16年生大葉相思高效芽誘導(dǎo)、增殖體系研究

王　鴻， 黃烈健， 胡　峰

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所， 廣東 廣州 510520)

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16年生大葉相思高效芽誘導(dǎo)、增殖體系研究

王鴻， 黃烈健， 胡峰

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所， 廣東 廣州 510520)

摘要：【目的】充分利用大葉相思Acacia auriculiformis成年優(yōu)樹(shù)的優(yōu)良性狀，提高大葉相思優(yōu)質(zhì)苗木擴(kuò)繁效率、加快其良種選育及推廣?！痉椒ā恳?6年生大葉相思為材料，對(duì)外植體消毒方式進(jìn)行研究，結(jié)合外植體及芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇，建立大葉相思高效芽誘導(dǎo)體系；對(duì)增殖培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，并研究多次繼代與增殖倍數(shù)的關(guān)系?！窘Y(jié)果】于8月取當(dāng)年生枝條第3～5腋芽的莖段(最優(yōu)外植體)，選擇φ為0.1%升汞和75%乙醇分別處理18 min和15 s最優(yōu)外植體，接種于最佳芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0 mg·L-1+蔗糖40 g·L-1，芽誘導(dǎo)率為92.00%。增殖培養(yǎng)基為II型培養(yǎng)基(MS+ 6-BA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+Ac 0.05 g·L-1+蔗糖30 g·L-1)時(shí)增殖倍數(shù)高且穩(wěn)定，7次繼代平均增殖倍數(shù)為2.63?！窘Y(jié)論】建立的高效組培體系適于大葉相思成年優(yōu)樹(shù)的快速擴(kuò)繁。

關(guān)鍵詞：大葉相思； 成年優(yōu)樹(shù)； 組織培養(yǎng)； 芽誘導(dǎo)

大葉相思Acaciaauriculiformis是含羞草科Mimosaceae金合歡屬Acacia植物，具有重要的生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益[1]，速生、耐酸、耐旱、耐貧瘠，抗病蟲(chóng)害、適應(yīng)性強(qiáng)，是改良土壤、造林綠化的主要樹(shù)種之一；干型通直，材質(zhì)優(yōu)良，得漿率高，是優(yōu)良的造紙、家具用材。我國(guó)于20世紀(jì)70年代，從澳大利亞等地引種以來(lái)[2]，篩選出了一批具有較好表現(xiàn)的優(yōu)良種源、家系、無(wú)性系[3-10]，極大地促進(jìn)了大葉相思的推廣種植。然而，目前大葉相思生產(chǎn)中以種子繁殖為主，后代性狀分化嚴(yán)重，阻礙著大葉相思優(yōu)良苗木的推廣利用，在生產(chǎn)中的表現(xiàn)受到影響。開(kāi)展大葉相思成年優(yōu)樹(shù)選擇，使優(yōu)良性狀在較早期更加穩(wěn)定，對(duì)生產(chǎn)及育種具有更重要的意義。

無(wú)性繁殖能最大限度地保持其優(yōu)良母株的優(yōu)良性狀，利于優(yōu)樹(shù)優(yōu)良性狀的固定。大葉相思優(yōu)樹(shù)無(wú)性繁殖幼化的研究主要集中在扦插繁殖方面[11-12]，由于對(duì)土地資源有較多要求，其在實(shí)際應(yīng)用中難度較大。組培技術(shù)對(duì)生產(chǎn)地要求較少，且從生產(chǎn)采穗母株方面看，組培更利于優(yōu)樹(shù)幼態(tài)性材料的獲得，對(duì)大葉相思成年優(yōu)樹(shù)擴(kuò)繁具有重要意義。但目前關(guān)于大葉相思組培快繁的報(bào)道較少[13]，主要原因是以愈傷組織誘導(dǎo)途徑進(jìn)行組培，存在著變異大的問(wèn)題。因此，開(kāi)展大葉相思成年優(yōu)樹(shù)的組培技術(shù)體系研究，對(duì)促進(jìn)大葉相思育種及生產(chǎn)推廣具有重要意義。

本試驗(yàn)以16年生大葉相思優(yōu)樹(shù)為材料對(duì)外植體消毒方式進(jìn)行研究，結(jié)合外植體的選擇，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基選擇，建立了大葉相思高效芽誘導(dǎo)體系；對(duì)增殖培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，并研究多次繼代與增殖倍數(shù)的關(guān)系，獲得較高且穩(wěn)定的增殖倍數(shù)，提高擴(kuò)繁效率，并能有效生根[14]。建立的組培快繁技術(shù)體系為大葉相思良種快速繁殖提供技術(shù)支撐和保障，對(duì)加速大葉相思良種的推廣種植具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

通過(guò)比較樹(shù)高、胸徑、冠幅等因子，從中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所大葉相思16年生試驗(yàn)林中選取優(yōu)良單株，以當(dāng)年新生的腋芽飽滿的枝條為研究材料。芽誘導(dǎo)選用經(jīng)φ為0.1%升汞和75%乙醇消毒后無(wú)污染的帶腋芽莖段為材料。增殖培養(yǎng)選用外植體通過(guò)芽誘導(dǎo)萌發(fā)的健壯腋芽為材料。

1.2消毒劑處理時(shí)間對(duì)大葉相思芽誘導(dǎo)的影響

于8月剪取大葉相思優(yōu)良單株的當(dāng)年生腋芽飽滿枝條，剪去葉片，洗衣粉水浸泡30 min，刷凈后流水沖洗2 h，剪成長(zhǎng)1.0～2.0 cm帶腋芽的莖段，用φ為0.1%的升汞分別處理15、18、20 min，再分別用φ為75%的乙醇處理5、15、30 s，消毒后用無(wú)菌水沖洗4～6次。

1.3材料部位對(duì)大葉相思芽誘導(dǎo)的影響

將當(dāng)年生腋芽飽滿枝條的第1～2腋芽莖段(上段)、第3～5腋芽莖段(中段)、第7～8腋芽莖段(下段)剪成長(zhǎng)1.0～2.0 cm帶腋芽莖段，用“1.2”中篩選出的最佳方法消毒。

1.46-BA、蔗糖、基本培養(yǎng)基對(duì)大葉相思芽誘導(dǎo)的影響

將消毒后的外植體接種至芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，考慮6-BA、蔗糖、基本培養(yǎng)基對(duì)大葉相思芽誘導(dǎo)的影響，設(shè)置L9(33)的正交試驗(yàn)(表1)，每個(gè)處理接種50個(gè)莖段，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)出芽率。

表1大葉相思芽誘導(dǎo)的L9(33)正交試驗(yàn)

Tab.1Bud inducing of Acacia auriculiformis orthogonal experimentL9(33)

水平ρ(6-BA)/(mg·L-1)ρ(蔗糖)/(g·L-1)培養(yǎng)基類型1020MS21.0301/2MS32.040改良MS

1.5增殖培養(yǎng)

1.5.16-BA、NAA單因子對(duì)大葉相思增殖的影響增殖培養(yǎng)基均以MS為基本培養(yǎng)基，選擇不同質(zhì)量濃度的細(xì)胞分裂素6-BA(0.1、0.5、1.0、1.5 mg·L-1)，探討細(xì)胞分裂素對(duì)大葉相思增殖的影響；添加固定質(zhì)量濃度的細(xì)胞分裂素6-BA(1.0 mg·L-1)，選擇不同質(zhì)量濃度的生長(zhǎng)素NAA(0.05、0.10、0.50、1.00 mg·L-1)，探討生長(zhǎng)素NAA對(duì)增殖的影響。每個(gè)處理接種20個(gè)莖段，重復(fù)3次。增殖培養(yǎng)35 d后，調(diào)查增殖苗的生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)其增殖倍數(shù)。

1.5.26-BA、NAA不同濃度組合對(duì)大葉相思增殖的影響以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加質(zhì)量濃度為0.50、0.75和1.00 mg·L-1的6-BA，質(zhì)量濃度為0.10、0.25和0.50 mg·L-1的生長(zhǎng)素NAA，設(shè)置3×3的交互試驗(yàn)，探討6-BA與NAA不同濃度組合對(duì)增殖的影響，共9組處理，每個(gè)處理接種20個(gè)莖段，重復(fù)3次。增殖培養(yǎng)35 d后，調(diào)查增殖苗的生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)其增殖倍數(shù)。

1.5.3基本培養(yǎng)基、活性炭濃度、蔗糖濃度對(duì)大葉相思增殖的影響分別探討不同基本培養(yǎng)基(MS、1/2MS、改良MS)、蔗糖質(zhì)量濃度(20、30和40 g·L-1)、活性炭質(zhì)量濃度(0.05、0.10、0.20 g·L-1)對(duì)增殖培養(yǎng)的影響，試驗(yàn)均添加“1.5.2”篩選出的最佳植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合，每處理接種20個(gè)莖段，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。增殖培養(yǎng)35 d后，調(diào)查增殖苗的生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)其增殖倍數(shù)。

1.5.4多次繼代培養(yǎng)對(duì)大葉相思增殖的影響在上述對(duì)大葉相思增殖培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)得出2種最佳增殖培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，進(jìn)行7次繼代培養(yǎng)，每35 d繼代1次，每個(gè)處理接種20個(gè)莖段，重復(fù)3次，調(diào)查第1、3、5、7代增殖苗的生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)其增殖倍數(shù)。

1.6培養(yǎng)條件

以上試驗(yàn)除特殊說(shuō)明外，消毒后的外植體均接種至MS上進(jìn)行芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，每個(gè)處理接種50瓶，每瓶接種1個(gè)莖段，重復(fù)3次，15 d后統(tǒng)計(jì)污染率、褐化率、存活率、出芽率。培養(yǎng)基中均添加瓊脂7 g·L-1、蔗糖30 g·L-1，控制pH為6.0左右，在121 ℃條件下高壓滅菌15 min，培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，每日光照12 h，光照度2 500 lx。

1.7數(shù)據(jù)處理

使用Excel及SPSS18.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和方差分析，以最小顯著差數(shù)法(LSD)評(píng)價(jià)差異的顯著性，使用Origin7.5進(jìn)行作圖。

污染率=污染數(shù)/接種數(shù)×100%,

褐化率=褐化數(shù)/接種數(shù)×100%,

存活率=存活數(shù)/接種數(shù)×100%,

出芽率=出芽數(shù)/存活數(shù)×100%。

2結(jié)果與分析

2.1消毒劑處理時(shí)間對(duì)大葉相思芽誘導(dǎo)的影響

選擇φ為0.1%升汞和75%乙醇對(duì)外植體進(jìn)行消毒處理，結(jié)果見(jiàn)表2。污染率隨著升汞和乙醇的處理時(shí)間增加呈下降趨勢(shì)，而褐化率則隨消毒劑的處理時(shí)間增加而增加。出芽率受消毒劑的影響較大，消毒劑處理時(shí)間延長(zhǎng)，外植體的出芽率有所下降。消毒時(shí)間對(duì)污染率、褐化率、存活率、出芽率的影響均達(dá)到顯著水平(P<0.05)，大葉相思耐受消毒劑的刺激，以升汞、乙醇分別處理18 min、15 s或18 min、5 s效果為最佳，出芽率分別為79.33%、81.33%。后續(xù)研究只選擇其中1個(gè)處理，即升汞和乙醇分別處理18 min、15 s。

2.2材料部位對(duì)大葉相思芽誘導(dǎo)的影響

不同材料部位對(duì)大葉相思芽誘導(dǎo)的影響結(jié)果見(jiàn)表3。以上段作為外植體時(shí)，大葉相思的存活率最低，為58.67%，褐化率顯著最高，為26.00%。以下段為外植體時(shí)，污染率最高，出芽率則最低。以枝條中段為外植體時(shí)，存活率最高，且顯著高于上段，為71.33%，而出芽率與上段無(wú)顯著差異(P>0.05)，為84.17%。綜上所述，最佳外植體應(yīng)選擇枝條的中段。

表2不同升汞和乙醇消毒時(shí)間對(duì)大葉相思芽誘導(dǎo)的影響1)

Tab.2Effects of sterilization time of mercuric chloride and ethyl alcohol on bud inducing of Acacia auriculiformis%

t升汞/mint乙醇/s污染率褐化率存活率出芽率15538.00a7.33c54.67ab82.67a151532.67ab10.67c56.67b76.00ab153033.33ab20.67bc46.00ab74.00ab18525.33b8.67c66.00ab81.33a181520.00bc12.00c68.00a79.33ab183018.67bc22.00b59.33ab70.00b20520.00bc22.67b57.33ab75.33ab201517.33bc28.67ab54.00ab74.00ab203014.00c34.00ab52.00b66.67b

1) 同列數(shù)據(jù)后凡是有一個(gè)相同字母者，表示差異不顯著(P>0.05，LSD法)。

表3材料部位對(duì)大葉相思芽誘導(dǎo)的影響1)

Tab.3Effects of material position on bud inducing of Acacia auriculiformis%

材料部位污染率褐化率存活率出芽率上段15.33a26.00a58.67b86.67a中段20.00a8.67b71.33a84.17a下段22.67a9.33b68.00ab69.17a

1) 同列數(shù)據(jù)后凡是有一個(gè)相同字母者，表示差異不顯著(P>0.05，LSD法)。

2.36-BA、蔗糖、基本培養(yǎng)基對(duì)大葉相思芽誘導(dǎo)的影響

將無(wú)菌莖段接入培養(yǎng)基中，10 d后腋芽開(kāi)始萌發(fā)，30 d左右生長(zhǎng)至2～3 cm。由表4可知， 培養(yǎng)基中不添加6-BA時(shí)，大葉相思的腋芽表現(xiàn)出生長(zhǎng)緩慢的現(xiàn)象，在培養(yǎng)基中添加1.0 mg·L-1的6-BA時(shí)，大葉相思的腋芽生長(zhǎng)迅速，但添加的6-BA質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)(2.0 mg·L-1)，腋芽的生長(zhǎng)出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象；基本培養(yǎng)基選擇改良MS和1/2MS時(shí)，腋芽均表現(xiàn)出生長(zhǎng)弱小的現(xiàn)象，而以MS為基本培養(yǎng)基，誘導(dǎo)的芽較為健壯。方差分析結(jié)果(表5)表明：6-BA和基本培養(yǎng)基類型對(duì)大葉相思出芽率的影響都達(dá)到了極顯著水平(P<0.01)，而蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)出芽率的影響差異不顯著。6-BA為1.0 mg·L-1時(shí)，平均出芽率最高，為74.67%，顯著高于其他處理；基本培養(yǎng)基選擇MS時(shí)，出芽率極顯著高于1/2MS和改良MS。

綜上所述，大葉相思最佳芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+蔗糖40 g·L-1，出芽率最高。

表46-BA、蔗糖、基本培養(yǎng)基對(duì)大葉相思芽誘導(dǎo)的影響

Tab.4Effects of 6-BA, sucrose and basic medium on Acacia auriculiformis bud induction

ρ(6-BA)/(mg·L-1)ρ(蔗糖)/(g·L-1)培養(yǎng)基類型出芽率1)/%生長(zhǎng)狀況020MS72.67b生長(zhǎng)緩慢0301/2MS65.33bc生長(zhǎng)緩慢040改良MS50.67d生長(zhǎng)緩慢1.0201/2MS68.00b生長(zhǎng)速度快,長(zhǎng)勢(shì)較弱1.030改良MS64.00bc生長(zhǎng)速度快,長(zhǎng)勢(shì)較弱1.040MS92.00a生長(zhǎng)速度快,芽健壯2.020改良MS52.00d芽弱小,有玻璃化現(xiàn)象2.030MS50.67d叢生芽,有玻璃化現(xiàn)象2.0401/2MS54.67cd芽弱小,有玻璃化現(xiàn)象

1) 該列數(shù)據(jù)后凡是有一個(gè)相同字母者，表示差異不顯著(P>0.05，LSD法)。

表5大葉相思初代培養(yǎng)方差分析

Tab.5Variance analysis of primary culture of Acaciaauriculiformis

項(xiàng)目平方和自由度均方Sig.6-BA2224.88921112.4440.000蔗糖160.889280.4440.358基本培養(yǎng)基1190.2222595.1110.003誤差1488.0002074.400總計(jì)113364.00027

2.4增殖培養(yǎng)

2.4.16-BA、NAA單因子對(duì)大葉相思增殖的影響不同質(zhì)量濃度的6-BA和生長(zhǎng)素NAA對(duì)大葉相思增殖倍數(shù)的影響達(dá)到了顯著水平(表6)。在不添加NAA的增殖培養(yǎng)基中，增殖倍數(shù)隨著6-BA質(zhì)量濃度的增加出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)6-BA為1.0 mg·L-1，平均增殖倍數(shù)達(dá)到2.61，含低6-BA(0.5～1.0 mg·L-1)的增殖培養(yǎng)基誘導(dǎo)的增殖芽矮小，且生長(zhǎng)緩慢，導(dǎo)致叢生芽中的有效芽減少；當(dāng)6-BA為1.0 mg·L-1時(shí)，平均增殖倍數(shù)也隨著NAA質(zhì)量濃度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，增殖芽的長(zhǎng)勢(shì)隨著NAA質(zhì)量濃度的升高而逐漸變好，在NAA為0.10 mg·L-1時(shí)，平均增殖倍數(shù)最高，為2.88，當(dāng)NAA達(dá)到1.00 mg·L-1時(shí)，芽的生長(zhǎng)達(dá)到最佳狀態(tài)。故而NAA、6-BA的加入更利于增殖培養(yǎng)，6-BA在0.5～1.0 mg·L-1范圍較適宜，NAA適宜的質(zhì)量濃度范圍為0.05～0.50 mg·L-1。

表66-BA、NAA單因子對(duì)大葉相思增殖的影響

Tab.6Effects of 6-BA and NAA on the proliferation of Acacia auriculiformis

ρ/(mg·L-1)6-BA NAA平均增殖倍數(shù)1)生長(zhǎng)狀況0.101.31c芽生長(zhǎng)緩慢,矮小0.502.38ab芽生長(zhǎng)緩慢,矮小1.002.61ab芽叢生,矮小1.502.11b芽叢生,矮小1.00.052.66ab芽叢生,生長(zhǎng)較旺盛1.00.102.88a芽叢生,生長(zhǎng)旺盛1.00.502.19b芽生長(zhǎng)健壯1.01.001.81bc芽生長(zhǎng)快,健壯

1) 該列數(shù)據(jù)后凡是有一個(gè)相同字母者，表示差異不顯著(P>0.05，LSD法)。

2.4.26-BA、NAA不同濃度組合對(duì)大葉相思增殖的影響表7表明，大葉相思增殖倍數(shù)隨著6-BA與NAA比值的增加基本表現(xiàn)出上升趨勢(shì)。綜合增殖倍數(shù)和增殖芽生長(zhǎng)狀態(tài)看，當(dāng)6-BA為1.00 mg·L-1，NAA為0.10 mg·L-1時(shí)(即m(6-BA)∶m(NAA)=10∶1)，增殖倍數(shù)最高，為3.0，此時(shí)的增殖芽生長(zhǎng)速度快，有效芽多(圖1A)。6-BA為1.00 mg·L-1，NAA為0.25 mg·L-1時(shí)(即m(6-BA)∶m(NAA)=4∶1)，增殖倍數(shù)為2.75，與前者最高增殖倍數(shù)處理無(wú)顯著差異。而當(dāng)m(6-BA)∶m(NAA)<10∶1時(shí)，多數(shù)增殖芽的生長(zhǎng)速度緩慢，在同樣的增殖時(shí)間內(nèi)達(dá)不到較高的增殖倍數(shù)(圖1B)。故而增殖培養(yǎng)基中二者的最適加入量分別為：6-BA 1.00 mg·L-1，NAA 0.10 mg·L-1。

表76-BA、NAA不同質(zhì)量濃度組合對(duì)大葉相思增殖的影響

Tab.7Effects of the combinations of 6-BA and NAA on proliferation of Acacia auriculiformis

ρ/(mg·L-1)6-BANAAm(6-BA)∶m(NAA)增殖倍數(shù)1)生長(zhǎng)狀況0.500.105∶11.86bc有效芽少,生長(zhǎng)緩慢0.500.252∶12.28b有效芽少,生長(zhǎng)緩慢0.500.501∶11.35c有效芽少,生長(zhǎng)緩慢0.750.1015∶22.33b有效芽少0.750.253∶12.49ab有效芽少0.750.503∶22.14b有效芽少1.000.1010∶13.00a有效芽多,生長(zhǎng)健壯1.000.254∶12.75ab有效芽多,生長(zhǎng)緩慢1.000.502∶12.94ab有效芽少

1) 該列數(shù)據(jù)后凡是有一個(gè)相同字母者，表示差異不顯著(P>0.05，LSD法)。

A：6-BA為1.00 mg·L-1、NAA為0.10 mg·L-1，增殖芽健壯且有效芽多；B：m(6-BA)∶m(NAA)<10∶1，增殖芽生長(zhǎng)緩慢，有效芽少。

圖1大葉相思增殖芽的生長(zhǎng)情況

Fig.1Growth of proliferation bud of Acacia auriculiformis

2.4.3基本培養(yǎng)基類型、活性炭、蔗糖濃度對(duì)大葉相思增殖的影響基本培養(yǎng)基類型對(duì)大葉相思增殖倍數(shù)的影響沒(méi)有達(dá)到顯著水平(圖2)，但觀察發(fā)現(xiàn)以1/2MS、改良MS為基本培養(yǎng)基時(shí)，增殖芽生長(zhǎng)緩慢，芽叢矮小，不適宜選作基本培養(yǎng)基。蔗糖濃度對(duì)增殖倍數(shù)的影響也未達(dá)到顯著水平，含低濃度蔗糖的培養(yǎng)基誘導(dǎo)的增殖芽長(zhǎng)勢(shì)較弱，高濃度的蔗糖誘導(dǎo)的增殖芽生長(zhǎng)緩慢?；钚蕴繚舛仍酱螅鲋潮稊?shù)越低，增殖芽的長(zhǎng)勢(shì)越好。

2.4.4多次繼代培養(yǎng)對(duì)大葉相思增殖的影響經(jīng)過(guò)增殖培養(yǎng)研究，獲得了2種類型的增殖培養(yǎng)基：I型(MS+ 6-BA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+ 蔗糖30 g·L-1)和II型(MS+ 6-BA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+ Ac 0.05 g·L-1+ 蔗糖30 g·L-1)，I型為較高增殖倍數(shù)的增殖培養(yǎng)基，II型為增殖芽長(zhǎng)勢(shì)較好的增殖培養(yǎng)基。

各圖中，柱子上方凡是有一個(gè)相同字母者，表示處理間差異不顯著(P>0.05，LSD法)。

Fig.2Effects of basic medium, sucrose concentration and active carbon concentration on proliferation of Acacia auriculiformis

7次繼代培養(yǎng)結(jié)果表明：I型培養(yǎng)基的增殖倍數(shù)隨著繼代次數(shù)的增加而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，II型培養(yǎng)基的增殖倍數(shù)則較為穩(wěn)定(圖3)。大葉相思在I型培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的平均增殖倍數(shù)由第1代的3.14下降至第7代的1.96，呈線性下降，平均兩代的下降率為14.28%。觀察發(fā)現(xiàn)，該培養(yǎng)基誘導(dǎo)的增殖芽的長(zhǎng)勢(shì)逐次變差，玻璃化趨勢(shì)增加，有效芽數(shù)目減少(圖4C為I型培養(yǎng)基、第1次繼代，長(zhǎng)勢(shì)好，增殖倍數(shù)較高，為3.14；圖4D為I型培養(yǎng)基第7次繼代，生長(zhǎng)差，增殖倍數(shù)低，為1.96)。而II型培養(yǎng)基誘導(dǎo)的平均增殖倍數(shù)變化趨勢(shì)不大，7次繼代的平均增殖倍數(shù)為2.63，增殖芽的質(zhì)量較好，芽健壯高大，葉片舒展(圖4A為II型培養(yǎng)基，第1次繼代；圖4B為II型培養(yǎng)基，第7次繼代)。

圖3大葉相思在I型和II型培養(yǎng)基上7次繼代培養(yǎng)的增殖倍數(shù)變化

Fig.3The proliferation rates of seven subcultures of Acacia auriculiformis on type I and II media

A：II型培養(yǎng)基第1代； B：II型培養(yǎng)基第7代； C：I型培養(yǎng)基第1代； D：I型培養(yǎng)基第7代。

3討論與結(jié)論

林木早期選擇雖然可以加速育種進(jìn)程，選擇出的優(yōu)樹(shù)也易于無(wú)性擴(kuò)繁推廣利用；但是由于樹(shù)齡較低，通常在后期的選擇中被淘汰的概率較高(30%～40%)。因此，早期選擇的優(yōu)樹(shù)，其可靠性遠(yuǎn)不及成年優(yōu)樹(shù)選擇[15]。優(yōu)樹(shù)無(wú)性系化可提供大量?jī)?yōu)質(zhì)苗木，滿足生產(chǎn)及良種推廣、選育工作對(duì)優(yōu)質(zhì)苗木的需求。本研究的材料取自16年生優(yōu)樹(shù)，保證了材料的優(yōu)越性和可靠性，將對(duì)大葉相思良種的選育及推廣利用具有重要作用。對(duì)大葉相思成年優(yōu)樹(shù)組培擴(kuò)繁體系的研究，有利于加速其良種選育研究及生產(chǎn)推廣利用，進(jìn)而將優(yōu)樹(shù)的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益最大化。

對(duì)植物材料進(jìn)行組培快繁時(shí)需克服其成熟效應(yīng)，早期選擇的材料，其年齡尚幼，進(jìn)行組培較為容易；隨著樹(shù)齡的增加，組培難度增大；樹(shù)種不同，無(wú)性系不同，進(jìn)行組培時(shí)差異大，且多數(shù)成年材料進(jìn)行組培時(shí)芽誘導(dǎo)率低，增殖倍數(shù)不穩(wěn)定。根據(jù)對(duì)不同樹(shù)齡的不同植物材料進(jìn)行的組培快繁技術(shù)研究的報(bào)道，樹(shù)齡較低的植物材料較為容易組培成功。黃騏[16]成功建立了卷莢相思A.cincinnata4年生優(yōu)樹(shù)快繁體系，獲得了較高的增殖倍數(shù)(5.33左右)及生根率(86.0%)，但此技術(shù)體系是否適于后期選優(yōu)出來(lái)的成年優(yōu)樹(shù)尚不可知。黃烈健等[17]對(duì)3～5年生馬占相思A.mangium優(yōu)樹(shù)不同無(wú)性系進(jìn)行組培快繁研究的結(jié)果表明：樹(shù)齡對(duì)休眠芽的萌發(fā)影響較大，不同無(wú)性系休眠芽啟動(dòng)時(shí)間、芽質(zhì)量、對(duì)激素濃度的響應(yīng)均存在差異；裘珍飛等[18]對(duì)馬占相思成年優(yōu)樹(shù)組培早期增殖速率的研究結(jié)果表明：30個(gè)無(wú)性系增殖啟動(dòng)時(shí)間以及增殖率有較大差異，啟動(dòng)時(shí)間最短需3個(gè)月，最長(zhǎng)需7個(gè)月以上；增殖率隨著繼代次數(shù)的增加表現(xiàn)出不同幅度的增加，繼代到一定次數(shù)后趨于穩(wěn)定。中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所相思課題組成功建立了16年生厚莢相思A.crassicarpa[19]、馬大雜種相思A.mangium×A.auriculiformis[20]優(yōu)樹(shù)的組培體系，但厚莢相思的誘導(dǎo)率(80.56%)比馬大雜種相思(95.68%)低了15.12%，表明樹(shù)種間有較大差異。

對(duì)大葉相思組培快繁研究的國(guó)內(nèi)報(bào)道顯示，通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)植株的方法存在著變異較大的問(wèn)題[21]。本研究以16年生大葉相思成年優(yōu)樹(shù)為材料，通過(guò)芽誘導(dǎo)途徑成功建立組培快繁技術(shù)體系，獲得的組培苗性狀穩(wěn)定，能較好地保持優(yōu)樹(shù)的優(yōu)良性狀，對(duì)加速大葉相思的良種選育及為生產(chǎn)提供大量?jī)?yōu)質(zhì)苗木具有重要意義。

外植體的休眠芽誘導(dǎo)除受到樹(shù)齡的影響外[17]，還受到多方面的綜合影響：1)外植體的成功消毒是進(jìn)行芽誘導(dǎo)的關(guān)鍵，在把握消毒劑種類及消毒時(shí)間的同時(shí)，要注意觀察外植體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，不同木質(zhì)化程度的外植體對(duì)消毒劑的耐受程度不同，不同物種形態(tài)結(jié)構(gòu)需區(qū)別對(duì)待。馬占相思的新生莖段粗大，木質(zhì)疏松，受消毒劑的影響最為敏感，容易被長(zhǎng)時(shí)間的消毒劑處理而殺死[17]。本研究則發(fā)現(xiàn)，大葉相思木質(zhì)緊實(shí)，比較耐受消毒劑的刺激，有2個(gè)處理表現(xiàn)最優(yōu)：以升汞和乙醇分別處理18 min和5 s或18 min和15 s。受材料部位和消毒時(shí)間的影響，馬占相思選幼嫩頂芽部分莖段，以短時(shí)間的消毒處理能獲得較高的芽萌發(fā)率[18]。本研究結(jié)果表明：外植體莖段來(lái)源不同，木質(zhì)化程度不同，大葉相思選取3～5腋芽莖段為最佳外植體，與本課題組對(duì)馬大雜種相思[20]、馬占相思[17]的研究結(jié)果一致。2)6-BA和基本培養(yǎng)基類型對(duì)芽誘導(dǎo)具有一定的影響。胡峰等[19]對(duì)厚莢相思的研究表明：適宜的培養(yǎng)基為MS，6-BA對(duì)誘導(dǎo)具有正效應(yīng)。本研究中，大葉相思在不同類型的培養(yǎng)基上，腋芽生長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著差異，MS培養(yǎng)基的芽健壯。6-BA同樣對(duì)芽誘導(dǎo)有正效應(yīng)，培養(yǎng)基中無(wú)6-BA時(shí)，腋芽生長(zhǎng)緩慢，但6-BA濃度過(guò)高會(huì)出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象?？傊瑢?duì)不同樹(shù)齡的材料，結(jié)合外植體的選擇和消毒方式的篩選，同時(shí)對(duì)培養(yǎng)基及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑做篩選，方可建立高效的芽誘導(dǎo)體系。

成年優(yōu)樹(shù)增殖培養(yǎng)時(shí)，單次繼代培養(yǎng)均能獲得較高的增殖倍數(shù)，但隨著繼代次數(shù)的增加，增殖倍數(shù)的變化明顯。施瓊等[22]對(duì)馬大雜種相思16年生優(yōu)樹(shù)組培研究表明，多次繼代培養(yǎng)后增殖倍數(shù)大幅下降。本試驗(yàn)中，大葉相思在I型培養(yǎng)基上多次繼代也出現(xiàn)了同樣的問(wèn)題，這可能是多次繼代的增殖芽長(zhǎng)期受高濃度激素的刺激，組織細(xì)胞發(fā)生遺傳性的改變，在培養(yǎng)過(guò)程中逐漸消耗了原有母體組織中存在的與器官形成相關(guān)的特殊物質(zhì)，從而使細(xì)胞分化能力下降，多次繼代的增殖倍數(shù)下降、增殖芽長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)鮗23]。但在培養(yǎng)基中加入一定量的活性炭(II型培養(yǎng)基：MS+ 6-BA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+Ac 0.05 g·L-1+蔗糖30 g·L-1)后,7次繼代增殖倍數(shù)趨于穩(wěn)定，增殖倍數(shù)均值為2.63。這可能是活性炭作為一種添加劑，可以吸收培養(yǎng)基內(nèi)的有害物質(zhì)[24]，進(jìn)而促進(jìn)生長(zhǎng)的緣故[25]。另外，有關(guān)研究表明，在培養(yǎng)基中添加生物素[26]、赤霉素[27]等也能有效地提高增殖倍數(shù)、改善組培苗的質(zhì)量。

根據(jù)中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所相思課題組對(duì)3～5年生馬占相思[17]、16年生厚莢相思[19]、16年生馬大雜種相思[20,22]組培體系研究結(jié)果表明：組培苗生根幾乎不受樹(shù)齡影響。本研究的最佳生根體系為1/2 MS+IBA 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1，生根率為94.36%，具體研究結(jié)果見(jiàn)該課題組的相關(guān)報(bào)道[14]。

致謝：感謝廣東省江門市新會(huì)區(qū)國(guó)家重點(diǎn)相思良種基地提供試驗(yàn)條件!感謝廣東省江門市新會(huì)區(qū)林業(yè)科學(xué)研究所黃宏健同志以及廣東省江門市新會(huì)區(qū)農(nóng)林局盧國(guó)桓同志等提供的幫助！

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【責(zé)任編輯李曉卉,莊延】

收稿日期：2015- 12- 15優(yōu)先出版時(shí)間：2016- 07- 05

作者簡(jiǎn)介：王鴻(1993—)，女，碩士研究生，E-mail: 824394696@qq.com; 通信作者：黃烈健(1971—)，男，副研究員，博士，E-mail:13802987948@163.com

基金項(xiàng)目：“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD01B0402)。

中圖分類號(hào)：S722.89

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001- 411X(2016)05- 0091- 07

Efficient bud inducing and proliferation of 16-year-old Acacia auriculiformis plant

WANG Hong, HUANG Liejian, HU Feng

(Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy Forestry, Guangzhou 510520, China)

Abstract：【Objective】 To utilize the superior properties of mature Acacia auriculiformis, improve propagation efficiency, and accelerate breeding and promotion of elite varieties.【Method】 A. auriculiformis bud inducing system was established by comparing the disinfection strategies for the explants from 16-year-old A. auriculiformis and screening the bud inducing media. The proliferation media were screened and the relationship between subculture times and proliferation rate was studied. 【Result】 The optimal explants were those collected from the 3th-5th node of shoots in August. For the optimal explants treated with 0.1% mercuric chloride for 18 min and 75% ethanol for 15 s, and inoculated onto the best bud inducing medium containing MS medium + 6-BA 1.0 mg·L-1+sucrose 40 g·L-1, the germination rate reached 92.00%. When type II medium (MS+ 6-BA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+Ac 0.05 g·L-1+sucrose 30 g·L-1) was used for proliferation, the proliferation rate was high and stable with an average rate of 2.63 for seven generations. 【Conclusion】 This tissue culture system enables fast propagation for mature elite plants of A. auriculiformis.

Key words：Acacia auriculiformis; mature elite plant; tissue culture; bud inducing

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20160705.1159.020.html

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