王玲玲陳思馬俊許巍岳濤趙振向王劍鋒王曉棠劉藝鳴

帕金森病患者外周血單核細胞CD14和TLR4中mRNA的表達水平☆

王玲玲*陳思*馬俊*許巍*岳濤*趙振向*王劍鋒*王曉棠*劉藝鳴*

目的 研究帕金森病患者外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）脂多糖受體（cluster of differentiation 14，CD14）和toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）中mRNA的表達并探討其在疾病發(fā)生發(fā)展中的臨床意義。方法本實驗共入組44例帕金森病患者和37例性別、年齡相匹配的健康對照者，并詳細記錄入組的44例帕金森病患者發(fā)病年齡、病程、性別，在關期時對帕金森病患者進行H-Y分期、UPDRSⅡ、UPDRSⅢ、NMSS評分，利用RT-PCR技術檢測各研究對象PBMC中CD14和TLR4中mRNA的表達。結(jié)果 帕金森病患者外周血CD14 mRNA表達水平（1.459±0.658）2-△△CT、TLR4 mRNA（1.408±0.698）2-△△CT表達較健康對照者（（1.162±0.631）2-△△CT、（1.122±0.557）2-△△CT）均顯著增加（P均＜0.05）。相關性分析顯示帕金森病組CD14 mRNA的表達水平與反應帕金森病疾病嚴重程度的H-Y分期呈顯著正相關（P＜0.05）。結(jié)論帕金森病患者外周血CD14 mRNA表達與其H-Y分期正相關，提示CD14/TLR4的單核細胞所介導的固有免疫反應可能是帕金森病發(fā)生、發(fā)展的一個重要因素。

帕金森病單核細胞信使RNA TLR4

【Abstract】Objective To investigate the expression levels of the CD14 mRNA and TLR4 mRNA in peripheral blood mononuclear cells from patients with Parkinson disease and to explore the clinical signicance.Methods Forty-four patients with Parkinson disease and 37 healthy controls were recruited.We recorded age of onset，duration of illness and sex of all recruited patients.PD patients were evaulated using the Hoehn-Yahr stages，Unified Parkinson Disease Rating Scale（UPDRS）Ⅱand UPDRSⅢ，non-motor symptoms scale（NMSS）on“off”time.Reverse transcription-polymerase chain reaction was performed to determine the expression levels of CD14 mRNA and toll-like receptor 4 （TLR4）mRNA.Results The expression levels of CD14 mRNA（1.459±0.658）2-△△CTand TLR4 mRNA（1.408±0.698）2-△△CTwas significantly up-regulated（P＜0.05）in Parkinson disease compared with controls（1.162±0.631）2-△△CT、（1.122± 0.557）2-△△CT）.In addition，there was positive correlation between the expression levels of CD14 mRNA in Parkinson disease patients with the Hoehn-Yahr stages.Meanwhile，there was no significant correlation between the expression levels of CD14 mRNA and TLR4 mRNA with other clinical scores.Conclusions There is positive correlation between the expression levels of CD14 mRNA in Parkinson disease patients with the Hoehn-Yahr stages，indicating that CD14/TLR4positive monocyte may be involved in the pathogenesis of the Parkinson disease.

【Key words】Parkinson disease Monocytes RNA Messenger TLR4

帕金森?。≒arkinson disease，PD）是常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾?。?］，臨床表現(xiàn)除典型的運動癥狀外，常伴有便秘、抑郁、感覺異常等非運動癥狀，其發(fā)病機制至今仍不十分明確。PD的病因很多，包括遺傳因素、環(huán)境因素、年齡老化、氧化應激、免疫炎癥等，免疫炎癥因素近來受到更多的關注。

盡管目前對PD的中樞免疫炎性機制的研究較多［2-4］，但關于PD的外周固有免疫的研究較少。單核細胞是外周固有免疫應答的重要組成部分，本實驗旨在探討PD外周血單核細胞中CD14和TLR4mRNA的表達水平及其與PD的臨床評分的相關性，并探討免疫異常在PD發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1　對象與方法

1.1研究對象 隨機選取2014年11月至2015年5月于山東大學齊魯醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診和病房就診的原發(fā)性PD患者44例。PD的診斷標準采用中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會運動障礙及帕金森病學組［5］制定的帕金森病診斷標準：（一）診斷帕金森病 1.運動減少；2.至少存在下列1項特征：①肌肉強直；②靜止性震顫（4～6Hz）；③姿勢不穩(wěn)。（二）必須排除非帕金森病①反復的腦卒中發(fā)作史，伴帕金森病特征的階梯式進展；②反復的腦損傷史；③明確的腦炎和非藥物所致動眼危象；④在癥狀出現(xiàn)時，正在接受神經(jīng)安定劑治療和多巴胺耗竭劑；⑤1個以上的親屬患??；⑥病情持續(xù)緩解或發(fā)展迅速；⑦發(fā)病3年后，仍是嚴格的單側(cè)受累；⑧CT掃描可見顱內(nèi)腫瘤或交通性腦積水；⑨用大劑量左旋多巴治療無效（除外吸收障礙）；⑩出現(xiàn)其他神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和體征。（三）支持診斷帕金森病必須具備下列3項或3項以上的特征①單側(cè)起病；②靜止性震顫；③逐漸進展；④發(fā)病后多為持續(xù)性的不對稱性受累；⑤對左旋多巴的治療反應非常好（70%～100%）；⑥臨床病程10年以上（含10年）；⑦左旋多巴導致的嚴重的異動癥；⑧左旋多巴的治療效果持續(xù)5年以上（含5年）。排除標準：①合并有心肝腎功能不全者；②合并有惡性腫瘤者；③近期有感染或服用免疫相關制劑；④合并有自身免疫性疾病者；⑤認知功能障礙。37例健康對照者均來自健康體檢中心，性別年齡與PD患者相匹配，且實驗室檢查結(jié)果均正常。所有PD患者及健康對照者嚴格排除感染、局部炎癥反應等不良影響，所有入組成員入組時近期均無感染，均無自身免疫疾病病史。本實驗通過山東大學齊魯醫(yī)院倫理委員會批準，且所有的研究對象均知情且簽署知情同意書。44例PD患者中女20例，男24例；年齡40～72歲（57.046±9.376），病程1～10年（6.216±2.792）；37例健康對照者中女性18例，男性19例；年齡42～73歲（56.811±6.859）。PD組與健康對照組一般臨床資料無統(tǒng)計學差異。

1.2研究方法

1.2.1臨床資料收集 所有入組的PD患者均由神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師詳細地詢問病史，并記錄性別、發(fā)病年齡、病程，并在關期時對PD患者進行H-Y分期、UPDRSⅡ、UPDRSⅢ、NMSS評分。所有的研究對象均進行MMSE評分。

1.2.2提取PBMC中的RNA每個研究對象均抽取空腹服藥前的肘靜脈血4 mL，并用淋巴細胞分離管分離提取PBMC，加入1 mL trizol（invitrogen）混勻后提取RNA。

1.2.3逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢 測CD14 mRNA和TLR4 mRNA運用RT-PCR方法，按照Prime ScriptTMRT（TaRaKa公司）的說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應得到cDNA，按照PCR說明書（TaRa-Ka公司）進行PCR反應，反應結(jié)束后以SDS 3.3軟件分析其ct值及計算相對表達量（relative quantity，RQ），RQ=2-△△CT。

1.3統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)均以（x±s）表示，各組間外周血CD14 mRNA、TLR4 mRNA表達水平的比較用兩獨立樣本的t檢驗，相關性分析用Spearson和Pearson相關分析。所有數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，檢驗水準α=0.05。

2　結(jié)果

2.1 一般臨床資料 本實驗共納入44例PD患者和37性別年齡相匹配的健康對照者。PD組患者的性別、年齡和MMSE評分與健康對照組相比，兩組病例資料無顯著統(tǒng)計學差異（χ2=0.082，P=0.75；t=-0.13，P=0.897；t=-0.575，P=0.567），見表1。44例PD患者按H-Y分期分為4組，H-Y分期為2分組6例，H-Y分期為2.5分組15例，H-Y分期為3分組17例，H-Y分期為4分組6例。

2.2 CD14 mRNA和TLR4 mRNA的表達水平PD組的CD14 mRNA、TLR4 mRNA的表達水平均顯著高于對照組（t=-2.061，P=0.043；t=-2.011，P= 0.048），兩組間CD14 mRNA、TLR4 mRNA的表達水平有統(tǒng)計學差異（P均＜0.05）（見表2）。CD14 mRNA、TLR4 mRNA的熔解曲線（見圖1）。

圖1 CD14 mRNA、TLR4 mRNA及內(nèi)參照GAPDH的熔解曲線

2.3 CD14 mRNA和TLR4 mRNA的表達水平與UPDRSⅡ、UPDRSⅢ、NMSS評分及H-Y分期的相關性統(tǒng)計結(jié)果顯示，CD14 mRNA的表達水平與H-Y分期均呈顯著正相關（r=0.315，P=0.038），TLR4 mRNA的表達水平與H-Y分期不相關（r= 0.258，P=0.091）（見表3）；PD組內(nèi)CD14 mRNA和TLR4 mRNA的表達與UPDRSⅡ（r=0.03，P=0.845；r=-0.161，P=0.296）、UPDRSⅢ（r=-0.019，P=0.901；r=-0.054，P=0.726）、NMSS（r=0.09，P=0.56； r=-0.143，P=0.353）均不存在相關性。

表1一般臨床資料

表2 CD14 mRNA和TLR4 mRNA的表達水平

表3 CD14 mRNA、TLR4 mRNA的表達水平與H-Y分期的相關性分析

2.4不同發(fā)病年齡和病程的PD患者CD14 mRNA 和TLR4 mRNA表達水平比較 PD組按發(fā)病年齡是否超過50歲分為2組，發(fā)病年齡不超過50歲組（≤50歲）21例，發(fā)病年齡超過50歲組（＞50歲）23例，兩組CD14 mRNA和TLR4 mRNA的表達水平無統(tǒng)計學差異（t=0.684，P=0.498；t=1.56，P=0.126）；按病程是否超過5年分為2組，病程不超過5年組（≤5年）19例，病程超過5年組（＞5年）25例，兩組CD14 mRNA和TLR4 mRNA的表達水平無顯著差異（t=-0.157，P=0.876；t=0.044，P=0.965）。

3　討論

固有免疫是機體防御病原微生物入侵的第一道防線，其參與PD的致病于1988年由McGeer等［6］發(fā)現(xiàn)的。但PD固有免疫方面的研究大部分與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關［2，7-8］，外周固有免疫方面的研究較少。

CD14主要在單核巨噬細胞表達，TLR4在髓源性細胞（如單核巨噬細胞）上表達［9］，CD14/TLR4協(xié)同作用，能識別革蘭陰性桿菌脂多糖，通過激活下游一系列信號通路參與固有免疫應答［10-11］。FUNK等［12］研究發(fā)現(xiàn)，PD患者外周血單核細胞前體細胞較健康對照者增多，但單核細胞占外周血白細胞總數(shù)的比例與健康對照者無明顯差異；PD患者經(jīng)典型單核細胞的單核細胞趨化因子受體CCR2表達較健康對照者增多，這提示PD患者的單核細胞可能存在調(diào)節(jié)異常。

研究發(fā)現(xiàn)，PD患者腦脊液中單核細胞CD14的前體的可溶性形式增多［13］，新近動物實驗結(jié)果也證實PD小鼠模型腦內(nèi)的CD14表達增多［14］。PD患者腦脊液標本獲取困難，尋找PD患者外周血單核細胞CD14的表達與PD發(fā)生發(fā)展過的關系及CD14在外周血中的作用機制有重要的臨床意義。GROZDANOV等［15］近來研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照者相比，帕金森患者外周血的單核細胞總數(shù)無顯著差異，但CD14+單核細胞的所占的比例較大；分離培養(yǎng)帕金森患者的單核細胞，對脂多糖刺激表現(xiàn)為過度激活狀態(tài)，且其過度激活的程度與PD的嚴重程度相關。本實驗結(jié)果顯示，PD患者的CD14 mRNA表達較健康對照者增加，且與關期時的H-Y分期呈顯著正相關，而H-Y分期能評估PD病情進展程度，這與GROZDANOV等的研究結(jié)果一致，這提示CD14陽性的單核細胞可能在PD的發(fā)生、進展過程起重要作用。本實驗還發(fā)現(xiàn)，CD14 mRNA的表達與關期時的UPDRSⅡ、UPDRSⅢ、NMSS均無相關性，這可能是由于UPDRS 及NMSS評分是對PD癥狀學嚴重程度的提示，這與PD患者臨床癥狀表現(xiàn)多樣有關，不能準確提示PD病情的嚴重程度，因此說明CD14 mRNA的表達與可能與PD癥狀學嚴重程度無明顯相關性。

TLR4是固有免疫的病原體相關分子模式的受體，單核細胞是機體參與外周固有免疫應答的重要細胞之一，ZHANG等［16］發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病患者外周血中的T LR4 mRNA表達增多，且TLR4 mRNA的表達與MMSE評分呈負相關，DROUIN等［17］對帕金森患者外周血的研究發(fā)現(xiàn)，中間型單核細胞和B淋巴細胞TLR4表達明顯增加，經(jīng)典型單核細胞TLR4有表達增加的可能性，T淋巴細胞的表達與正常人相比沒有顯著差異。本實驗結(jié)果顯示，PD患者的TLR4 mRNA的表達較健康對照者顯著增加，提示TLR4可能參與PD的致病過程。另外，本實驗還發(fā)現(xiàn)了PD患者外周血TLR4的表達與關期時的H-Y分期不正相關，且外周血標本易于獲得，這提示我們TLR4可能參與PD病情的發(fā)生發(fā)展，可以考慮用于評估PD患者的病情。

本實驗還將PD患者按發(fā)病年齡、病程進行分組，比較各組間CD14 mRNA、TLR4 mRNA的表達，結(jié)果顯示各組間均無統(tǒng)計學差異，本實驗入組標準嚴格，樣本量小，其表達與發(fā)病年齡、病程等因素無關的實驗結(jié)果尚需進一步的探討。

固有免疫激活及其誘導的炎癥反應在PD的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用［2，7］。本實驗發(fā)現(xiàn)帕金森患者的單個核細胞CD14mRNA和TLR4 mRNA表達增多，且CD14mRNA與疾病的嚴重程度有相關性，但本研究未對外周血中的單個核細胞進一步分類，亦未涉及到CD14/TLR4激活的下游信號通路的變化，有待于在以后的實驗中深入研究。

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（責任編輯：李立）

Expressions of CD14 mRNA and TLR4 mRNA in peripheral blood mononuclear cells in patients with Par-kinson disease.

WANG Lingling，CHEN Si，MA Jun，XU Wei，YUE Tao，ZHAO Zhenxiang，WANG Jianfeng，WANG Xiaotang，LIU Yiming.Department of neurology，Qilu Hospital of Shandong University，Jinan 250012，China.Tel：0531-82169114.

R745

A

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.02.009
☆山東省科技攻關項目（編號：2014GSF118024）
*山東大學齊魯醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（濟南250012）

（E-mail：amyliu831@163.com）

2015-08-17）