轉(zhuǎn)cry1Ab13基因玉米新種質(zhì)的創(chuàng)制

陳沼汀， 董昭旭， 劉　雙， 孫國(guó)旭， 李　暉， 魏曉禹， 孫　蘇， 關(guān)淑艷

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 吉林 長(zhǎng)春 130118)

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轉(zhuǎn)cry1Ab13基因玉米新種質(zhì)的創(chuàng)制

陳沼汀， 董昭旭， 劉雙， 孫國(guó)旭， 李暉， 魏曉禹， 孫蘇， 關(guān)淑艷

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 吉林 長(zhǎng)春 130118)

摘要：【目的】構(gòu)建包含抗鱗翅目害蟲(chóng)基因cry1Ab13的重組植物表達(dá)載體，并利用其創(chuàng)制對(duì)玉米螟Ostrinia furnacalis具有優(yōu)良抗性的轉(zhuǎn)基因玉米Zea may L.新種質(zhì)。【方法】利用同源重組法將cry1Ab13基因連接到表達(dá)載體pCAMBIA3300-Bar上，獲得以抗除草劑Bar基因?yàn)楹Y選標(biāo)記的植物表達(dá)載體pCAMBIA3300-cry1Ab13-Bar。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米自交系H99幼胚，對(duì)再生植株進(jìn)行逐代除草劑篩選、PCR檢測(cè)及T2代植株的Southern blotting檢測(cè)、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)，并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行田間及室內(nèi)抗蟲(chóng)性鑒定。【結(jié)果】構(gòu)建了cry1Ab13基因的植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化玉米獲得3株高抗玉米螟和1株抗玉米螟的T2代轉(zhuǎn)基因植株。Southern blotting證明cry1Ab13基因已經(jīng)整合到玉米基因組中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明cry1Ab13基因已經(jīng)在玉米植株內(nèi)表達(dá)?？瓜x(chóng)性鑒定結(jié)果表明，與對(duì)照相比轉(zhuǎn)基因植株對(duì)玉米螟的抗性顯著提高?！窘Y(jié)論】將cry1Ab13基因?qū)胗衩撞⒊晒Ρ磉_(dá)，顯著提高了轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)玉米螟的抗性，為抗蟲(chóng)玉米新種質(zhì)的創(chuàng)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：抗蟲(chóng)性； cry1Ab13基因； 轉(zhuǎn)基因玉米； 玉米螟

玉米ZeamayL.是我國(guó)重要的糧食作物，在糧食、飼料、工業(yè)、能源等方面都有著重要的應(yīng)用[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，到2020年我國(guó)將實(shí)現(xiàn)糧食增產(chǎn)500億kg,其中玉米增產(chǎn)占53%[2]。提高玉米產(chǎn)量對(duì)于我國(guó)糧食安全及經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要戰(zhàn)略意義。

亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis是鱗翅目螟蛾科昆蟲(chóng)，是影響我國(guó)玉米生產(chǎn)的主要害蟲(chóng)。玉米螟咬食玉米莖、葉、穗等，對(duì)玉米的產(chǎn)量及品質(zhì)產(chǎn)生直接影響，其危害貫穿玉米生產(chǎn)的各個(gè)階段，造成玉米減產(chǎn)20%～30%[3]。轉(zhuǎn)Bt基因的玉米，通過(guò)表達(dá)cry1Ab、cry1Ac、cry1Ie等殺蟲(chóng)晶體蛋白，從而產(chǎn)生對(duì)玉米螟等害蟲(chóng)的抗性[4-5]。1990年科學(xué)家首次利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得轉(zhuǎn)Bt基因的玉米植株[6-7]，近年來(lái)我國(guó)在抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米的研究方面也取得了諸多成果[8-9]。cry1Ab是抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米研發(fā)過(guò)程中的重要基因，是應(yīng)用得最多且應(yīng)用最成熟的抗蟲(chóng)基因。據(jù)ISAAA 2016年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，世界各國(guó)已批準(zhǔn)允許作為食物及飼料的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米有115個(gè)，其中有52個(gè)是含有cry1Ab基因的轉(zhuǎn)基因玉米；BT11、BT176、MON810等轉(zhuǎn)cry1Ab基因玉米自交系作為第1批抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米材料在抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米育種上具有廣泛的應(yīng)用并取得了顯著的效果；近年來(lái)，有關(guān)轉(zhuǎn)基因玉米食用安全性評(píng)價(jià)的研究報(bào)道不斷出現(xiàn)，眾多研究一致表明，其食用安全性及營(yíng)養(yǎng)特性與非轉(zhuǎn)基因玉米相比無(wú)顯著差異[10-12]。因此，利用cry1Ab基因進(jìn)行抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米的研發(fā)在經(jīng)驗(yàn)及理論上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，為加快我國(guó)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米的研發(fā)進(jìn)程，有必要深入研究克隆得到的不同種cry1Ab基因。cry1Ab13基因是由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis(Bt)BtC005中克隆得到的抗蟲(chóng)基因，其編碼的殺蟲(chóng)晶體蛋白對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)具有高效殺蟲(chóng)活性[13]。本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)將cry1Ab13基因連接到含有Bar基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA3300上，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其導(dǎo)入玉米自交系H99中，通過(guò)除草劑篩選、PCR檢測(cè)及抗蟲(chóng)性鑒定，以獲得抗玉米螟的轉(zhuǎn)基因玉米植株，為抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米品種的種質(zhì)創(chuàng)制提供材料。

1材料與方法

1.1供試材料與試劑

含pUC57-cry1Ab13質(zhì)粒菌株及植物表達(dá)載體pCAMBIA3300-Bar由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供?；蚴荏w玉米自交系H99幼胚、大腸埃希菌Escherichiacoli菌株DH5α、農(nóng)桿菌Agrobacterium菌株EHA105均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生物技術(shù)中心提供。亞洲玉米螟幼蟲(chóng)由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)綜合技術(shù)現(xiàn)代化研究所提供。構(gòu)建表達(dá)載體所用ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit試劑盒購(gòu)自Vazyme公司。玉米基因組提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)公司。試驗(yàn)所用培養(yǎng)基：LB、YEP、誘導(dǎo)、侵染、共培養(yǎng)、篩選、分化和生根培養(yǎng)基均參照關(guān)淑艷等[14]方法。

1.2重組植物表達(dá)載體的構(gòu)建

提取pUC57-cry1Ab13質(zhì)粒及pCAMBIA3300-Bar質(zhì)粒，以CaMV35S啟動(dòng)子下游BamH I識(shí)別位點(diǎn)作為cry1Ab13基因插入位點(diǎn)，根據(jù)ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit所提供的Clon Express快速克隆技術(shù)要求對(duì)載體及目的片段進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)特異性引物 (表1)。以pUC57-cry1Ab13質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增cry1Ab13基因，回收目的基因片段(1 971 bp)和BamH I酶切pCAMBIA3300-Bar質(zhì)粒所得的線性化載體，根據(jù)ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，同源重組反應(yīng)得到重組植物表達(dá)載體pCAMBIA3300-CaMV35S-cry1Ab13-Nos-CaMV35S-Bar-Nos(圖1)。

1.3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米幼胚的遺傳轉(zhuǎn)化

玉米自交系H99自交授粉11 d后挑取幼胚用作工程菌侵染宿主,玉米幼胚挑取見(jiàn)郭新梅等[15]的方法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米幼胚的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化后玉米組織培養(yǎng)再生植株，參見(jiàn)劉強(qiáng)等[16]的方法。

表1引物信息1)

Tab. 1Primer information

目的片段名稱上游引物(5'-3')下游引物(5'-3')擴(kuò)增序列/bpcry1Ab13*AGAACACGGGGGACTCTAGATCTA-GACCC-GGGCCTATGATCGGGGAAATTCGAGCTCTTAT-CAAAGTTCATCCTT1971cry1Ab13**TTTGGAGAGAGTGTGGGGTGATCCCTCGATACCCTGAGC155CaMV35STAGAGGACCTAACAGAACCCGTGTTCTCTCCAAATG500BarTCAAATCTCGGTGACGGGCATGAGCCCAGAACGACGC552ActinATCTTGACTGAGCGTGGTTATTCCGCTGGTCCTGGCTGTCTCC75

1)*、**分別表示該引物用于cry1Ab13基因的PCR擴(kuò)增和熒光定量PCR檢測(cè)；劃線處為BamH I酶切位點(diǎn)及同源臂。

圖1　重組植物表達(dá)載體T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)圖

1.4轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)

1.4.1轉(zhuǎn)基因玉米植株的PCR檢測(cè)對(duì)6葉期玉米葉片涂抹3倍正常工作濃度草胺膦溶液逐代進(jìn)行抗除草劑轉(zhuǎn)基因植株篩選，提取對(duì)草胺膦表現(xiàn)抗性的植株基因組DNA，方法見(jiàn)康為世紀(jì)公司植物基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)。以玉米轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA為模板，分別以非轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA和重組植物表達(dá)載體質(zhì)粒為對(duì)照(CK)和陽(yáng)性對(duì)照，利用表1所示特異性引物對(duì)cry1Ab13基因、CaMV35S啟動(dòng)子、Bar基因分別進(jìn)行擴(kuò)增。PCR程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性57 s，退火溫度分別為56 ℃、 50 ℃、 55 ℃，反應(yīng)57 s，72 ℃延伸70 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸10 min；經(jīng)PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行套袋自交，以同樣的方法進(jìn)行逐代篩選。

1.4.2轉(zhuǎn)基因玉米植株的Southern blotting檢測(cè)利用CTAB法大量提取T2代PCR檢測(cè)為陽(yáng)性和非轉(zhuǎn)基因植株5～6葉期心葉基因組，利用HindⅢ對(duì)基因組DNA進(jìn)行充分單酶切過(guò)夜，擴(kuò)增cry1Ab13基因并純化目的片段用于制備雜交探針，利用隨機(jī)引物法根據(jù)Roche公司的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I說(shuō)明書(shū)進(jìn)行探針標(biāo)記，用10 g·L-1的瓊脂糖凝膠對(duì)基因組酶切片段進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)膜、固定、雜交等具體操作步驟及所用試劑配制參照文獻(xiàn)[17]。

1.4.3轉(zhuǎn)基因玉米植株的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)以非轉(zhuǎn)基因植株為對(duì)照，分別提取非轉(zhuǎn)基因植株和Southern雜交檢測(cè)為陽(yáng)性的T2轉(zhuǎn)基因植株6葉期心葉總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為PCR擴(kuò)增模板，以引物(表1)擴(kuò)增cry1Ab13，以肌動(dòng)蛋白Actin基因(GenBank登錄號(hào)：NM_001252731.2)作為內(nèi)參基因同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性20 s，56 ℃反應(yīng)30 s，共40次循環(huán)。利用SYBR Green染料標(biāo)記的實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)來(lái)自不同轉(zhuǎn)化事件的轉(zhuǎn)基因植株cry1Ab13基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析(SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司)。每個(gè)樣本設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，并進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。

1.5轉(zhuǎn)基因玉米植株的抗蟲(chóng)性鑒定

1.5.1轉(zhuǎn)基因植株的田間抗蟲(chóng)性鑒定將T2代轉(zhuǎn)基因種子與H99自交系種子(對(duì)照)播種于大田，并對(duì)轉(zhuǎn)基因群體材料進(jìn)行篩選，選取篩選到的陽(yáng)性植株進(jìn)行接蟲(chóng)試驗(yàn)。于植株6～8葉期時(shí)，將初孵玉米螟幼蟲(chóng)于清晨濕度較高時(shí)接于玉米心葉中，每株植株接蟲(chóng)30頭，14 d后調(diào)查食葉級(jí)別，抗蟲(chóng)性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[18]，1～3 級(jí)：蟲(chóng)孔針刺狀；4～6 級(jí)：蟲(chóng)孔火柴頭大??；7～9 級(jí)：蟲(chóng)孔大于火柴頭?？剐约?jí)別分類: 1.00～2.09 級(jí)(高抗)，2.10～ 4.09級(jí)(抗蟲(chóng))，4.10～6.09級(jí)(中抗)，6.10～8.09級(jí)(感蟲(chóng))，8.10～9.00級(jí)(高感)。

1.5.2轉(zhuǎn)基因植株的苗期室內(nèi)抗蟲(chóng)性鑒定將經(jīng)Southern檢測(cè)陽(yáng)性的植株收獲的轉(zhuǎn)基因種子與非轉(zhuǎn)基因植株種子(對(duì)照)按株系分別種于塑料盆內(nèi)，每盆15粒，經(jīng)除草劑篩選及PCR檢測(cè)后去除陰性及多余植株，每盆保留5株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。待植株長(zhǎng)至5～6葉期時(shí)進(jìn)行接蟲(chóng)，每株植株接25頭初孵玉米螟幼蟲(chóng)于心葉中，置于人工氣候室培養(yǎng)，接蟲(chóng)14 d后調(diào)查玉米蟲(chóng)害級(jí)別，逐株調(diào)查，以5株的均值作為該株系的抗蟲(chóng)級(jí)別，抗蟲(chóng)性鑒定標(biāo)準(zhǔn)同“1.5.1”。

1.5.3轉(zhuǎn)基因植株籽粒及苞葉抗蟲(chóng)性鑒定取Southern blotting檢測(cè)陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因玉米授粉后13 d的籽粒和最內(nèi)層苞葉分別飼喂玉米螟幼蟲(chóng)，以非轉(zhuǎn)基因玉米材料作為對(duì)照。將等量的籽粒和苞葉分別置于培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)接10頭初孵玉米螟幼蟲(chóng)，置于人工氣候室培養(yǎng)。每株設(shè)3次重復(fù)，每天檢查玉米螟取食和存活情況，及時(shí)更換同1株的籽粒及苞葉，分別在第4、 8、 12 天統(tǒng)計(jì)玉米螟死亡率。

2結(jié)果與分析

2.1重組植物表達(dá)載體的鑒定

提取重組表達(dá)載體質(zhì)粒，利用cry1Ab13基因特異性引物進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，得到特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，大小與目的基因cry1Ab13(1 971bp)大小一致(圖2)。重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ單酶切，可得到2個(gè)大小不等片段，大片段長(zhǎng)度與線性化pCAMBIA3300-Bar長(zhǎng)度一致，小片段與cry1Ab13基因大小一致。進(jìn)一步對(duì)重組質(zhì)粒中的插入片段進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與目的基因cry1Ab13相似性達(dá)100%。綜上可以證明cry1Ab13基因已經(jīng)成功連接到pCAMBIA3300-Bar插入位點(diǎn)處，表達(dá)載體pCAMBIA3300-cry1Ab13-Bar構(gòu)建成功。

2.2農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化植株的獲得

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pCAMBIA3300-cry1Ab13-Bar導(dǎo)入玉米幼胚，經(jīng)過(guò)篩選培養(yǎng)、分化和生根共獲得50株再生苗，將50株三葉期再生幼苗室內(nèi)移栽到土壤，共有30株幼苗成活。

M：DNA marker DL 2000；P：陽(yáng)性對(duì)照；N：陰性對(duì)照；1～6：重組質(zhì)粒。

2.3轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定

2.3.1轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)結(jié)果提取抗除草劑轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA，分別對(duì)cry1Ab13基因、CaMV35S啟動(dòng)子及Bar基因進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10 g·L-1的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，篩選具有以上3種基因條帶的T1代和T2代轉(zhuǎn)基因植株如圖3、4所示，篩選到的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株按株系逐代編號(hào)，結(jié)果見(jiàn)表2。

M：DNA marker DL 2000；P：陽(yáng)性對(duì)照；N：陰性對(duì)照；CK：非轉(zhuǎn)基因植株；1～5：轉(zhuǎn)基因植株;A、B、C分別為對(duì)cry1Ab13基因、CaMV35S啟動(dòng)子及Bar基因的擴(kuò)增結(jié)果。

圖3部分T1代轉(zhuǎn)基因玉米PCR檢測(cè)結(jié)果

Fig.3PCR detection of some T1generation transgenic maize

M：DNA marker DL 2000；P：陽(yáng)性對(duì)照；N：陰性對(duì)照；CK：非轉(zhuǎn)基因植株；1～5：轉(zhuǎn)基因植株;A、B、C分別為對(duì)cry1Ab13基因、CaMV35S啟動(dòng)子及Bar基因的擴(kuò)增結(jié)果。

圖4部分T2代轉(zhuǎn)基因玉米PCR檢測(cè)結(jié)果

Fig.4PCR detection of some T2generation transgenic maize

2.3.2轉(zhuǎn)基因植株的Southern blotting選取T2代植株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的植株進(jìn)行Southern blotting檢測(cè)，以cry1Ab13基因擴(kuò)增片段作為陽(yáng)性對(duì)照，非轉(zhuǎn)基因植株DNA作為陰性對(duì)照，20株P(guān)CR陽(yáng)性植株中有5株經(jīng)Southern雜交出現(xiàn)明顯雜交信號(hào)(圖5)，其中T2-2-3-1為3拷貝，其余均為單拷貝，非轉(zhuǎn)基因植株無(wú)明顯雜交信號(hào)出現(xiàn)，并且不同植株的雜交條帶位置存在差異。證明外源基因cry1Ab13已整合到了玉米基因組中，并且隨機(jī)整合到了玉米基因組的不同位置。

表2PCR檢測(cè)陽(yáng)性玉米植株

Tab.2PCR-positive maize plants

世代來(lái)源植株數(shù)編號(hào)T08T0-1～T0-8T1T0-11T1-1-1T0-24T1-2-1～T1-2-4T0-31T1-3-1T0-42T1-4-1～T1-4-2T0-51T1-5-1T0-81T1-8-1T2T1-1-12T2-1-1-1～T2-1-1-2T1-2-11T2-2-1-1T1-2-35T2-2-3-1～T2-2-3-5T1-2-43T2-2-4-1～T2-2-4-3T1-3-12T2-3-1-1～T2-3-1-2T1-4-14T2-4-1-1～T2-4-1-4T1-5-13T2-5-1-1～T2-5-1-3

M：λHind Ⅲ DNA marker；P：陽(yáng)性對(duì)照；CK：非轉(zhuǎn)基因植株；1～5分別為轉(zhuǎn)基因植株T2-1-1-2、T2-2-3-1、T2-3-1-2、T2-4-2-1和T2-5-1-3。

圖5T2代轉(zhuǎn)基因玉米cry1Ab13基因的Southern雜交檢測(cè)

Fig.5Southern blotting detection of cry1Ab13 gene in T2transgenic maize

2.3.3轉(zhuǎn)基因植株的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,溶解曲線均有單峰出現(xiàn)，表明反應(yīng)特異性較好，無(wú)引物二聚體及非特異性產(chǎn)物的干擾；擴(kuò)增曲線光滑平穩(wěn)，熒光吸收?qǐng)D譜S型曲線性狀完好，符合定量檢測(cè)要求。各株內(nèi)參基因Ct值在19～20之間，目的基因Ct值在25～34之間，不同植株cry1Ab13基因的Ct值具有明顯的差異，且植株T2-2-3-1內(nèi)參基因Ct=19.34，cry1Ab13基因在設(shè)定的40個(gè)循環(huán)內(nèi)未檢測(cè)到Ct值，說(shuō)明外源基因在不同轉(zhuǎn)基因事件中表達(dá)量具有明顯差異，轉(zhuǎn)基因植株T2-2-3-1中cry1Ab13基因未表達(dá)。各植株中cry1Ab13基因相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖6。

圖6轉(zhuǎn)基因玉米中cry1Ab13基因相對(duì)表達(dá)量

Fig.6Relative expression of cry1Ab13 gene in transgenic maize

2.4轉(zhuǎn)基因玉米植株抗蟲(chóng)性鑒定

2.4.1田間抗蟲(chóng)性試驗(yàn)T2代轉(zhuǎn)基因植株的田間接蟲(chóng)試驗(yàn)表明，PCR陽(yáng)性T2代轉(zhuǎn)基因植株對(duì)亞洲玉米螟具有較強(qiáng)的抗性(圖7A)，接蟲(chóng)14 d后植株生長(zhǎng)良好，心葉大多表現(xiàn)為未受蟲(chóng)害或僅有少量針狀蟲(chóng)孔，而非轉(zhuǎn)基因的對(duì)照組則受蟲(chóng)害嚴(yán)重(圖7B)，心葉及外部葉片均有大量較大蟲(chóng)孔，對(duì)玉米螟表現(xiàn)為高度敏感性，但也有個(gè)別PCR陽(yáng)性植株抗蟲(chóng)性較差,與對(duì)照組無(wú)顯著差異。

A:轉(zhuǎn)基因植株； B：非轉(zhuǎn)基因植株。

Fig.7Evaluation of resistance of transgenic maize plants to Ostrinia furnacalis in the field

2.4.2室內(nèi)接蟲(chóng)試驗(yàn)為更準(zhǔn)確地鑒定轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲(chóng)性，將Southern雜交陽(yáng)性植株自交后代于室內(nèi)按株系(編號(hào)L1～L5)種植，接蟲(chóng)試驗(yàn)結(jié)果表明，各Southern blotting陽(yáng)性植株后代株系對(duì)玉米螟抗性表現(xiàn)不同，L1、L5植株的心葉有少量針刺狀(直徑≤1 mm)蟲(chóng)孔；L4的蟲(chóng)孔為針刺狀，數(shù)量稍多于L1與L5；L3的心葉上有大量的針刺狀蟲(chóng)孔；L2的心葉上有少量直徑大于2 mm的蟲(chóng)孔；對(duì)照株系心葉上的蟲(chóng)孔稍多于L2，蟲(chóng)孔的直徑也大于2 mm。逐株統(tǒng)計(jì)各株系的抗蟲(chóng)級(jí)別，對(duì)相同接蟲(chóng)處理?xiàng)l件下的轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照株系抗蟲(chóng)性差異顯著性進(jìn)行t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果(表3)與試驗(yàn)觀測(cè)結(jié)果相符，L1、L4、L5達(dá)到高抗水平，L3達(dá)到3級(jí)抗性水平，轉(zhuǎn)化事件T2-2-3-1后代株系L2對(duì)玉米螟抗性較差，與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3室內(nèi)轉(zhuǎn)基因玉米株系苗期對(duì)玉米螟的抗性級(jí)別

Tab.3The resistant levels of transgenic maize lines to Ostrinia furnacalis at seeding stage indoor

轉(zhuǎn)化事件株系號(hào)食葉級(jí)別1)抗性級(jí)別T2-1-1-2L11.40±0.21**高抗T2-2-3-1L27.02±2.17易感T2-3-1-2L33.62±0.42**抗T2-4-2-1L42.22±0.19**高抗T2-5-1-3L51.46±0.36**高抗未轉(zhuǎn)化CK7.62±0.42易感

2.4.3灌漿期苞葉及籽粒抗蟲(chóng)性鑒定分別在飼喂轉(zhuǎn)基因玉米籽粒及苞葉4、 8、 12 d后統(tǒng)計(jì)3次重復(fù)試驗(yàn)各組玉米螟死亡率，并對(duì)各組結(jié)果與非轉(zhuǎn)基因的對(duì)照組結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖8。除植株T2-2-3-1的籽粒及苞葉對(duì)玉米螟的抗性較差，與對(duì)照組無(wú)顯著差異外，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)玉米螟的抗性明顯高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩?。轉(zhuǎn)cry1Ab13基因的試驗(yàn)組玉米螟幼蟲(chóng)生長(zhǎng)緩慢，隨飼喂時(shí)間增加死亡率不斷提高，喂食8 d后試驗(yàn)組玉米螟死亡率達(dá)到80%左右，而非轉(zhuǎn)基因的對(duì)照組玉米螟幼蟲(chóng)生長(zhǎng)速度快，死亡率低，飼喂8 d后死亡率只有10%左右。不同轉(zhuǎn)基因植株對(duì)玉米螟的抗性表現(xiàn)也不同，各轉(zhuǎn)基因植株對(duì)玉米螟的相對(duì)抗性水平與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)到cry1Ab13基因相對(duì)表達(dá)量基本一致。

圖8飼喂轉(zhuǎn)基因玉米籽粒及苞葉對(duì)玉米螟死亡率的影響

Fig.8Effects of feeding transgenic corn kernels or bracts of ears on the mortality rate of Ostrinia furnacalis

3討論與結(jié)論

1995年Armstrong等[19]的研究證明cry1Ab毒蛋白的結(jié)構(gòu)賦予其對(duì)小菜蛾P(guān)lutellaxylostella、煙草天蛾Manducasexta等較強(qiáng)的殺蟲(chóng)活性。隨后國(guó)內(nèi)外許多研究人員將cry1Ab基因?qū)胗衩?，并證明表達(dá)cry1Ab蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)亞洲玉米螟O.furnacalis及歐洲玉米螟O.nubilalis都有很好的田間抗性，能高效控制心葉期及穗期玉米螟的危害。本研究在檀建新等[13]的研究基礎(chǔ)上，利用同源重組的方法將抗蟲(chóng)基因cry1Ab13連接到含有抗除草劑草胺膦的Bar基因的植物表達(dá)載體上，遺傳轉(zhuǎn)化玉米得到5株穩(wěn)定遺傳至T2代的轉(zhuǎn)基因植株，cry1Ab13基因在玉米中的表達(dá)賦予轉(zhuǎn)基因植株抗玉米螟的特性。外源基因穩(wěn)定高效的表達(dá)是轉(zhuǎn)基因工作的重要目標(biāo)，王忠華等[20]的研究表明，cry1Ab基因水稻轉(zhuǎn)化植株經(jīng) 4～5次自交后，目的基因仍能穩(wěn)定遺傳且呈單位點(diǎn)顯性方式遺傳。本研究通過(guò)Southern雜交、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)對(duì)cry1Ab13基因在植株中的整合及表達(dá)情況進(jìn)行分析。試驗(yàn)結(jié)果表明除轉(zhuǎn)基因事件T2-2-3-1外其余各轉(zhuǎn)基因植株中cry1Ab13均為單拷貝形式整合在基因組中，且成功轉(zhuǎn)錄表達(dá)，但各單株間相對(duì)表達(dá)水平存在一定的差異。而轉(zhuǎn)基因事件T2-2-3-1中cry1Ab13基因以3拷貝形式存在，且表達(dá)受到抑制，轉(zhuǎn)錄水平與非轉(zhuǎn)基因植株無(wú)顯著差異，分析原因可能是由于cry1Ab13基因的多拷貝整合或位置效應(yīng)引起的轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默[21]。岳同卿等[22]的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米的研究結(jié)果顯示，不同轉(zhuǎn)化事件的抗蟲(chóng)效果存在一定的差異，本研究得出同樣的結(jié)論。Day等[23]指出外源基因在基因組內(nèi)的整合位置不同可以導(dǎo)致基因表達(dá)水平不同，為解釋上述現(xiàn)象提供了理論參考。轉(zhuǎn)基因植株田間及室內(nèi)對(duì)玉米螟抗性評(píng)價(jià)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入cry1Ab13基因能夠顯著提高植株對(duì)玉米螟的抗性，本試驗(yàn)中轉(zhuǎn)cry1Ab13基因玉米的殺蟲(chóng)效果與cry1Ab13基因的表達(dá)水平基本一致，與王培等[24]研究結(jié)果相符，但也有研究表明轉(zhuǎn)基因作物Bt蛋白表達(dá)量與殺蟲(chóng)效果并不一致[25-26]。

本研究構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA3300-cry1Ab13-Bar，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其導(dǎo)入玉米自交系H99，獲得了4株抗玉米螟及抗除草劑的T2代轉(zhuǎn)基因植株。下一步將通過(guò)優(yōu)化植物重組表達(dá)載體中的表達(dá)調(diào)控元件來(lái)提高轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲(chóng)效果，并繼續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因株系的自交擴(kuò)繁及嚴(yán)格的篩選鑒定，為抗蟲(chóng)玉米新品種的研發(fā)提供材料。

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【責(zé)任編輯莊延，李曉卉】

收稿日期：2016- 02- 15優(yōu)先出版時(shí)間：2016- 07- 05

作者簡(jiǎn)介：陳沼汀(1990—)，女，碩士研究生，E-mail:562770926@qq.com; 通信作者：關(guān)淑艷(1971—)，女，教授，博士，E-mail:458194095@qq.com

基金項(xiàng)目：吉林省省級(jí)糧食生產(chǎn)發(fā)展專項(xiàng)(2015001)；吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)科研啟動(dòng)基金(201242)

中圖分類號(hào)：S433.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001- 411X(2016)05- 0031- 07

Creation of new transgenic maize germplasm harboring cry1Ab13 gene

CHEN Zhaoting, DONG Zhaoxu, LIU Shuang, SUN Guoxu, LI Hui, WEI Xiaoyu, SUN Su, GUAN Shuyan

(College of Life Science， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China)

Abstract：【Objective】 To construct a plant expression vector including a lepidopteran-resistant gene cry1Ab13 and use it to create a new transgenic maize germplasm with high resistance to Ostrinia furnacalis.【Method】The cry1Ab13 gene was inserted into expression plasmid pCAMBIA3300-Bar by homologous recombination method，and the plant expression vector pCAMBIA3300-cry1Ab13-Bar with Bar gene as a selection marker was obtained. Following Agrobacterium mediated transformation of the immature embryo of maize inbred line H99, the regenerated plants were detected by PCR and herbicide-resistance selection for each generation. T2 generation plants were also detected by Southern blotting and real-time quantitative PCR. The resistance of transgenic plants to O. furnacalis was tested indoor and in the fields.【Result】A plant expression vector containing the cry1Ab13 gene was successfully constructed and three T2transgenic maize with high resistance and one T2 transgenic maize with resistance to O. furnacalis were obtained. The cry1Ab13 gene was integrated into maize genome as confirmed by Southern blotting, and it was expressed in maize as shown by real-time quantitative PCR.The resistance of transgenic plants to O. furnacalis was improved significantly compared to non-transgenic control.【Conclusion】We introduced the cry1Ab13 gene into maize and its expression significantly improved the resistance of maize to O. furnacalis, which will promote the development of new insect-resistant maize germplasm.

Key words：insect resistance; cry1Ab13 gene; transgenic maize; Ostrinia furnacalis

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20160705.1200.044.html

陳沼汀， 董昭旭， 劉雙，等.轉(zhuǎn)cry1Ab13基因玉米新種質(zhì)的創(chuàng)制[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016,37(5):31- 37.