fā)生明顯的骨量丟失、微觀結(jié)構(gòu)退變和生物力學(xué)性能下降的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)辛伐他汀兩種干預(yù)方式，即前半程干預(yù)和后半程干預(yù)均可部分阻止該模型大鼠骨量丟失、微結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)性能退變，但骨密度均不能恢復(fù)至正常水平。

目前國內(nèi)外針對辛伐他汀成骨潛能的研究大致分為系統(tǒng)性干預(yù)、局部用藥以及體外刺激細(xì)胞三種，其中局部用藥干預(yù)［2，3，13］及體外刺激細(xì)胞［14-17］的研究結(jié)果大多證實(shí)了辛伐他汀促進(jìn)骨形成的作用潛能，但在系統(tǒng)性干預(yù)相關(guān)研究中，一部分研究肯定了辛伐他汀的成骨潛能［18-21］，但也有研究結(jié)果未能證實(shí)其促進(jìn)成骨作用［5，6，22］。作者認(rèn)為，這些結(jié)果的矛盾主要原因，一方面與辛伐他汀本身代謝特點(diǎn)有關(guān)-即灌胃給藥經(jīng)肝臟代謝后僅有少量藥物進(jìn)入外周循環(huán)，對骨組織干預(yù)效果較弱，另一方面，與實(shí)驗(yàn)設(shè)計的差異以及不同實(shí)驗(yàn)的動物和藥物本身的差別有關(guān)，因此本研究通過同一藥物同批動物采用不同干預(yù)方案驗(yàn)證辛伐他汀對該模型骨量丟失的干預(yù)效果的差異，我們分別選取前半程干預(yù)和后半程干預(yù)，雖然從數(shù)值高低的統(tǒng)計分析我們沒有發(fā)現(xiàn)兩者的顯著差異，但是與模型組比較，前半程干預(yù)組對骨密度、生物力學(xué)性能提高的比例、骨小梁分離度降低的比例均高于后半程干預(yù)組，提示該劑量下辛伐他汀預(yù)防性干預(yù)可能較治療性干預(yù)對OVX大鼠骨丟失的干預(yù)效果更好，當(dāng)然，這一推測需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究中經(jīng)micro-CT對松質(zhì)骨的骨量和微結(jié)構(gòu)的分析并未發(fā)現(xiàn)辛伐他汀能顯著提高OVX大鼠骨密度，這與骨密度和生物力學(xué)檢測結(jié)果并不一致。進(jìn)一步對結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，雖然沒有統(tǒng)計學(xué)差異，但辛伐他汀干預(yù)組骨量和微結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)均優(yōu)于模型組，作者認(rèn)為，而micro-CT只反映松質(zhì)骨的情況，而骨密度和生物力學(xué)指標(biāo)反映的是整個椎體骨的骨量和力學(xué)性能，辛伐他汀對骨密度和力學(xué)性能的影響是其對皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨共同作用的結(jié)果，可能辛伐他汀對兩者任一的作用都不足夠顯著，但兩者相加則達(dá)到顯著水平。

PINP即I型前膠原氨基端前肽，是成骨細(xì)胞合成并釋放出I型前膠原的細(xì)胞外分解產(chǎn)物，PINP在血液中的含量主要反映骨轉(zhuǎn)換的情況和I型膠原的合成速率，升高提示骨轉(zhuǎn)換活躍，I型膠原合成速率加快。目前認(rèn)為PINP是新骨形成及骨轉(zhuǎn)換水平的特異性的敏感指標(biāo)［23-26］。ICTP是骨吸收過程中骨基質(zhì)中I型膠原分解產(chǎn)物，具有很強(qiáng)的特異性，是反映骨吸收活躍程度的主要生化標(biāo)志物之一［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠卵巢切除后20周，兩者血清水平均明顯高于對照組，提示其骨轉(zhuǎn)換仍處于較高水平，與人類絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的骨代謝狀態(tài)一致。以往多數(shù)研究認(rèn)為辛伐他汀的作用主要是促進(jìn)骨形成［1-4］，也有研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀干預(yù)卵巢切除大鼠既可以促進(jìn)骨形成，又可以抑制骨吸收［28］。本研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀干預(yù)組PINP較模型組有升高趨勢，ICTP有下降趨勢，但兩者均未能達(dá)到顯著水平。考慮到本研究僅選取一個時間點(diǎn)檢測了兩個指標(biāo)，不能完全反映骨代謝的動態(tài)變化，而以往研究也有骨代謝血清標(biāo)志物水平與骨量變化不一致的結(jié)果［28］。

綜上，辛伐他汀預(yù)防性干預(yù)和治療性干預(yù)均可部分阻止該模型骨量減少、力學(xué)性能退變、微結(jié)構(gòu)改變，兩者相比，雖然沒有統(tǒng)計學(xué)差異，但預(yù)防性干預(yù)表現(xiàn)出較治療性干預(yù)效果更好的趨勢，但仍需后續(xù)研究提供更確實(shí)的證據(jù)。

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〔修回日期〕2016-03-23

【中圖分類號】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）06-0042-06

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.06.009

［基金項(xiàng)目］河北省自然科學(xué)基金（H2013209255）、河北省高等學(xué)校科學(xué)研究計劃（QN20131007）、唐山市老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目（14140221B）。

［作者簡介］劉昊，主治醫(yī)師，主要從事骨與關(guān)節(jié)退行性疾病的研究。E-mail：15100526293@163.com。

［通訊作者］田發(fā)明，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：tfm9911316@163.com。to detect the bone mineral density，L4 vertebra was used to analyze the maximum loading and elastic modulus by compression test，and the microstructure of the L5 vertebra was detected by micro-computed tomography.Results 1. ELISA analysis：the concentrations of serum P1NP and ICTP in the groups A，B and C were significantly higher than that of group A（P＜0.05）.2.BMD test showed that the rats in group B had significantly lower BMD than the other 3 groups（P ＜0.05），while the BMD of groups C and D were markedly lower than that of group A（P＜0.05）.3.Biomechanical test：the maximum load and elastic modulus of L4 vertebrae in the group B were significantly lower than the other 3 groups（P＜0.05），and those of the groups C and D were markedly lower than that in the group A（P＜0.05）.4.micro-CT：BV/TV and Tb.N in the sham operated rats were significantly higher than those of the other 3 groups，while the opposite trends was found in Tb.Sp（P＜0.05），and the Tb.Sp in the groups C and D were significantly lower than that of group B（P＜0.05）.Conclusions Our data demonstrate that bone loss and deterioration of bone micro-structure and biomechanical properties occurred at 20 weeks after ovariectomy，both the first-half-period and latter-half-period treatment by simvastatin may partially prevent these changes，but can not restore the BMD to normal level.

Effects of simvastatin treatment with different intervention programs on the bone quality of osteoporotic rats

LIU Hao1，ZHANG Yan1，ZHANG Guo-bin2，XING Lei1，JIA Zhong-bao2，TIAN Fa-ming3.
（1.Affiliated Hospital，2.Graduate School，3.Medical Research Center，North China University of Science and Technology，Tangshan 063000，China）

【Abstract】Objective To investigate the effects of simvastatin on the bone loss and deterioration of bone quality with different intervention programs.Methods Thirty two 3-month-old female Sprague-Dawley（SD）rats were randomized into 4 groups of 8 animals in each：All rats but those in the sham group（A）received bilateral ovariectomy，and treated by vehicle（B），simvastatin（5 mg/kg/day）at first half period（C）or at latter half period（D）.The rats in group C received simvastatin by a gavage after the OVX operation immediately，and stopped at 10 weeks after OVX.The rats in group D began to receive simvastatin treatment from 10 weeks after OVX and ended at 20 weeks after OVX.At week 20，all rats were sacrificed and the concentrations of serum PINP and ICTP were detected by ELISA，L3 vertabra was used

【Key words】Simvastatin；Osteoporosis；Bone mineral density；Biomechanics；Micro-CT；Rats