羅毅平，張艷，張溫麑，黃珊，甘艷微，余丹峰（廣東省婦幼保健院，廣東廣州511400）

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產(chǎn)后甲狀腺炎患者樹突狀細胞免疫功能的研究

羅毅平，張艷，張溫麑，黃珊，甘艷微，余丹峰
（廣東省婦幼保健院，廣東廣州511400）

摘要：目的通過對產(chǎn)后甲狀腺炎（PPT）患者外周血樹突狀細胞（DCs）免疫功能及狀態(tài)的觀察，探討DCs與PPT發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。方法用流式細胞術(shù)（FACS）分別檢測經(jīng)培養(yǎng)后來源于PPT患者及正常健康人外周血DCs上CD83、CD80、CD86的表達水平。結(jié)果來源于PPT患者外周血DCs上CD83、CD80、CD86分子的表達水平顯著高于正常組（P＜0.05），同種混合淋巴細胞反應(yīng)顯示PPT患者組DCs免疫刺激能力顯著高于正常組（P＜0.01）。結(jié)論DCs免疫功能及成熟分化的增加與PPT的發(fā)生密切相關(guān)。 關(guān)鍵詞：產(chǎn)后甲狀腺炎；樹突狀細胞；免疫功能 中圖分類號：R714.14+7

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1006-8783（2016）03-0379-04

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016041701

產(chǎn)后甲狀腺炎（PPT）是發(fā)生在產(chǎn)后的一種自身免疫性甲狀腺疾病，可見于正常分娩或流產(chǎn)婦女。研究提示PPT的發(fā)生與宿主的免疫功能變化尤其是T淋巴細胞的分化密切相關(guān)［1］。樹突狀細胞（DCs）是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強，也是唯一能激活初始型T細胞的抗原提呈細胞，在T細胞的分化過程中具有重要作用。已有研究表明DCs是啟動自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、自身免疫性腦脊髓炎等疾病參與發(fā)病的主要細胞，其通過捕獲并提呈抗原，轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)，表達共刺激分子、激活T細胞及分泌細胞因子等作用啟動免疫應(yīng)答，參與免疫病態(tài)反應(yīng)［2］。然而目前國內(nèi)外未見有關(guān)于PPT發(fā)病中DCs的免疫調(diào)節(jié)功能的研究。本實驗通過觀察PPT患者與健康人外周血單核細胞源性DCs的成熟狀態(tài)及免疫功能的差異，探討DCs 與PPT發(fā)病的相關(guān)性。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-05-20 9：51 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160520.0951.001.html

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

Calibur型流式細胞儀（美國BD Bioscience公司）；液閃計數(shù)儀（美國PerkinElmer公司）；Ficoll人淋巴細胞分離液（美國 GE Healthcare公司）；RPMI1640培養(yǎng)液（美國Hyclone公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；重組人白細胞介素4（rhIL-4）、重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（rhGMCSF）及鼠抗人CD80、CD86、CD83抗原IgG單克隆抗體均購自美國BD pharmingen公司。

1.2 研究對象及標(biāo)本的選取

采集2012年10月—2015年12月在廣東省婦幼保健院內(nèi)科就診的50例PPT患者（其中30例甲亢單相型，17例甲減單相型，3例甲亢甲減雙相型）外周靜脈血作為PPT組，以年齡、孕產(chǎn)次匹配50例健康產(chǎn)后婦女外周靜脈血作為正常對照組。兩組患者的年齡、孕產(chǎn)次比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具可比性（見表1）。PPT的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］：①妊娠前無甲狀腺疾病病史；②產(chǎn)后6個月內(nèi)出現(xiàn)TSH異常并FT3、FT4水平異常；③甲狀腺TSH受體抗體陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)［3］：①產(chǎn)后彌漫性甲狀腺腫伴甲狀腺功能亢進癥；②近期患有急性或慢性感染性疾病；③肝腎功能異常；④近期接受過激素或免疫抑制劑治療。實驗前所有研究對象均簽署知情同意書。入選的兩組患者分別于產(chǎn)后第90天取20 mL肝素抗凝外周血，以Ficoll淋巴細胞分離液梯度離心富集單個核細胞，RPMI1640液洗滌細胞3次，調(diào)整細胞數(shù)待用。

表1 正常人及PPT患者一般臨床資料情況Table 1 Clinical data of PPT patients and health donors

1.3 DCs的體外培養(yǎng)及富集

人外周血單個核細胞以合適的密度接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，用含10%（φ）的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，在恒溫箱中培養(yǎng) 2 h后遺棄未貼壁細胞，用RPMI1640液輕洗2遍貼壁細胞，再加入4 mL含rhIL-4 500 U/mL和rhGM-CSF 1 000 U/mL細胞因子的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)；每2天全量換液1次，共培養(yǎng)7 d。

1.4 透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)

培養(yǎng)7 d后收集足量的DCs，經(jīng)PBS液洗2次后離心獲細胞沉淀，以25%（φ）的戊二醛4℃固定48 h后，再用10 g/L OSO44℃固定1 h，梯度乙醇脫水、包埋，超薄切片經(jīng)醋酸鈾-枸櫞酸鉛復(fù)染后，透射電鏡觀察并照相。

1.5 流式細胞儀（FACS）檢測

培養(yǎng)結(jié)束收集細胞，用PBA懸浮為5×106細胞/mL，加入離心管，再加入濃度為5 μg/mL的鼠抗人CD80、CD86、CD83抗原IgG單克隆抗體100 μL，4℃標(biāo)記30 min，PBA洗細胞1次，沉淀細胞加入FITC-標(biāo)記兔抗鼠熒光二抗，4℃標(biāo)記45 min，1%多聚甲醛 500 μL固定細胞，用 FACS檢測 CD80、CD83、CD86的表達水平，以熒光吸收度A表示。

1.6 同種混合淋巴細胞反應(yīng)（MLR）

取健康人外周血20 mL，淋巴細胞分離液密度梯度離心后獲取單個核細胞層，用 PBS洗去血小板，37℃貼壁培養(yǎng)1 h，收集懸浮的細胞為同種異體T細胞。調(diào)整細胞濃度為1×106細胞/mL。收集培養(yǎng)7 d后的DCs，加入絲裂霉素C 25 μg/mL，37℃，溫育45 min。在32孔平底培養(yǎng)板種加入不同人的DCs 200 μL（2×104/孔），再加入健康人T細胞200 μL（2×105/孔），各3孔，在37℃、5%（φ）CO2的環(huán)境下培養(yǎng)96 h。于培養(yǎng)結(jié)束前16 h加入［3H］標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）2 μCi/孔，多頭細胞樣品收集儀收集細胞，烘干（80℃，30 min），加入閃爍液5 mL，用液閃計數(shù)儀，檢測3H-TdR的摻入率（cpm），結(jié)果用3孔的均值來表示。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 DCs形態(tài)學(xué)觀察

從外周血中獲取單個核細胞，貼壁培養(yǎng)后經(jīng)rhGM-CSF和rhIL-4聯(lián)合誘導(dǎo)，第7天時產(chǎn)生大量DCs，平均從20 mL外周血中可誘導(dǎo)出（1.5～2.0）× 106個DCs，與其他報道相近［4］。培養(yǎng)24 h后大部分細胞貼壁生長，成簇排列，形態(tài)未見異常。48 h后，細胞出現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)，同時懸浮細胞增多，以后隨著時間的延長，懸浮細胞逐漸增多，異形突起明顯。第3～4天時倒置顯微鏡下可見大部分細胞呈梭形及不規(guī)則形狀，細胞表面呈毛刺狀，第7天細胞生長茂盛，大部分細胞呈不規(guī)則形，并且伸出不規(guī)則突起，為典型DCs形態(tài)，見圖1。臺盼藍染色顯示，細胞活力在95%以上。

透射電鏡下可見DCs成不規(guī)則形，細胞表面粗糙，突起明顯。細胞核呈腎形和馬蹄形，核內(nèi)異染色質(zhì)較多，呈團塊狀，集中分布于核膜處，核漿比增大，胞質(zhì)中細胞器較少，可見少量線粒體，溶酶體偶見，見圖2。

圖1　倒置顯微鏡下培養(yǎng)第7天的DCs形態(tài)（400×）Figure 1 Morphology of DCs cultured at 7 days by inverted microscope（400×）

圖2　電鏡下培養(yǎng)第7天的DCs形態(tài)（8 000×）Figure 2 Morphology of DCs cultured at 7 days by electron microscope（8 000×）

2.2 DCs表面CD80、CD86及CD83的表達

FACS分析結(jié)果顯示，培養(yǎng)7 d后的PPT患者

DCs表面CD80、CD86及CD83表達均顯著高于正常組（P＜0.05）。見表2、圖3。

表2 正常組及PPT患者DCs表面分子CD80、CD86及CD83的表達率（n=50，%，±s）Table 2 Expression of CD80，CD86 and CD83 in the surface of DCs from PPT patients and health donors

表2 正常組及PPT患者DCs表面分子CD80、CD86及CD83的表達率（n=50，%，±s）Table 2 Expression of CD80，CD86 and CD83 in the surface of DCs from PPT patients and health donors

與正常組比較，*P＜0.05

組別　CD80　CD86　CD83 PPT組　61.41±7.47*　37.28±6.75*　7.18±1.59*正常組　41.76±7.35　29.68±7.32　5.44±1.17

圖3　FACS檢測培養(yǎng)第7天的DCs表面表型Figure 3 Phenotype characteristics of DCs cultured at 7 days detected by FACS

2.3 同種混合淋巴反應(yīng)

正常組DCs作為刺激細胞的cpm值為10 000± 2 000，PPT患者組為30 000±3 000。PPT患者組DCs免疫刺激能力顯著高于正常組（P＜0.01）。單獨加入DCs和T細胞的本底摻入值（cpm）值均小于500。

3 討論

自日本學(xué)者于1977年首次提出產(chǎn)后甲狀腺炎的概念以來，許多學(xué)者相繼對本病進行了調(diào)查研究，歸納其臨床特征主要為產(chǎn)后1年內(nèi)出現(xiàn)暫時性甲亢和/或甲低，131I攝取率降低，甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）升高，及甲狀腺病理呈淋巴細胞浸潤性甲狀腺炎改變。PPT是產(chǎn)后婦女的一種常見病。研究報道，PPT在產(chǎn)后婦女中的發(fā)病率是 1.1%～21.1%，碘充足地區(qū)患病率約7%，孕期及產(chǎn)后血清中TPOAb陽性者，發(fā)病率可高達33%～50%［5］。我國學(xué)者報告的PPT平均患病率是7.2%［6］。

T淋巴細胞介導(dǎo)的細胞免疫在PPT致病中起重要作用［7］。T細胞的活化需要協(xié)同刺激信號的參與，在參與T細胞激活的諸多協(xié)同刺激分子中，研究較多的是CD80、CD86共刺激分子，它們均為DCs相關(guān)分化抗原。DCs作為一種專職抗原遞呈細胞，通過其表面相應(yīng)配體CD80和CD86與T細胞表面CD28分子相結(jié)合，從而啟動T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。在正常情況下，外周血中絕大多數(shù)DCs處于非成熟狀態(tài)，此時 DCs僅表達低水平的共刺激分子（CD80、CD86）和黏附分子，且較少表達CD83這一被認為是DCs充分成熟、有活性的標(biāo)志物分子［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，在GM-CSF和IL-4的聯(lián)合誘導(dǎo)下，PPT患者外周血DCs表面CD80、CD86分子的表達水平顯著高于正常人，其刺激T淋巴細胞增殖能力亦顯著高于來源于正常人外周血的DCs。另外，與健康人比較，PPT患者外周血經(jīng)GM-CSF和IL-4聯(lián)合誘導(dǎo)后，更多地表達反映成熟、有活性DCs標(biāo)記物CD83，表明獲得的是處于成熟狀態(tài)的DCs。推測原本未成熟的DCs逐漸分化為成熟的DCs，經(jīng)過遷徙聚集在甲狀腺組織上介導(dǎo)免疫反應(yīng)從而導(dǎo)致PPT的發(fā)生。PPT患者可表現(xiàn)為甲亢型、甲減型及甲亢甲減雙向型，因樣本量關(guān)系，本研究未將不同時期及不同甲狀腺功能表現(xiàn)PPT患者進行區(qū)分，這將是我們今后工作的方向。

綜上所述，DCs免疫功能的增強及成熟分化程度的提高與PPT的發(fā)生密切相關(guān)，這也為免疫抑制治療PPT提供了理論基礎(chǔ)及實驗依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：王昌棟）

收稿日期：2016-04-17

基金項目：廣東省醫(yī)學(xué)科研基金立項課題（A2013077）

作者簡介：羅毅平（1976—），男，博士，主任醫(yī)師，主要從事妊娠合并內(nèi)科疾病及危重癥的診治研究，Email：doctorluoyiping@ 126.com；通信作者：張艷（1979—），女，博士，主治醫(yī)師，主要從事妊娠合并內(nèi)科疾病診治研究，Email：happydragon2012qq@126.com。

Study on the immune function of dendritic cells in postpartum thyroiditis patients

LUO Yiping，ZHANG Yan，ZHANG Wenlan，HUANG Shan，GAN Yanwei，YU Danfeng
（Guangdong Province Maternity and Child Care Hospital，Guangzhou 511400，China）

AbstractObjective To study the immune function of dendritic cells DCs from peripheral blood of postpartum thyroid PPT patients and explore the potential relationship between DCs and the pathogenesis of PPT.Methods Fluorescence activated cell sorter FACS was used to detect the expression of CD83 CD80 and CD86 in the surface of DCs cultured from the peripheral blood of PPT patients or healthy donors.

Results Compared with healthy donors DCs from the peripheral blood of PPT patients expressed higher levels of CD83 CD80 and CD86 P＜0.05 and the capability of T cell proliferation stimulated by DCs from PPT patients was higher either P＜0.01 .Conclusion The increased immune function of DCs may be a reason for the pathogenesis of PPT.

Key wordspostpartum thyroiditis dendritic cells immune function