次仁旺姆

西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所,西藏　拉薩　850000

?

民族醫(yī)藥

藏藥綠絨蒿的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

次仁旺姆

西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所,西藏拉薩850000

【摘要】目的：建立三種藏藥綠絨蒿的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：考察藥材基源；采用顯微和薄層色譜法對(duì)樣品進(jìn)行鑒別；采用高效液相色譜法測(cè)定木犀草素的含量：Waters Xselect C18 (250mm × 4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸水溶液(55∶45)；檢測(cè)波長(zhǎng)：350nm；進(jìn)樣量10μl，流速為1.0ml/min。結(jié)果：將綠絨蒿的植物基源規(guī)定為罌粟科植物全緣綠絨蒿M.Integrifolia (Maxim.)Franch.、毛瓣綠絨蒿 M. torquata Prain.及五脈綠絨蒿 M. quintuplinervia Regel的干燥全草，并進(jìn)行薄層檢測(cè)及含量測(cè)定；木犀草素線性范圍為32.811～656.280μg，R2=1,方法回收率為94.86%，RSD為1.27%。結(jié)論：制定了藏藥綠絨蒿的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為該品種的質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】綠絨蒿；高效液相色譜法；薄層色譜；木犀草素

綠絨蒿為藏族習(xí)用藥材，收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥》第一冊(cè)[1]。藏藥綠絨蒿具有清熱，利尿，消炎，止痛等作用，用于治療肺炎，肝炎，肝與肺的熱癥，水腫。在《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥》第一冊(cè)上只有其性狀和顯微鑒別，無(wú)其他檢測(cè)項(xiàng)目，檢測(cè)方法有限，且植物的基源有些混用。對(duì)綠絨蒿質(zhì)量控制方法進(jìn)行研究，以建立能有效控制其質(zhì)量的藥材標(biāo)準(zhǔn)。

1儀器與材料

1.1儀器Spectra system?液相色譜儀(Waters公司；Mettler XP205型電子天平(精密度為十萬(wàn)分之一)；Mettler XP504電子天平(精密度為萬(wàn)分之一)。

1.2材料木犀草素對(duì)照品(批號(hào)：111520-200504，中國(guó)生物制品檢定所)；對(duì)照藥材(取自西藏藥檢所標(biāo)本室，經(jīng)格桑索朗主任藥師鑒定為全緣綠絨蒿)。乙腈、甲醇為色譜純，水為純凈水，其它試劑為分析純。10批綠絨蒿藥材為各地采集或收集。見(jiàn)表1。

表1　綠絨蒿樣品來(lái)源一覽表

2方法與結(jié)果

2.1基源衛(wèi)生部頒《藥品標(biāo)準(zhǔn)》藏藥中，綠絨蒿為罌粟科植物全緣綠絨蒿Meconopsisintegrifolia(Maxim.) Franch.及五脈綠絨蒿M.quintuplinerviaRegel、長(zhǎng)葉綠絨蒿M.LancifoliaFranch.等的干燥全草。

據(jù)本課題組在西藏，青海和云南等地實(shí)際樣品采集過(guò)程中發(fā)現(xiàn)綠絨蒿藥用來(lái)源主要為全緣綠絨M.integrifolia(Maxim.) Franch.及五脈綠絨蒿M.quintuplinerviaRegel。后經(jīng)文本考證[2-4]，長(zhǎng)葉綠絨蒿主要分布于東北和華北地區(qū)，藏醫(yī)臨床較少用。西藏藏醫(yī)臨床使用較多為全緣綠絨蒿及毛瓣綠絨蒿，青海、云南等藏醫(yī)臨床使用較多為五脈綠絨蒿。故將綠絨蒿的植物基源規(guī)定罌粟科植物全緣綠絨蒿M.Integrifolia(Maxim.)Franch.、毛瓣綠絨蒿M.torquataPrain.及五脈綠絨蒿M.quintuplinerviaRegel的干燥全草。

2.2顯微鑒別采用常規(guī)生藥鑒定方法，分別對(duì)上述樣品粉末制片觀察并對(duì)其進(jìn)行了顯微照相。主要特征如下：

2.2.1全緣綠絨蒿粉末呈淺橙黃色。表皮毛多見(jiàn)，多細(xì)胞組成，碎斷，呈柱狀，基部至頂端多分枝，頂細(xì)胞尖，直徑約至45μm，可見(jiàn)圓形壁孔。導(dǎo)管較多見(jiàn)，直徑約至15μm，單個(gè)，或數(shù)個(gè)結(jié)合，多碎斷，具梯紋、網(wǎng)紋、紋孔排列整齊。花粉粒多見(jiàn)，圓球形，直徑80μm，棕黃色，壁較厚，表明梳稀疣狀突起。見(jiàn)圖1。

2.2.2五脈綠絨蒿粉末灰綠色。表皮毛多見(jiàn)，多細(xì)胞組成，碎斷，呈柱狀，基部至頂端多分枝，頂細(xì)胞尖，直徑約至75μm，可見(jiàn)圓形壁孔。導(dǎo)管多螺紋,亦見(jiàn)網(wǎng)紋及環(huán)紋,直徑約至15μm?；ǚ哿６嘁?jiàn)，圓球形，直徑約至50μm，棕黃色，壁薄，表明紋理狀。氣孔不定式，副衛(wèi)細(xì)胞4～5個(gè)。

導(dǎo)管　　 　　氣孔　　　表皮毛　　　花粉粒圖1　全緣綠絨蒿的顯微鏡特征

2.2.3毛瓣綠絨蒿粉末淺綠色。表皮毛多見(jiàn)，多細(xì)胞組成，碎斷，呈柱狀，基部至頂端多分枝，頂細(xì)胞尖，直徑約至75μm，長(zhǎng)至750μm，可見(jiàn)圓形壁孔。導(dǎo)管多為螺紋和梯紋，直徑約至15μm。花粉粒多見(jiàn)，圓球形，直徑約至50μm，棕黃色，壁較厚，表明緊密疣狀突起。氣孔不定式，副衛(wèi)細(xì)胞4～5個(gè)。

2.3薄層色譜鑒別

2.3.1供試品溶液的制備取本品粉末約2.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，超聲處理(功率200 W，頻率40kHz)兩次，每次30min，過(guò)濾，合并濾液，濃縮并定容至10ml，即得。

2.3.2對(duì)照藥材溶液的制備另取綠絨蒿對(duì)照藥材1g，同法制成對(duì)照藥材溶液。

2.3.3薄層色譜法按照2010版中國(guó)藥典一部附錄VI B試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一羧甲基纖維素鈉溶液制備的硅膠G薄層板上。以環(huán)己烷-醋酸乙酯(6∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。置紫外光燈(365 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

1　　2 　3　　4 　5　　6 　7　　8 　9 　10 　111～10綠絨蒿樣品；11綠絨蒿對(duì)照藥材圖2　綠絨蒿的薄層鑒別

3含量測(cè)定

3.1色譜條件色譜柱：Waters Xselect C18 (250 mm × 4.6 mm, 5μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸水溶液(55∶45)；檢測(cè)波長(zhǎng)：350nm；進(jìn)樣量10μl；流速為1.0ml/min；用紫外檢測(cè)器檢測(cè)。在此條件下，木犀草素和其它組分均能達(dá)到基線分離。供試品中木犀草素保留時(shí)間與對(duì)照品一致。見(jiàn)圖3。

3.2供試品溶液的制備取本品粉末約2.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，超聲處理(功率200W，頻率40kHz)兩次，每次30min，過(guò)濾，合并濾液，濃縮并定容至10ml，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

圖3　樣品的HPLC色譜圖

3.3對(duì)照品溶液的制備取木犀草素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含30μg的溶液，即得。

3.4線性范圍的考察精密吸取對(duì)照品溶液各1、2、4、8、16、20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定其峰面積，并以峰面積為縱坐標(biāo)，木犀草素量(μg)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=4021.6X+7903.7，R2=1(n=6)。結(jié)果表明：木犀草素在32.811～656.280μg之間與峰面積線性關(guān)系良好。見(jiàn)圖4。

圖4　木犀草素標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.5精密度試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液(32.814μg/ml )10μl，注入液相色譜儀，共6次，記錄色譜圖，6次測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于2%，表明該方法精密度良好。

3.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將新配制的供試品溶液，在上述色譜條件下在0、1、3、8、15、24h測(cè)定測(cè)得木犀草素的峰面積，計(jì)算其RSD。結(jié)果表明：在24h內(nèi)，該方法具有較好的穩(wěn)定性。見(jiàn)表2。

3.7加樣回收試驗(yàn)取已知含量的供試品(木犀草素的含量為0.306mg/g)6份，分別精密加入對(duì)照品溶液(0.9115mg/ml)0.5ml，再照供試品溶液的制備法提取，按確定的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果表明：平均回收率為94.86%，RSD為1.27%，表明該方法回收率良好。見(jiàn)表3。

3.8樣品測(cè)定取所收集的10批樣品， 按上述提取和色譜條件，對(duì)10批次的綠絨蒿進(jìn)行了含量測(cè)定，求得各樣品中木犀草素的含量。，見(jiàn)表6。

表2　穩(wěn)定性考察結(jié)果

表3　木犀草素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

表4　10批供試品測(cè)定結(jié)果　(n=2)

4討論

4.1從供試品的測(cè)定結(jié)果可以看出,綠絨蒿中木犀草素含量相差10倍多，若按以木犀草素含量平均值下浮20%制定其含量下限，西藏、云南、青海三地的一半綠絨蒿都不合格，容易造成資源的浪費(fèi)。為了很好的控制藥物質(zhì)量，保護(hù)藥材資源，故規(guī)定綠絨蒿中木犀草素(C15H10O6)的含量暫定為：本品每克含木犀草素(C15H10O6)不得少于0.050mg。

4.2 在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中，新增了【檢查】項(xiàng)下的水分、總灰分和酸不溶性灰分的檢查以及【浸出物】等項(xiàng)，在這里不再一一列出。

4.3實(shí)驗(yàn)用的樣品基源有罌粟科植物全緣綠絨蒿、毛瓣綠絨蒿及五脈綠絨蒿。經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)這三種綠絨蒿在薄層鑒別和含量測(cè)定中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均一致，說(shuō)明本質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究適用于這三種綠絨蒿的檢測(cè)。

4.4經(jīng)過(guò)反復(fù)的試驗(yàn)，薄層色譜行為的重現(xiàn)性良好，專屬性強(qiáng)， Rf值適中，分離效果好，因此可以將此方法定為綠絨蒿藥材的定性鑒別。

4.5將木犀草素對(duì)照品甲醇溶液在200～400nm內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，測(cè)得其在349.4nm 有最大吸收。且對(duì)照品色譜峰與其它峰達(dá)到良好的基線分離，雜質(zhì)干擾少，峰形好。

參考文獻(xiàn)

[1] 中國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)[S].藏藥(第一冊(cè)).1995:98-99.

[2] 羅達(dá)尚,孫安玲,夏光成.青藏高原藏藥-綠絨蒿屬植物資源初探[J].中草藥,1984,15 (8): 23-24.

[3] 楊永昌. 藏藥志[M]. 西寧: 青海人民出版社,1991：465-468.

[4] 中華本草編委會(huì).中華本草(藏藥卷)[M].上海:上?？萍汲霭嫔?2002：101-102；169.

作者簡(jiǎn)介：次仁旺姆，女，主管藥師，主要從事藥品檢驗(yàn)及藏藥標(biāo)準(zhǔn)提高工作。

【中圖分類號(hào)】R29

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1007-8517(2016)11-0001-03

(收稿日期：2016.03.29)