冼慧儀，盧心鵬2，曹志3，陳鴻生2，李風(fēng)雷，廖東江2

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急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷小鼠肺組織蛋白組學(xué)初步研究

冼慧儀1，盧心鵬2，曹志3，陳鴻生2，李風(fēng)雷1，廖東江2

（1.廣州醫(yī)學(xué)院荔灣醫(yī)院，廣東廣州510120；2.呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510230；3.華南師范大學(xué)藥物研究院，廣東廣州510631）

摘要：目的應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷（APALI）小鼠模型與正常小鼠肺組織蛋白質(zhì)表達(dá)差異，為闡明APALI的發(fā)病機(jī)制和預(yù)后提供理論依據(jù)。方法20只BALB/c小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組通過(guò)腹腔注射雨蛙肽的方法造模，造模后處死小鼠取左肺組織進(jìn)行病理學(xué)分析，右肺組織提取肺組織總蛋白，用雙向電泳加質(zhì)譜的技術(shù)路線進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果分析差異蛋白質(zhì)功能，發(fā)現(xiàn)差異蛋白質(zhì)主要與炎癥反應(yīng)及氧化還原相關(guān)。結(jié)論炎癥浸潤(rùn)、組織細(xì)胞損傷引起的氧化應(yīng)激損傷可能在APALI發(fā)病早期扮演重要角色，在APALI早期重視抗氧化治療可有助于改善預(yù)后。

關(guān)鍵詞：急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷；動(dòng)物模型；蛋白質(zhì)組學(xué)

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是以自體胰腺消化和胰腺壞死為主要特征的一種全身性疾病，該病具有病程進(jìn)展極快、并發(fā)癥多和病死率高等特點(diǎn)。APALI是AP最常見(jiàn)的并發(fā)癥，其發(fā)生率可高達(dá)65%左右，繼發(fā)急性呼吸窘迫綜合征達(dá)20%左右，是急性胰腺炎患者早期死亡的重要原因［1］。有

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-05-30 11：07 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160530.1107.007.html研究認(rèn)為中性粒細(xì)胞激活、胰酶、氧化損傷、細(xì)胞因子、補(bǔ)體系統(tǒng)、激肽、一氧化氮、內(nèi)皮素及炎癥介質(zhì)等因素的相互作用與影響在急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷（acute pancreatitis-associated 1ung injury，APALI）發(fā)病中起著重要的作用［2］。目前由于APALI的相關(guān)發(fā)生機(jī)制尚不明確，導(dǎo)致臨床治療也缺少有效的治療方案，因此迫切需要明確其損傷機(jī)制。本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)技術(shù)，分析APALI小鼠模型肺組織與正常小鼠肺組織差異表達(dá)蛋白質(zhì)與APALI發(fā)病的關(guān)系，從蛋白質(zhì)表達(dá)水平初步闡明APALI的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性BALB/c小鼠20只，體質(zhì)量16～18 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2011-0003。小鼠隨機(jī)分配為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組10只。

1.2 主要試劑

Bradford蛋白定量試劑盒、pH固相梯度干膠條（IPG strip pH3-10NL，17 cm）、1.5 mol/L Tris-HCl （pH 8.8）、載體兩性電解質(zhì)（pharmalyte，pH3～10）、碘乙酰胺、過(guò)硫酸銨（APS）均為Bio-Rad公司產(chǎn)品；尿素（Urea）、二硫蘇糖醇（DTT）、CHAPS、SDS、TEMED、Tris堿（Tris-base）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、硫脲（Thiourea）、三氟乙酸（TFA）、α-氰基-4-羥基肉桂酸（CCA）、戊巴比妥鈉、雨蛙肽（Caerulein）均為Sigma公司產(chǎn)品；無(wú)水乙醇、95%（φ）乙醇、蘇木素染液、伊紅染液、鹽酸、TO、中性樹(shù)膠、考馬斯亮藍(lán)R-250等購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠。

1.3 主要儀器

RM2245切片機(jī)、DM4000B熒光顯微鏡（Leica公司）；IPGphor等電聚焦儀、proteanⅡxi cell垂直電泳槽、Image ScannerⅡ透射掃描儀（Bio-Rad公司）；Imagemaster 2D 5.0圖像分析軟件（GE公司）；4800 PLUS MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀（AB SCIEX公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 APALI小鼠模型造模及肺組織標(biāo)本采集

APALI小鼠模型造模采用Craig等［3］的方法，禁食過(guò)夜后分別用10 mg/kg劑量的雨蛙肽和生理鹽水腹腔注射小鼠，每小時(shí)注射1次，共8次，首次注射24 h后結(jié)束動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用致死劑量的戊巴比妥鈉腹腔注射處死小鼠，快速采集小鼠的肺組織備用。

1.4.2 小鼠肺組織病理標(biāo)本的處理及HE染色 將新鮮的小鼠左肺組織用生理鹽水沖洗后，于4%（φ）多聚甲醛固定液中固定48 h，然后用0.01 mol/L PBS液洗滌3次；梯度酒精（70%～100%）進(jìn)行脫水，共20～30 h；二甲苯透明20～40 min，60℃石蠟浸潤(rùn)4～4.5 h，最后用石蠟包埋。將包埋好的組織石蠟塊進(jìn)行常規(guī)肺組織切片（5 μm厚），撈于玻片上，60℃干燥箱干燥24 h。TO 10 min，2次，蘇木素染色1 min，1%（φ）鹽酸酒精脫色10 s，流水沖洗10 min，伊紅染色10 s，流水沖洗10 min，55℃烘20 min后用中性樹(shù)膠封片。

1.4.3 肺組織總蛋白的制備 將小鼠右肺組織用預(yù)冷PBS反復(fù)沖洗，去除血液并剪去多余結(jié)締組織及脂肪組織，吸干組織表面水分。每組10只小鼠肺組織各取0.5 g混合在一起后剪碎，移入預(yù)冷的玻璃勻漿器中加入裂解緩沖液（7 mol/L Urea，2 mol/L Thiourea，4%CHAPS，65 mmol/L DTT，0.5 mmol/L EDTA，2 mmol/L PMSF）勻漿；冰上靜置30 min，4℃17 000 g/min離心60 min，取上清即為總蛋白質(zhì)。用Bradford蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。

1.4.4 雙向凝膠電泳 雙向電泳參照G?rg等［4］的方法進(jìn)行。第一相等電聚焦（IEF），取850 mg小鼠肺組織蛋白，上樣量總體積為0.35 mL。30 V主動(dòng)水化12 h后進(jìn)行等電聚焦，等電聚焦的總伏小時(shí)數(shù)為80 000 Vh。等電聚焦結(jié)束后，迅速取出IPG膠條，分別進(jìn)行2次平衡，各15 min。將平衡好的膠條轉(zhuǎn)入垂直電泳槽中進(jìn)行第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠濃度為12%，電泳條件：10 mA電流恒流每塊膠電泳30 min，然后每膠25 mA，直至溴酚藍(lán)指示線到達(dá)凝膠底部停止電泳。凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染液染色后掃描，得到的雙向電泳圖譜通過(guò)ImageMaster 2D Elite 5.0圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.4.5 質(zhì)譜分析 沿邊緣切取凝膠上的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)（表達(dá)量差異在2倍以上），置于EP管內(nèi)。用含50 mmol/L碳酸氫銨的 50%（φ）乙腈脫色20 min，乙腈脫水，加入5 μL的胰蛋白酶（12.5 ng/μL）于冰上吸漲后，加入20 μL的覆蓋液（含50 mmol/L碳酸氫銨的10%乙腈）于37℃過(guò)夜。吸出上清轉(zhuǎn)移到新EP管，真空凍干。然后將干燥的肽段重新溶解于CHCA溶液（0.5 g/L，由0.1%TFA和50% CAN配制）中，與基質(zhì)混合點(diǎn)到不銹鋼MALDI靶板上作質(zhì)譜分析。MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析采用正離子反射模式，用ABI 4700 Calibration Mixture作為外標(biāo)校正，掃描范圍為800～4 000。從一級(jí)質(zhì)譜的肽質(zhì)量指紋圖譜中選擇信噪比（signal-to-noise ratio，S/ N）大于50的5個(gè)得分最高的8個(gè)前體離子作MS/ MS分析，質(zhì)譜信號(hào)累計(jì)掃描1 500次。

1.5 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

數(shù)據(jù)用 GPS Explorer軟件（V3.6，Applied Biosystems）在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜庫(kù)。檢索條件：物種來(lái)源為小鼠，肽片段分子量最大容許誤差控制±0.3 u，酶解片段不完全選擇為1個(gè)，離子選擇［M+H］和monoisotopic，固定修飾為半胱氨酸碘乙酰胺化，可變修飾為蛋氨酸氧化。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠肺組織HE病理片結(jié)果

見(jiàn)圖1。對(duì)照組小鼠肺組織鏡下結(jié)構(gòu)清晰，上皮、內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，血管無(wú)充血，間質(zhì)無(wú)滲出、增厚，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組小鼠肺組織鏡下可見(jiàn)大片肺組織間質(zhì)水腫，血管充血，肺泡腔內(nèi)大量滲出，肺泡間隔增厚，伴大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。提示動(dòng)物APALI模型成功建立。

A.對(duì)照組；B.APALI模型組。圖1 肺組織HE病理切片（20×）Figure 1 Pathological examination of mouse lung tissue by H-E staining（20×）

2.2 小鼠肺組織雙向凝膠電泳圖譜分析

通過(guò)雙向電泳技術(shù)獲得了分辨率高、重復(fù)性好的對(duì)照組小鼠與APALI模型小鼠肺組織雙向凝膠電泳圖譜（圖2）。分析同一樣本的3塊膠，相同蛋白質(zhì)點(diǎn)在不同膠的位置上有較好的重復(fù)性，從而建立了重復(fù)性較好的對(duì)照組小鼠與APALI模型小鼠肺組織雙向凝膠電泳圖譜。對(duì)照組小鼠與APALI模型小鼠肺組織分別有（1 135±50）個(gè)點(diǎn)和（1 027±50）個(gè)點(diǎn)得到分離，對(duì)照組匹配點(diǎn)數(shù)為（985±20）個(gè)，APALI模型組匹配點(diǎn)數(shù)為（918±15）個(gè)，其平均匹配率分別為86.7%和89.3%。對(duì)斑點(diǎn)位置進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)，在IEF方向的平均偏差為（1.05±0.17），SDSPAGE方向的平均偏差為（1.15±0.23），選取各組重復(fù)膠中均有相同變化且表達(dá)量相差2倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)為差異表達(dá)蛋白質(zhì)，結(jié)果共有32個(gè)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)，其中30個(gè)蛋白點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)上調(diào)，2個(gè)蛋白點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)下調(diào)（6號(hào)和22號(hào)點(diǎn)）。

A.對(duì)照組；B.APALI模型組（圖中標(biāo)記1-32點(diǎn)為在兩組中高表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，與表1中鑒定的蛋白質(zhì)點(diǎn)編號(hào)相對(duì)應(yīng)）。圖2 小鼠肺組織雙向凝膠圖譜Figure 2 2-DE of mouse lung tissue

2.3 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)MALDI-TOF-MS的鑒定

對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，共獲得了28個(gè)蛋白質(zhì)信息，9號(hào)、13號(hào)及30號(hào)蛋白質(zhì)點(diǎn)未鑒定出（見(jiàn)表1、圖2）。

2.4 差異蛋白質(zhì)功能分析

經(jīng)檢索，差異表達(dá)蛋白功能涉及氧化還原、細(xì)胞骨架變化、胞內(nèi)異常蛋白降解及能量代謝等過(guò)程，提示APALI發(fā)病過(guò)程中肺組織可能存在氧化應(yīng)激加重、組織細(xì)胞異常蛋白合成增加及能量代謝異常等改變。

3 討論

蛋白質(zhì)組學(xué)概念的提出及其研究技術(shù)的迅速發(fā)展，為人們從蛋白質(zhì)整體水平上尋找疾病相關(guān)分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)成為現(xiàn)實(shí)。蛋白質(zhì)組學(xué)在免疫、腫瘤形成等方面已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，在APALI研究尚處于初期階段。目前APALI發(fā)病機(jī)制的研究還主要集中于細(xì)胞因子和趨化因子，例如TNF-α、IL-1β、CINC/IL-8、CCR1、MIF（IL-18、IL-10）等在APALI病理過(guò)程中募集炎癥細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的研究［5-7］。而在蛋白質(zhì)表達(dá)水平上系統(tǒng)地對(duì)APALI進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以APALI小鼠模型肺組織為研究對(duì)象進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。成功構(gòu)建了APALI與正常肺組織的2-DE圖譜，通過(guò)質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，初步篩選出28種可能與APALI發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的蛋白質(zhì)。其中熱休克蛋白27（heat shock protein，HSP）、TCP1伴侶蛋白、蛋白酶體活化復(fù)合體、蛋白酶體α4亞單位、泛素結(jié)合酶等主要參與細(xì)胞內(nèi)保護(hù)穩(wěn)定正常蛋白、修復(fù)或降解異常蛋白等生化過(guò)程，在細(xì)胞受到有害刺激時(shí)可幫助維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，并參與細(xì)胞周期調(diào)控［8-9］。APALI發(fā)生時(shí)，肺組織存在廣泛炎癥浸潤(rùn)尤其是中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。活化的炎性細(xì)胞分泌大量蛋白酶、炎癥因子等，可導(dǎo)致肺組織細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞等）發(fā)生損傷，這些刺激因素可能導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生大量異常蛋白，誘導(dǎo)了分子伴侶蛋白和蛋白酶體相關(guān)蛋白、泛素結(jié)合酶等的應(yīng)激性表達(dá)上升［8］。凝溶膠蛋白和膠轉(zhuǎn)蛋白參與細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)，也可調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和凋亡，同時(shí)對(duì)T細(xì)胞免疫活力的維持也有重要作用［10-11］。APALI發(fā)病過(guò)程中，大量炎癥細(xì)胞被募集移行到肺組織，局部肺組織細(xì)胞大量凋亡，這些過(guò)程均涉及細(xì)胞骨架的劇烈變化［10-11］，可能引起凝溶膠蛋白和膠轉(zhuǎn)蛋白表達(dá)顯著上升。NADH-泛醌還原酶、UMP-CMP蛋白激酶、a-異檸檬酸脫氫酶、左旋乳酸脫氫酶、SEC14L3等則主要參與生物氧化、三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化反應(yīng)、氧化呼吸鏈、糖酵解和糖異生，可能反映了肺損傷狀態(tài)下肺組織細(xì)胞存在能量代謝異常［13］，并導(dǎo)致能量代謝相關(guān)酶的代償性表達(dá)上升［14］。Prx6（過(guò)氧化物酶6）有抗氧化和清除自由基的作用，在抗氧化應(yīng)激中有重要作用，同時(shí)還有PLA2活性，參與肺表面活性物質(zhì)的代謝［7］。其表達(dá)的增加也提示APALI發(fā)病后肺組織氧化應(yīng)激加重，導(dǎo)致相關(guān)抗氧化酶代償性增強(qiáng)。

表1 差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)檢索結(jié)果Table 1 Identification and characterization of proteins by MS

從本研究發(fā)現(xiàn)的差異蛋白功能類(lèi)型來(lái)看，肺組織炎癥浸潤(rùn)、組織細(xì)胞損傷是APALI重要病理過(guò)程，使肺組織處于高耗能、高代謝狀態(tài)。浸潤(rùn)炎性細(xì)胞的各種活性分泌物及損傷細(xì)胞的死亡解體，會(huì)顯著加重肺組織的氧化應(yīng)激負(fù)荷，在急性期誘導(dǎo)相關(guān)抗氧化酶的代償性表達(dá)。大量研究表明，氧化損傷在急性肺損傷中扮演重要角色，本研究結(jié)果表明氧化損傷在APALI發(fā)病早期也扮演重要角色，在APALI早期重視抗氧化治療或有助改善預(yù)后。

通過(guò)對(duì)APALI小鼠模型肺組織的蛋白質(zhì)組研究發(fā)現(xiàn)，在APALI造模過(guò)程中許多蛋白參與病理生理變化，大范圍的炎癥浸潤(rùn)可能導(dǎo)致了廣泛的肺組織細(xì)胞損傷，同時(shí)引起局部氧化應(yīng)激加重，影響機(jī)體的預(yù)后。因此，全面了解APALI蛋白質(zhì)表達(dá)變化的情況及生理功能作用機(jī)制，為APALI患者臨床治療、預(yù)后提供理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：幸建華）

中圖分類(lèi)號(hào)：R657.5+1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1006-8783（2016）03-0374-05

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016041402

收稿日期：2016-04-14

作者簡(jiǎn)介：冼慧儀（1981—），女，碩士，主要從事呼吸內(nèi)科學(xué)臨床及基礎(chǔ)研究，Email：xianhuiyi1111@163.com；通信作者：廖東江（1979—），男，助理研究員，主要從事蛋白質(zhì)組學(xué)研究，Email：liaodongjiang79@163.com。

Proteomics analysis of acute pancreatitis-associated lung injury in mice

XIAN Huiyi1，LU Xinpeng2，CAO Zhi3，CHEN Hongsheng2，LI Fenglei1，LIAO Dongjiang2
（1.Liwan Hospital of Guangzhou Medical College，Guangzhou 510120，China；2.State Key Laboratory of Respiratory Disease，Guangzhou 510230，China；3.Institute of Pharmaceutical Research，South China Normal University ，Guangzhou 510631，China）

AbstractObjective To screen the differentially expressed proteins of lung tissue between acute pancreatitis-associated lung injury APALI mice and wild type wt mice by using proteomics methods which may provide an evidence for study of the pathogenesis and prognosis of APALI.Methods 20 BALB/ c mice were randomly divided into the experimental and control groups.Caerulein was injected intraperitonealy to establish the APALI model.Mice were sacrificed after one day of caerulein injection and left lung was collected for pathology examination.Total proteins from right lung were extracted for 2-DE and proteomics research.The differentially expressed protein spots were identified to explicit the biological functions.Results The lung-injury symptoms were observed in experimental mice.The differentially expressed proteins were closely related to inflammatory and redox reactions.Conclusion Oxydative stress induced by inflammatory infiltration and tissue injury is crucial in the early development of APALI. Antioxydant treatment in the early stage may be helpful for prognosis of APALI.

Key wordsAPALI；animal model；proteomics