王雅茹，葉清清，方偉彬，劉廣鋒，馮娟，管淑玉

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中藥黃芩對(duì)多重耐藥哈維弧菌耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用

王雅茹1，葉清清1，方偉彬1，劉廣鋒2，馮娟2，管淑玉1

（1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院/國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)重點(diǎn)研究室/廣東高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510006；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東廣州510300）

摘要：目的研究中藥黃芩對(duì)多重耐藥哈維弧菌的耐藥逆轉(zhuǎn)作用并初步探討其作用機(jī)理。方法 以耐阿莫西林、呋喃唑酮和紅霉素的哈維弧菌X12XC30為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用倍比稀釋法測(cè)定黃芩對(duì)菌株X12XC30的亞抑菌濃度；以SDS為對(duì)照，采用影印培養(yǎng)法測(cè)定黃芩作用24 h和48 h的耐藥逆轉(zhuǎn)率；通過質(zhì)粒凝膠電泳觀察黃芩對(duì)該菌株質(zhì)粒的消除情況。結(jié)果 黃芩對(duì)阿莫西林和呋喃唑酮的總逆轉(zhuǎn)率為3.00%（24 h）和4.33%（48 h）；SDS對(duì)阿莫西林和呋喃唑酮的總逆轉(zhuǎn)率為0.33%（24 h）和1.33%（48 h）。結(jié)論 黃芩對(duì)多重耐藥哈維弧菌有耐藥逆轉(zhuǎn)作用。

關(guān)鍵詞：黃芩；哈維弧菌；多重耐藥；耐藥性逆轉(zhuǎn)

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隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌耐藥問題日益突出，多重耐藥菌株的出現(xiàn)，嚴(yán)重影響了人類的公共安全。新型抗生素投入使用不久即迅速產(chǎn)生耐藥細(xì)菌，因此，細(xì)菌耐藥性的逆轉(zhuǎn)成為國內(nèi)外研究人員研究的熱點(diǎn)［1］。我國有豐富的中藥資源，很多中藥有廣泛的抗炎抑菌等作用，已有研究報(bào)道蛇莓［2］、千里光［3］等中藥對(duì)多重耐藥菌有耐藥逆轉(zhuǎn)的作用。

哈維弧菌是一種常見的海洋致病菌，在海水魚蝦的養(yǎng)殖中廣泛存在，其引發(fā)的感染流行廣，死亡率高，給海水養(yǎng)殖和公共安全造成巨大隱患。本實(shí)驗(yàn)選用分離自海水養(yǎng)殖魚類的耐阿莫西林、呋喃唑酮和紅霉素的哈維弧菌X12XC30為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究中藥黃芩對(duì)該菌株的耐藥逆轉(zhuǎn)效果。

1 儀器與材料

1.1 藥材與試劑

黃芩（批號(hào)140401，廣州致信藥業(yè)有限公司），水煎煮制備成質(zhì)量濃度為1.0 g/mL的藥液備用；阿莫西林膠囊（批號(hào)41500954，廣州白云山制藥股份有限公司，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的藥液備用）；呋喃唑酮片（批號(hào)C140603，山西云鵬制藥有限公司，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的藥液備用）；SDS（批號(hào)2015032042，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA Maker 15000［天根（北京）生化科技有限公司］；酵母提取粉（批號(hào)3202068，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；細(xì)菌學(xué)蛋白胨（批號(hào)3204084，廣東環(huán)凱微生物科技有限公

司）；瓊脂粉（批號(hào)9002-18-0，廣州菲博生物科技有限公司）；水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限公司）；FA2004B電子天平（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；MJ-78A高壓滅菌鍋（美國STIR）；DHG-9145A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；超低溫冰箱（中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司）；Tocan凝膠成像儀（上海領(lǐng)成生物科技有限公司）；BG-Power 300電泳儀（北京百晶生物科技有限公司）；臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）。

1.3 菌株

哈維弧菌（Vibrio Harveyi）X12XC30由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所分離鑒定、命名并保藏。培養(yǎng)基為2216E培養(yǎng)基，配制方法參照文獻(xiàn)［4］。

2 方法與結(jié)果

2.1 多重耐藥哈維弧菌X12XC30耐藥性的檢測(cè)

采用紙片擴(kuò)散法（K-B法）對(duì)多重耐藥哈維弧菌X12XC30進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，參照《抗菌藥物藥敏紙片判斷標(biāo)準(zhǔn)》［5］判定耐藥性結(jié)果，如表1，得知菌株X12XC30耐阿莫西林、紅霉素和呋喃唑酮抗生素。

表1 多重耐藥哈維弧菌X12XC30的耐藥性結(jié)果Table 1 Results of drug-resistance of Vibrio Harvey X12XC30

2.2 耐藥性逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 藥物亞抑菌濃度的測(cè)定 通過倍比稀釋法進(jìn)行確定［6］，方法如下：制備濃度為1×106CFU/mL的菌懸液，取菌懸液100 μL分別加入含100 μL不同濃度黃芩（1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.62、7.81、3.90 mg/mL）的2216E液體培養(yǎng)基中。對(duì)照組不加藥只加細(xì)菌。28℃恒溫培養(yǎng)24 h，以肉眼觀察有細(xì)菌生長的最大濃度為黃芩的亞抑菌濃度。SDS、阿莫西林和呋喃唑酮的亞抑菌濃度測(cè)定方法同上。得知黃芩、SDS、阿莫西林、呋喃唑酮的亞抑菌濃度分別為31.25、12.5、1.25、0.31 mg/mL。

2.2.2 黃芩對(duì)多重耐藥哈維弧菌耐藥逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)的研究 參照質(zhì)粒消除試驗(yàn)［6］，并與耐藥逆轉(zhuǎn)的定義相結(jié)合，研究藥物對(duì)多重耐藥哈維弧菌的耐藥逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)。具體方法如下：

亞抑菌濃度的黃芩培養(yǎng)菌株X12XC30，分別于24 h和48 h后取100 μL菌液涂布于2216E平板培養(yǎng)。24 h后挑選300個(gè)單菌落（檢測(cè)菌落總數(shù)），分別影印于含阿莫西林（1.25 mg/mL）和呋喃唑酮（0.31 mg/mL）的 2216E平板上以及不含藥物的2216E平板上，28℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察并記錄結(jié)果。陰性對(duì)照組中，細(xì)菌未經(jīng)藥物作用，其他同上；陽性對(duì)照組中，藥物用亞抑菌濃度的SDS替代，其他同上。

選擇在含藥平板上不生長、而在不含藥的普通平板上生長的菌落，采用倍比稀釋法測(cè)定抗生素對(duì)此菌的MIC，以原哈維弧菌X12XC30的MIC作對(duì)照，若MIC值由耐藥濃度變成敏感濃度，則此菌即為耐藥逆轉(zhuǎn)菌。根據(jù)耐藥逆轉(zhuǎn)菌落數(shù)與檢測(cè)菌落總數(shù)之比，計(jì)算測(cè)試菌的耐藥逆轉(zhuǎn)率。見表2～3。

耐藥逆轉(zhuǎn)率=B（耐藥逆轉(zhuǎn)菌落數(shù)）/A（檢測(cè)菌落總數(shù)）×100%

表2 藥物作用24 h后多重耐藥哈維弧菌X12XC30耐藥逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of drug-resistance reversion of Vibrio Harvey X12XC30 after treated by medicine at 24 h

表3 藥物作用48 h后多重耐藥哈維弧菌X12XC30耐藥逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of drug-resistance reversion of Vibrio Harvey X12XC30 after treated by medicine at 48 h

由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，多重耐藥哈維弧菌X12XC30 在24 h和 48 h均沒有自發(fā)耐藥逆轉(zhuǎn)；以菌株X12XC30為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，黃芩作用24 h的耐阿莫西林逆轉(zhuǎn)率為2.00%，耐呋喃唑酮逆轉(zhuǎn)率為1.00%，總耐藥逆轉(zhuǎn)率為3.00%；SDS作用24 h的耐阿莫西林逆轉(zhuǎn)率為0，耐呋喃唑酮逆轉(zhuǎn)率為0.33%，總耐藥逆轉(zhuǎn)率為0.33%。由此可知，黃芩對(duì)菌株X12XC30耐阿莫西林的逆轉(zhuǎn)作用好于耐呋喃唑酮的逆轉(zhuǎn)作用，黃芩對(duì)菌株X12XC30的耐藥逆轉(zhuǎn)作用好于SDS，經(jīng)卡方檢驗(yàn)可知，黃芩組和SDS組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。黃芩作用 48 h耐阿莫西林逆轉(zhuǎn)率為2.67%，耐呋喃唑酮逆轉(zhuǎn)率為1.67%，總耐藥逆轉(zhuǎn)率為4.33%；SDS作用48 h耐阿莫西林逆轉(zhuǎn)率為0.33%，耐呋喃唑酮逆轉(zhuǎn)率為1.00%，總耐藥逆轉(zhuǎn)率為1.33%，由此可知，黃芩對(duì)菌株X12XC30耐阿莫西林的逆轉(zhuǎn)作用好于耐呋喃唑酮的逆轉(zhuǎn)作用，黃芩對(duì)菌株X12XC30的耐藥逆轉(zhuǎn)作用好于SDS。經(jīng)卡方檢驗(yàn)可知，黃芩組和SDS組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 耐藥逆轉(zhuǎn)菌的質(zhì)粒分析

挑取耐藥逆轉(zhuǎn)菌落，于2216E液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，用DNA小提試劑盒抽提質(zhì)粒，0.8%瓊脂糖凝膠電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察，以未經(jīng)藥物作用的哈維弧菌X12XC30的質(zhì)粒圖譜為對(duì)照，對(duì)比耐藥逆轉(zhuǎn)菌株的質(zhì)粒是否消失。由圖1可知，經(jīng)31.25 mg/mL的黃芩作用后得到的耐阿莫西林逆轉(zhuǎn)菌株和耐呋喃唑酮逆轉(zhuǎn)菌株的質(zhì)粒均未被消除。

1.耐阿莫西林逆轉(zhuǎn)菌株；2.耐呋喃唑酮逆轉(zhuǎn)菌株；3.菌株X12XC30；4.DNA Maker 15 000。圖1 黃芩作用前后菌株質(zhì)粒圖譜Figure 1 Plasmid profile analysis of Vibrio Harvey before and after treated by scutellaria baicalensis

3 討論

細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生和傳播使新型抗生素的使用周期大大縮短，多重耐藥菌的日益嚴(yán)重已成為全球關(guān)注的公共安全問題。開發(fā)新型的細(xì)菌耐藥性逆轉(zhuǎn)劑已成為抗菌研究的新策略。與EB、SDS等化學(xué)耐藥逆轉(zhuǎn)劑相比，中藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑的作用毒性較小，有良好的應(yīng)用前景。翟如波等［7］報(bào)道五倍子、防風(fēng)等中藥對(duì)金黃色葡萄球菌均有一定的耐藥逆轉(zhuǎn)作用；高迎春［8］等研究發(fā)現(xiàn)地錦草提取物可以使部分耐藥大腸桿菌變?yōu)槊舾芯?/p>

本研究選用多重耐藥哈維弧菌X12XC30為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究其經(jīng)亞抑菌濃度的黃芩提取液作用后菌株的耐藥逆轉(zhuǎn)情況，結(jié)果表明中藥黃芩對(duì)多重耐藥哈維弧菌有較強(qiáng)的耐藥逆轉(zhuǎn)作用，其作用好于傳統(tǒng)消除劑SDS，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)比黃芩提取液對(duì)菌株耐阿莫西林的逆轉(zhuǎn)率和耐呋喃唑酮的逆轉(zhuǎn)率可知，黃芩提取液對(duì)菌株耐阿莫西林的逆轉(zhuǎn)作用好于耐呋喃唑酮的逆轉(zhuǎn)作用，為中藥黃芩作為耐藥逆轉(zhuǎn)劑提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

藥物耐藥逆轉(zhuǎn)的機(jī)制有消除耐藥質(zhì)粒、促進(jìn)藥物進(jìn)入、減少藥物泵出、抑制滅活酶、抑制酶的活性等［9-10］。本實(shí)驗(yàn)通過研究藥物作用前后質(zhì)粒的消除情況初步探討了中藥黃芩逆轉(zhuǎn)菌株耐藥作用的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芩作用后的耐阿莫西林逆轉(zhuǎn)菌株和耐呋喃唑酮逆轉(zhuǎn)菌株的質(zhì)粒均未被消除。質(zhì)粒圖譜出現(xiàn)3個(gè)條帶與2個(gè)條帶的差異可能與質(zhì)粒DNA的構(gòu)型有關(guān)。黃芩逆轉(zhuǎn)哈維弧菌的耐藥性是否與其他作用機(jī)制相關(guān)有待于進(jìn)一步研究。

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中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1006-8783（2016）03-0366-04

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016012204

收稿日期：2016-01-22

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81001702）；廣州市科技計(jì)劃產(chǎn)學(xué)研協(xié)同創(chuàng)新重大專項(xiàng)（201508020016）；海南省科技興海專項(xiàng)（2015XH03）

作者簡(jiǎn)介：王雅茹（1990—），女，2013級(jí)碩士研究生，Email：18814099564@163.com；通信作者：管淑玉（1976—），女，博士，副教授，主要從事中藥質(zhì)量控制與生物活性研究，Email：guanshy3@163.com；馮娟（1973—），女，研究員，主要從事細(xì)菌性疾病及免疫防治研究，Email：juanf@21cn.com。

Reverse effect of scutellaria baicalensis on multi-drug resistant Vibrio Harveyi

WANG Yaru1YE Qingqing1FANG Weibin1LIU Guangfeng2Feng Juan2GUAN Shuyu1
1.School of Traditional Chinese Medicine Guangdong Pharmaceutical University National Key Laboratory of Digital Quality Evaluation Technology of Chinese Traditional Medicine and Guangdong University of Traditional Chinese Medicine Quality Engineering Technology Research Center Guangzhou 510006 China 2.South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences Guangzhou 510300 China

AbstractObjective To study the reverse effect of scutellaria baicalensis on multi-drug resistant Vibrio Harveyi and its potential mechanism.Methods Vibrio Harvey X12XC30 was selected owing to its resistant to amoxicillin furazolidone and erythromycin.The sub-MIC concentration of scutellaria baicalensis was determined by the double dilution method.With SDS as a positive elimination agent the reversal rate of amoxicillin and furazolidone was analyzed by using photolithography.Agarose gel electrophoresis was used to observe the plasmid-eliminated situation.Results After treatment with scutellaria baicalensis the total reversal rate of Vibrio Harveyi to amoxicillin and furazolidone was 3.00% 24 h and 4.33% 48 h while the reversal rate of SDS was 0.33% 24 h and 1.33% 48 h .Conclusion Scutellaria baicalensis has the reverse effect on multi-drug resistant Vibrio Harveyi.

Key wordsscutellaria baicalensis Vibrio Harveyi multi-drug resistant reversal of resistance