20種真菌對(duì)白木香揮發(fā)油成分的影響

王東光， 張寧南， 楊曾獎(jiǎng)， 劉小金， 洪　舟， 徐大平

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所， 廣東 廣州 510520)

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20種真菌對(duì)白木香揮發(fā)油成分的影響

王東光， 張寧南， 楊曾獎(jiǎng)， 劉小金， 洪舟， 徐大平

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所， 廣東 廣州 510520)

摘要：【目的】檢測(cè)20種真菌對(duì)白木香Aquilaria sinensis樹(shù)體揮發(fā)油成分的影響?！痉椒ā客ㄟ^(guò)輸液法的通體結(jié)香技術(shù)，將不同菌液注入廣東省惠東縣境內(nèi)白木香樹(shù)體內(nèi)，運(yùn)用GC-MS技術(shù)分析變色木質(zhì)部乙醇浸出物的化學(xué)成分。【結(jié)果】經(jīng)龍眼焦腐病菌Lasiodiplodia theobromae、斑點(diǎn)青霉Penicillium meleagrinum、黑綠木霉Trichoderma atroviride、擬康木霉T. koningiopsis、青霉病病原菌Pen. italicum、腐皮鐮孢Fusarium solani、葡萄座腔菌Botryosphaeria rhodina 這7種真菌菌液處理的白木香目標(biāo)樹(shù)乙醇浸出物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)10%，且倍半萜、芳香族類和2-(2-苯乙基)色酮類相對(duì)含量之和分別為：21.57%、 21.85%、 24.02%、 22.83%、 23.49%、 25.15%和24.84%，而其他13種真菌處理樹(shù)體乙醇浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于10%，主要檢出物質(zhì)為脂肪酸和烷烴類物質(zhì)，倍半萜和芳香族類物質(zhì)的相對(duì)含量之和僅為2.67%～7.88%，不含2-(2-苯乙基)色酮類物質(zhì)?！窘Y(jié)論】20種待測(cè)菌種中，只有7種真菌能有效促進(jìn)白木香樹(shù)體沉香物質(zhì)的形成，而其他13種真菌效用不明顯。

關(guān)鍵詞：白木香； 氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀； 真菌； 揮發(fā)油； 沉香

沉香為瑞香科Thymelaeaceae沉香屬Aquilaria或擬沉香屬Gyrinops包括19個(gè)樹(shù)種在內(nèi)的樹(shù)體受傷(包括雷擊、動(dòng)物啃食、昆蟲(chóng)蛀干或其他微生物侵染)后所得的特殊的心材物質(zhì)[1]。沉香主要的活性化學(xué)成分為倍半萜、2-(2-苯乙基)色酮以及芳香族化合物，無(wú)論是國(guó)際上還是國(guó)內(nèi)，在評(píng)判沉香質(zhì)量時(shí)，常以3類化合物中的1種或幾種化學(xué)物質(zhì)為特征成分來(lái)分級(jí)[2]。沉香藥材對(duì)治療腸胃病、心絞痛等疾病有特效，是中國(guó)、印度、日本、尼泊爾及東南亞各國(guó)的傳統(tǒng)名貴藥材[3]。從結(jié)香木質(zhì)部提取的芳香油，具有特殊香味，是高級(jí)香味產(chǎn)品的主要原材料。此外，沉香也是世界五大教公認(rèn)的祭祀圣物[4]。天然的沉香樹(shù)，受到刺激而產(chǎn)生排異反應(yīng)，形成沉香，是一個(gè)偶發(fā)的現(xiàn)象，而且需要經(jīng)歷一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程。近年來(lái)，人們對(duì)沉香資源需求的增長(zhǎng)和已有天然沉香的毀滅性采掘?qū)е绿烊怀料阗Y源已幾近枯竭。為了保障沉香資源的合理和可持續(xù)利用，2004年開(kāi)始，《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》已將這19種結(jié)香樹(shù)種列為Ⅱ級(jí)保護(hù)植物。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)沉香樹(shù)種植面積已達(dá)3 000萬(wàn)株[5]，健康沉香樹(shù)無(wú)法結(jié)香，且傳統(tǒng)的人工造傷技術(shù)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足社會(huì)的需求，人工促進(jìn)結(jié)香技術(shù)的改進(jìn)已勢(shì)在必行。研究表明，沉香樹(shù)受到損傷后，在傷口處會(huì)有真菌侵入樹(shù)體，激發(fā)樹(shù)體的防御體系，從而在真菌和樹(shù)體內(nèi)酶的作用下產(chǎn)生一些具有抑菌活性的次生代謝產(chǎn)物，這些次生代謝產(chǎn)物即為沉香[6]。人工接菌促進(jìn)結(jié)香的歷史可以追溯到1929年，所使用的菌種為結(jié)香樹(shù)體分離的內(nèi)生真菌[7]。研究表明，感染黃綠墨耳菌Melanotusflavolives的白木香木質(zhì)部細(xì)胞，2個(gè)月后可以產(chǎn)生一種倍半萜類物質(zhì)，即白木香醛[8]。何夢(mèng)玲等[9]也運(yùn)用此種真菌處理白木香繼代培養(yǎng)小苗的離體側(cè)根，表明離體根在真菌侵染脅迫下能重新合成色酮化合物。

多種真菌均可以促進(jìn)沉香樹(shù)體結(jié)香，但其促進(jìn)效果在不同的生長(zhǎng)環(huán)境下表現(xiàn)不盡相同[10-11]。本研究中，利用已分離的20個(gè)真菌菌種，將其接種于廣東惠州惠東境內(nèi)的白木香Aquilariasinensis樹(shù)體中，通過(guò)比較不同菌種菌液促使樹(shù)體產(chǎn)生沉香物質(zhì)的化學(xué)成分差異，來(lái)評(píng)價(jià)各菌種的有效性，從而篩選出最適于本地白木香樹(shù)體結(jié)香的菌種。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)材料為廣東種源的7年生白木香，試驗(yàn)地位于廣東省惠州市惠東縣白盆珠鎮(zhèn)蓮花山，為花崗巖地質(zhì)；南亞熱帶季風(fēng)氣候，年均氣溫22.0 ℃，年均日照2 038.9 h，≥10 ℃年積溫7 947.9 ℃ ；年均降雨量1 935.7 mm；年均相對(duì)濕度80%，年蒸發(fā)量1 875 mm，常年基本無(wú)霜；土壤為山地紅壤。不同真菌分離自已結(jié)香的白木香樹(shù)體、樹(shù)樁和根系，從分離的54株不同種菌株中，選擇20種具有代表性或有研究表明其對(duì)結(jié)香有效的菌種，且涵蓋幾乎所有已報(bào)道的菌種(表1)。目標(biāo)樹(shù)胸徑約為9～10 cm，樹(shù)高和冠幅無(wú)顯著差異(表1)，有利于不同真菌對(duì)白木香樹(shù)體結(jié)香促進(jìn)作用大小的檢測(cè)。

1.2試驗(yàn)方法

于2014年7月，用選取的20個(gè)真菌菌種進(jìn)行結(jié)香試驗(yàn)。先把選出的菌種轉(zhuǎn)接到裝有500 mL已滅菌的馬鈴薯葡萄糖水(廣東環(huán)凱生物科技有限公司)溶液的錐形瓶中，28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)5 d后，將其用單層醫(yī)用紗布過(guò)濾到大樹(shù)輸液袋中備用。對(duì)照為無(wú)菌葡萄糖水，每個(gè)處理設(shè)3株重復(fù)，每個(gè)重復(fù)注入樹(shù)體的真菌代謝液為500 mL。選取胸徑約為9～10 cm的白木香樹(shù)，在目標(biāo)樹(shù)距地面50 cm處部位鉆孔，孔徑為0.5 cm,兩孔相距10 cm,且呈90 °交叉,孔深6 cm。選擇晴朗無(wú)風(fēng)的天氣，將菌液以最快的速度注入樹(shù)干。2015年5月進(jìn)行采樣測(cè)定。

1.3揮發(fā)油測(cè)定

3個(gè)重復(fù)的樣品木材原盤磨成粉，合并混勻，過(guò)20目篩，于60 ℃條件下恒溫干燥至恒質(zhì)量。取樣品約3 g置于150 mL錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇100 mL，連接冷凝回流管，加熱至沸騰，1 h后冷卻蒸干，計(jì)算乙醇浸出物含量。

1.4GC-MS分析

沉香揮發(fā)油成分分析采用氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)，安捷倫 6890 N-5975I)。GS-MS條件：色譜柱DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；起始溫度60 ℃，保持2 min后，以8 ℃·min-1的速度升至280 ℃，并保持12 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣量1 μL(不分流)；色譜-質(zhì)譜接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電離方式EI；電子能量70 eV；載氣He(體積分?jǐn)?shù)為99.999%)；載氣流速1 mL·min-1；質(zhì)量掃描范圍35～450 AMU；溶劑延遲4 min。通過(guò)HPMSD化學(xué)工作站，采用峰面積歸一化法計(jì)算各化學(xué)成分相對(duì)含量，再通過(guò)NIST和Willy標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)，經(jīng)人工譜圖解析和計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索，同時(shí)與相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行核對(duì)[2,12-14]，確認(rèn)所測(cè)定的化合物成分。

表1真菌種類及目標(biāo)樹(shù)基本特征1)

Tab.1Fungal species and basic characteristics of the sampling trees

處理真菌種類目標(biāo)樹(shù)胸徑/cm樹(shù)高/m冠幅/mF1蒙塔腔菌科Montagnulaceaesp.9.82±0.28a5.60±0.12a2.70±0.21aF2龍眼腐爛菌Lasiodiplodiapseudotheobrome9.67±0.19a5.52±0.19a2.07±0.34aF3龍眼焦腐病菌L.theobromae9.25±0.43a5.43±0.19a2.67±0.26aF4附球抱菌屬Epicoccumsorghi9.34±0.15a5.23±0.26a2.30±0.06aF5生赤殼屬Bionectriasp.9.29±0.13a5.52±0.14a2.40±0.15aF6肉座菌Hypocreasp.9.47±0.44a5.77±0.09a2.10±0.12aF7擬盤多孢毛屬Pestalotiopsissp.9.88±0.38a5.75±0.08a2.23±0.22aF8斑點(diǎn)青霉Penicilliummeleagrinum9.33±0.33a5.68±0.04a2.40±0.17aF9橘青霉Pen.citrinum9.47±0.38a5.23±0.30a2.07±0.09aF10叢赤殼屬Nectriasp.9.63±0.42a5.65±0.13a2.97±0.44aF11光黑殼屬Preussiaminima9.38±0.17a5.73±0.07a2.10±0.10aF12白木香內(nèi)生真菌Phaeoacremoniumrubrigenum9.52±0.42a5.13±0.19a2.13±0.49aF13稻黑孢菌Nigrospraoryzae9.70±0.64a5.17±0.32a2.47±0.37aF14黑綠木霉Trichodermaatroviride9.33±0.18a5.45±0.14a2.30±0.06aF15擬康木霉T.koningiopsis9.97±0.36a5.50±0.26a2.50±0.26aF16輪枝菌屬Verticilliumsp.9.30±0.31a5.55±0.08a2.37±0.12aF17青霉病病原菌Pen.italicum9.62±0.65a5.77±0.22a2.40±0.25aF18小孢擬盤多孢毛Pes.microspora9.52±0.17a5.77±0.13a2.20±0.15aF19腐皮鐮孢Fusariumsolani9.93±0.68a5.33±0.70a2.43±0.09aF20葡萄座腔菌Botryosphaeriarhodina9.25±0.40a5.70±0.35a2.13±0.15aCK無(wú)菌葡萄糖水(對(duì)照)9.43±0.17a5.37±0.23a2.07±0.09a

1)目標(biāo)樹(shù)基本特征數(shù)據(jù)來(lái)源于3株樣本樹(shù)，表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，同列數(shù)據(jù)后凡有一個(gè)相同小寫字母者，表示差異不顯著(Duncan’s 法，P>0.05)。

1.5數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同真菌對(duì)白木香樹(shù)體乙醇浸出物含量的影響

不同種類真菌菌液對(duì)白木香樹(shù)體結(jié)香質(zhì)量的影響不同，乙醇浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于10%的為經(jīng)龍眼焦腐病菌Lasiodiplodiatheobromae、斑點(diǎn)青霉Penicilliummeleagrinum、黑綠木霉Trichodermaatroviride、擬康木霉T.koningiopsis、青霉病病原菌Pen.italicum、腐皮鐮孢Fusariumsolani、葡萄座腔菌Botryosphaeriarhodina菌液處理的目標(biāo)樹(shù)，這7種樹(shù)體所得乙醇浸出物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為13.16%、11.38%、12.21%、11.04%、11.70%、14.03%和12.88%，符合《中國(guó)藥典》(2010版)沉香入藥的標(biāo)準(zhǔn)，分別為對(duì)照目標(biāo)樹(shù)(5.00%)的2.63、 2.27、 2.44、 2.21、 2.34、 2.81和2.58倍。其他13種處理(F1、F2、F4、F5、F6、F7、F9、F10、F11、F12、F13、F16、F18)的乙醇浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于10%，但高于5%,分別為8.88%、 6.25%、 9.04%、 6.70%、 7.85%、 6.51%、 5.76%、 9.62%、 9.41%、 9.65%、 7.89%、 8.47%和7.40 %。

2.2不同真菌對(duì)白木香樹(shù)體揮發(fā)油化學(xué)成分的影響

7種有效促進(jìn)白木香物質(zhì)形成的真菌處理，其所侵染木質(zhì)部揮發(fā)油成分如表2所示，乙醇浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于10%的7種有效真菌處理，其檢出物中共含有倍半萜化合物21種，芳香族化合物12種，色酮化合物1種，脂肪酸和烷烴類及其他化合物36種。這7種有效真菌處理，都含有的化學(xué)成分包括：苯甲醛、芐基丙酮以及十八碳烷酸、鄰苯二甲酸二異丁酯、棕櫚酸、正二十烷、8-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮、正二十四烷、二十六烷、二十七烷。其中小分子苯甲醛和芐基丙酮可能是其他倍半萜、芳香族和色酮物質(zhì)的前體物質(zhì)，有效真菌F3、F8、F14、F15、F17、F19和F20侵染樹(shù)體所得2-(2-苯乙基)色酮類物質(zhì)相對(duì)含量分別為0.82%、 1.22%、 1.89%、 2.35%、 5.75%、 2.46%和3.15%。

表2GC-MS 檢測(cè)的7種有效真菌侵染后白木香樹(shù)體揮發(fā)油的化學(xué)成分及相對(duì)含量1)

Tab.2Chemical compositions and relative contents of the essential oils from Aquilaria sinensis trees infected with seven effective fungi examined with GC-MS

峰號(hào)t保留/min化合物名稱分子式有效菌種處理已鑒定物質(zhì)的相對(duì)含量/%F3F8F14F15F17F19F2016.208苯甲醛C7H6O0.270.510.500.250.270.610.45211.0095-羥甲基糠醛C6H6O3…………0.94……311.320芐基丙酮C10H12O0.500.871.120.430.380.780.89412.3412-甲基萘C11H10……1.100.28………515.022二羥基順丁烯二酸C4H4O6…1.03……………615.1471,5-戊二醇C5H12O2…………………715.606茴香基丙酮C11H14O2………0.38………817.098正十三烷C13H28………0.46………917.098十六烷C16H34…0.170.12…………1017.098檀香醇C15H24O0.50…0.34…0.73……1117.899丁香醛C9H10O4……0.23…1.69……1218.017α-衣蘭油烯C15H24…0.520.20…………1318.038(-)-藍(lán)桉醇C15H27O……0.310.37………1418.049桉葉醇C15H26O0.88………1.44……1518.087β-愈創(chuàng)木烯C15H240.720.440.19…0.721.211.711618.204δ-杜松烯C15H24………0.21………1718.3854-羥基-3-甲氧基肉桂醇C10H12O3…0.28…1.472.231.181.231818.511正十七烷C17H360.83…0.22……3.461.331918.688沉香螺醇C15H26O0.810.770.38…0.961.451.652018.833對(duì)叔丁基苯甲醚C11H16O0.75…0.20…………2119.300十四酸C14H28O2…………………2219.359百里香酚C10H14O1.610.55……0.90……2319.746α-沉香呋喃C15H14O…1.61……0.770.961.582420.036十八碳烷酸C18H36O20.921.801.081.020.891.131.652520.363β-桉葉醇C15H26O……0.25…0.51……2620.481香橙烯氧化物-(1)C15H24O…0.69………1.231.022720.680鄰苯二甲酸二異丁酯C16H22O40.612.383.553.211.731.704.242820.680棕櫚酸C16H32O22.172.442.662.842.072.493.882921.110正二十烷C20H420.522.041.762.573.750.581.273021.174香橙烯氧化物-(2)C15H24O………2.61………3121.185環(huán)氧柏木烷C15H24O……2.54…………3221.469異香樹(shù)烯環(huán)氧化C15H24O1.880.140.641.17…1.352.203321.6363-甲基環(huán)十五酮C16H30O…………………3421.647白木香醛C15H26O21.330.78…1.552.541.561.493522.028β-桉葉烯C15H242.671.160.18…………3622.082鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯C16H22O4…4.781.882.112.432.781.333822.275姜酮C11H14O3………0.81………3922.280占噸醇C13H10O2…………2.29……4022.313十六烷酸乙酯C18H36O2…………………4122.319反式-9-十八碳烯酸C18H34O2…………………4222.474月桂烯C10H16……0.51…0.95……4322.8238-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮C18H16O30.821.221.892.355.752.463.154422.823α-石竹烯C15H24……0.701.68…1.38…4522.903別香橙烯環(huán)氧化物C15H24O……0.58…………

續(xù)表2

Tab.2continued

峰號(hào)t保留/min化合物名稱分子式有效菌種處理已鑒定物質(zhì)的相對(duì)含量/%F3F8F14F15F17F19F204622.973氧化石竹烯C15H24O…………………4722.989(+)-香橙烯C15H242.331.443.56……1.78…4823.333β-朱欒C15H221.131.980.981.980.841.222.014923.591二十一烷C21H44…3.133.830.482.54…2.395023.988順式-十八碳烯酸C18H34O2…2.41…2.192.322.444.385124.343油酸乙酯C20H38O2…………………5224.633硬脂酸乙酯C20H40O2…0.210.09…………5324.718二十二烷C22H462.192.132.28…0.67……5424.7312,4-雙-(1-苯基乙基)苯酚C22H22O…0.900.160.27………5524.7991-十八烷烯C18H36…0.38……………5625.798正二十三烷C23H484.533.023.18…1.774.793.775726.3292-萘酚芐基醚C17H14O7.142.20…2.131.654.673.125826.845正二十四烷C24H506.361.035.331.582.416.343.255926.9314',5-二羥基-7-甲氧基黃酮C16H12O5……0.85…………6027.838二十五烷C25H525.900.84………5.01…6128.139豆固醇C29H48O…………………6228.370谷固醇C29H50O…………………6328.800二十六烷C26H544.173.523.571.271.593.362.636429.4762-甲基十八烷C19H40…0.900.63…………6529.729二十七烷C27H562.283.353.711.111.062.233.636630.131對(duì)苯二甲酸二辛酯C24H38O4…0.372.36…………6730.352二十八烷C28H58…0.570.41………2.336830.899角鯊烯C30H50…0.620.40…………6931.941二十九烷C29H600.70…1.39………0.957033.369正三十烷C30H62…0.760.55…0.27……

1)…表示未檢測(cè)到。

由表3可知，乙醇浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥10%的7種不同真菌處理白木香樹(shù)體揮發(fā)性成分中，F(xiàn)3、 F8、 F14、 F15、 F17、 F19和F20菌種處理分別分離得54、 69、 84、 94、 61、 49和45個(gè)峰，已鑒定物質(zhì)峰個(gè)數(shù)分別占總氣化物峰個(gè)數(shù)的50.00%、 55.00%、 52.00%、 31.00%、 50.82%和53.06%，說(shuō)明白木香揮發(fā)油氣化產(chǎn)物成分復(fù)雜。除F8處理樹(shù)體的芳香族類化合物相對(duì)含量大于倍半萜外，其他處理樹(shù)體化學(xué)成分相對(duì)含量從高到低依次為：脂肪酸+烷烴類、 倍半萜類、 芳香族類和2-(2-苯乙基)色酮類。F3、 F8、 F14、 F15、 F17、 F19和F20菌種處理所得倍半萜類化合物是對(duì)照的16.32、 12.71、 15.19、 15.01、 12.77、 16.19和15.55倍；芳香族類為對(duì)照處理的4.46、 5.81、 5.62、 4.83、 4.27、 5.52和5.25倍，說(shuō)明上述7種真菌處理能有效促進(jìn)白木香活性成分的積累。

由表3可知，F(xiàn)1、F2、F4、F9、F10、F11、F12、F13、F16和F18處理樹(shù)體倍半萜類化合物僅為對(duì)照的1.76、 2.17、 8.50、 1.44、 2.08、 3.77、 3.07、 4.76、 0.57和 0.65倍；芳香族類化合物則為對(duì)照的0.79～2.07倍；F1、F2、F4、F5、F6、F7、F9、F10、F11、F12、F13、F16和F18處理樹(shù)體所得揮發(fā)油成分中，均未檢測(cè)到2-(2-苯乙基)色酮類物質(zhì)。對(duì)照揮發(fā)油成分中鑒定物質(zhì)占總氣化物相對(duì)含量的63.06%，含極少量倍半萜、芳香族類物質(zhì)，不含色酮類物質(zhì)，脂肪酸和烷烴類相對(duì)含量最高，倍半萜和芳香族類物質(zhì)的相對(duì)含量之和僅為脂肪酸和烷烴類物質(zhì)相對(duì)含量的0.04倍；而結(jié)香效果較佳的7種真菌處理樹(shù)體倍半萜類、芳香族類和2-(2-苯乙基)色酮類成分相對(duì)含量之和依次為：21.57%、21.85%、24.02%、22.83%、23.49%、25.15%和24.84%，僅略低于其脂肪酸和烷烴類物質(zhì)相對(duì)含量；結(jié)香欠佳的13種真菌處理樹(shù)體揮發(fā)油成分中，已鑒定物質(zhì)峰個(gè)數(shù)占?xì)饣锓鍌€(gè)數(shù)的25.00%～45.61%，倍半萜和芳香族類物質(zhì)的相對(duì)含量之和為2.67%～7.88%，僅為脂肪酸和烷烴類物質(zhì)相對(duì)含量的0.05～0.18倍，與對(duì)照相近。

表320種真菌侵染后白木香樹(shù)體揮發(fā)油的化學(xué)成分類別及相對(duì)含量

Tab.3Relative contents of different types of chemicals in the essential oils from Aquilaria sinensis trees infected with 20 fungal species

處理1)化合物相對(duì)含量2)/%倍半萜芳香族色酮脂肪酸+烷烴類合計(jì)/%鑒定數(shù)/出峰數(shù)F11.322.00…33.8837.2014/55F21.633.49…30.5535.6726/57F3?12.248.510.8230.0651.6427/54F46.381.50…48.8456.7217/49F5…2.70…18.0121.1219/52F6…2.67…55.1058.7018/53F7…3.51…45.4348.9419/46F8?9.5311.101.2225.7547.1138/69F91.083.63…52.1456.8518/56F101.562.23…47.2651.0522/61F112.832.29…41.3146.4321/64F122.33.20…39.7445.2431/83F133.573.96…41.2248.7520/62F14?11.3910.741.8928.4251.9444/84F15?11.269.222.3510.9533.7829/94F160.433.20…62.4166.0431/84F17?9.588.165.7515.3238.8031/61F180.493.34…28.8132.6420/63F1912.1410.552.4631.2456.3926/49F20?11.6610.033.1530.2055.0427/45CK0.751.91…60.4063.0616/24

1) ?表示乙醇浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)10%的處理； 2)…表示未檢測(cè)到。

3討論與結(jié)論

本試驗(yàn)采用的是輸液法的通體結(jié)香技術(shù)，此技術(shù)系統(tǒng)原理在于：將沉香誘導(dǎo)劑滴注入沉香樹(shù)干，使誘導(dǎo)劑混入樹(shù)干液流，在蒸騰作用下擴(kuò)散到整個(gè)樹(shù)體，使樹(shù)體受到脅迫產(chǎn)生沉香物質(zhì)[15]。要求所選目標(biāo)樹(shù)干形和冠幅須保持一致，才能保證所注入樹(shù)干的菌液散布均勻，從而保證沉香數(shù)量和質(zhì)量的一致。本試驗(yàn)中，所選目標(biāo)樹(shù)經(jīng)方差分析得胸徑、樹(shù)高和冠幅均差異不顯著，有利于檢驗(yàn)各菌種的有效性。

根據(jù)《中國(guó)藥典》(2010版)沉香入藥標(biāo)準(zhǔn)，乙醇熱浸法所得浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于10%。經(jīng)龍眼焦腐病菌、斑點(diǎn)青霉、黑綠木霉、擬康氏木霉、青霉病病原菌、腐皮鐮孢、葡萄座腔菌菌液處理的目標(biāo)樹(shù)，其浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)在11%～15%，符合入藥標(biāo)準(zhǔn)。其他真菌處理和對(duì)照處理的乙醇浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于10%。

經(jīng)GC-MS分析，結(jié)香效果欠佳的13種真菌以及對(duì)照處理樹(shù)體揮發(fā)油主要組成物為脂肪酸和烷烴類物質(zhì)，不含色酮類物質(zhì)，有效活性成分倍半萜類和芳香族類物質(zhì)的相對(duì)含量之和僅為2.67%～7.88%。而上述7種真菌菌液處理樹(shù)體提取的揮發(fā)油化學(xué)成分中倍半萜、2-(2-苯乙基)色酮和芳香族類物質(zhì)相對(duì)含量之和分別為21.57%、 21.85%、 24.02%、 22.83%、 23.49%、 25.15% 和24.84%。多年來(lái)國(guó)內(nèi)外沉香化學(xué)成分分析的研究表明，沉香所含活性物質(zhì)高達(dá)150多種，但主要為倍半萜類、2-(2-苯乙基)色酮類和芳香族類物質(zhì)[13-14,16]。對(duì)照目標(biāo)樹(shù)提取物成分包括相對(duì)含量0.75%的倍半萜和1.90%的芳香族類物質(zhì)，是因?yàn)榈巫⑵咸烟撬般@孔傷害足以促使沉香樹(shù)體產(chǎn)生少量的沉香物質(zhì)，而且在沉香樹(shù)木粉干燥過(guò)程中，由于存在一部分活的細(xì)胞，倍半萜和芳香族代謝途徑可能被促發(fā)[14]，而其他真菌不能有效促使白木香樹(shù)體受脅迫而產(chǎn)生特定的次生代謝反應(yīng)。研究表明：龍眼焦腐病菌注入4年生白木香樹(shù)干，其GC-MS分析所得化學(xué)成分與天然沉香成份最為相近[12]，且通過(guò)組培試驗(yàn)證實(shí)，這種真菌能夠通過(guò)產(chǎn)生茉莉酸甲酯，而顯著提高愈創(chuàng)木烯等倍半萜類物質(zhì)的含量[17]，與本試驗(yàn)中F3菌種試驗(yàn)結(jié)果一致；齊楠沉香A.agallocha經(jīng)青霉菌菌液處理后，樹(shù)干提取物含有沉香呋喃等倍半萜化合物[18]，與本試驗(yàn)中斑點(diǎn)青霉和小孢擬盤多孢毛菌種效果相同；而運(yùn)用木霉菌提取物來(lái)刺激馬來(lái)沉香A.malaccensis懸浮體系，所得沉香物質(zhì)最多，其提取物化學(xué)成分包括：β-桉葉醇、β-愈創(chuàng)木烯和別香橙烯環(huán)氧化物[19]，與本試驗(yàn)黑綠木霉和擬康木霉菌種試驗(yàn)結(jié)果一致；高曉霞等[20]研究表明，鐮刀菌誘導(dǎo)白木香葉，促使沉香物質(zhì)產(chǎn)生，這一過(guò)程可能與鐮刀菌改變了白木香葉真菌種類有關(guān)。Mohamed等[21]認(rèn)為，馬來(lái)沉香受物理傷害后產(chǎn)生沉香物質(zhì)，是由于傷口處感染鐮刀菌的結(jié)果，這與F20菌種試驗(yàn)結(jié)果相近；將葡萄座腔菌接種于離體的白木香樹(shù)枝，可以產(chǎn)生倍半萜9-二甲基-2-(1-甲基亞乙基)-環(huán)癸醇，而本試驗(yàn)中未檢測(cè)到這種倍半萜，可能是活體樹(shù)干內(nèi)封閉與離體樹(shù)干環(huán)境開(kāi)放的差異所致。本試驗(yàn)中，所有結(jié)香效果顯著的白木香樹(shù)體提取物中，均含有芐基丙酮，這也可能是其含有2-(2-苯乙基)色酮類物質(zhì)的原因[22]。

綜上所述，20種待測(cè)菌種中，只有7種真菌能有效促進(jìn)白木香樹(shù)體沉香物質(zhì)的形成，而其他13種效用不明顯。本研究中不同菌種的表現(xiàn)，對(duì)進(jìn)一步促進(jìn)白木香結(jié)香菌種的篩選，有很重要的借鑒作用。本試驗(yàn)中，使用真菌種類復(fù)雜，還需對(duì)其代謝液化學(xué)成分進(jìn)行分析，才能進(jìn)一步揭示真菌對(duì)白木香樹(shù)體結(jié)香的促發(fā)機(jī)理。

致謝：衷心感謝陸俊坤博士提供試驗(yàn)菌種及惠州市鴻茂林業(yè)發(fā)展有限公司鐘錦祥董事長(zhǎng)供給試驗(yàn)所需白木香目標(biāo)樹(shù)和試驗(yàn)過(guò)程中給予的諸多幫助！

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【責(zé)任編輯莊延，柴焰】

收稿日期：2015- 12- 23優(yōu)先出版時(shí)間：2016- 07- 05

作者簡(jiǎn)介：王東光(1985—)，男，博士研究生，E-mail:wangdgking@163.com； 通信作者：徐大平(1964—)，男，研究員，博士，E-mail: gzfsrd@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家林業(yè)局林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201304402-4); 廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目 (2014KJCX004-01)

中圖分類號(hào)：S718

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001- 411X(2016)05- 0077- 07

Effects of 20 fungal species on compositions of essential oils from Aquilaria sinensis trees

WANG Dongguang, ZHANG Ningnan, YANG Zengjiang, LIU Xiaojin, HONG Zhou， XU Daping

(Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520， China)

Abstract：【Objective】 To determine the effect of 20 different fungi on compositions of essential oils from agarwood of Aquilaria sinensis.【Method】The whole-tree agarwood-inducing technique was used, and culture fluids of 20 fungal species were injected into A. sinensis trees separately. The chemical compositions of extracts from the 20 treatments were investigated using GC-MS method.【Result】The ethanol extract contents were above 10% from A. sinensis trees infected by seven fungal species including Lasiodiplodia theobromae,Penicillium meleagrinum, Trichoderma atroviride, T. koningiopsis, Pen. italicum, Fusarium solani and Botryosphaeria rhodina. The total relative contents of sesquiterpenes, aromatics compounds and 2-(2-phenylethyl) chromone derivatives were 21.57%, 21.85%, 24.02%, 22.83%, 23.49%, 25.15% and 24.84% respectively. For the rest 13 treatments, the ethanol extract contents were below 10%, the main detected ingredients were fatty acids and alkanes，the total relative contents of sesquiterpenes and aromatics compounds were only 2.67% to 7.88%, and no 2-(2-phenylethyl) chromone derivative was detected.【Conclusion】Among the 20 fungal species, seven species can efficiently induce agarwood formation in A. sinensis, and the effects of the rest 13 species are not obvious.

Key words：Aquilaria sinensis; GC-MS; fungus; essential oil; agarwood

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20160705.1159.018.html

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