陳爍 周利武 張雷 趙云龍 楊超 趙建寧*

1. 南京軍區(qū)南京總醫(yī)院骨科， 江蘇 南京 210002 2. 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院骨科， 江蘇 南京 210000

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以滑膜組織假瘤樣生長為主要特征的慢性炎癥性疾病[1]。RA滑膜組織的主要特征之一是成纖維樣滑膜細胞呈現(xiàn)腫瘤樣的生長方式。RAFLS能夠抑制凋亡并以非依賴性方式增殖，這種生長方式與細胞在無細胞外基質(zhì)環(huán)境中的生存和凋亡能力相關(guān)[2]。RAFLS過度增生導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞，雖然RAFLS增生的機制尚未完全明確，但參與此過程的一些抗凋亡分子或信號通路已經(jīng)得到確認[3]。RAFLS表達的抗凋亡成分包括細胞型Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白樣白介素-1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白(FLIP)[4]、P53基因突變[5], 泛素相關(guān)蛋白(sentrin)[6]，類泛素修飾因子1(SUMO-1)[6]，Bcl-2[7]，NF-κB和/或Akt信號通路的激活[8-9]。

牛蒡是一種能夠有效減輕風(fēng)濕病疼痛和發(fā)熱的中藥材。牛蒡甙元(C21H24O6；分子量：372.41)是一種從牛蒡中提取的苯丙素二芐基丁內(nèi)酯木酚素，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗病毒等多種生物活性[10-15]。作為一種新抗癌劑，牛蒡甙元通過MOS/P38 MAPKs通路誘導(dǎo)非嗜荷爾蒙類型乳癌細胞凋亡[16]。對于膀胱癌T24細胞，牛蒡甙元能誘導(dǎo)細胞周期停滯及細胞凋亡[17]。牛蒡甙元通過下調(diào)生存蛋白的表達、抑制信號傳感器和STAT3信號通路激活劑，來增強癌細胞對于順鉑的化學(xué)敏感性[18-19]。本研究旨在探索牛蒡甙元對RAFLS增殖和凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞分離和處理

22例接受膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者，其中男性6名，女性16名，年齡39-63歲，在手術(shù)獲得的關(guān)節(jié)滑膜組織中提取RAFLS。全部患者均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷標準[20]，研究開始前已獲得患者的書面同意。將滑膜組織切成2～3 mm的碎片，加入4 mg/ml的I型膠原酶(Worthington, Freehold, NJ, US)，在DMEM(Invitrogen Life Tech, Carlsbad, CA, US)中放置，在含5%CO2的37℃保溫箱中保存4h。經(jīng)酶處理后，成纖維樣滑膜細胞用尼龍細胞濾網(wǎng)(BD Falcon，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ, US)濾出，DMEM充分洗滌后浸泡在含10%v/v牛胎兒血清(FBS; Invitrogen)、1%青霉素-鏈霉素溶液(Invitrogen)、1%谷氨酰胺(Sigma, St. Louis, MO, US)的DMEM中培養(yǎng)。細胞保存于含5%CO2的37℃保溫箱中，3天更換1次培養(yǎng)液。當(dāng)80%～90%細胞匯集以后，貼壁細胞就會被胰蛋白酶化，并以1∶3的比例分裂。本實驗使用的FLS在反式顯微鏡下有結(jié)構(gòu)上的均質(zhì)性，具有典型的成纖維樣結(jié)構(gòu)。FLS的純度用流式細胞儀進行測定，檢測異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗CD3，PE標記的抗CD90和APC標記的抗CD14單克隆抗體含量(由BD Pharmingen公司提供)。RAFLS傳代3～8次后，凍存于10%二甲基亞砜/90%胎牛血清并儲存在液氮中。

細胞接種于96孔板或60 mm培養(yǎng)皿(Corning Life Sciences, Acton, MA)，于無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,然后分別在無牛蒡甙元和含有10、20、30 μM牛蒡甙元的DMEM全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2 MTT實驗

RAFLS在濃度為每孔1×104的96孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，一式三份。三分標本分別培養(yǎng)并觀察12、24、48 h，在每個時間點結(jié)束前3 h，每孔加入20 μl噻唑藍溶液(5 mg/ml磷酸鹽緩沖液)，并且在37℃環(huán)境下培養(yǎng)3 h，移除媒介后每孔加入100 μl二甲基亞砜，細胞培養(yǎng)板在定軌搖床中輕柔旋轉(zhuǎn)10 min，使沉淀完全溶解，再用酶標分析儀測量570 nm處吸光度值。

1.3 乳酸脫氫酶檢測分析

RAFLS在濃度為每孔1×104的96孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，一式三份。三分標本分別培養(yǎng)并觀察48 h，以LDH在媒介中的釋放量來評估牛蒡甙元的細胞毒性。

1.4 細胞凋亡實驗

RAFLS在濃度為每孔5×104的24孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，一式三份。三分標本分別培養(yǎng)并觀察48 h。經(jīng)PBS洗滌后，用膜聯(lián)蛋白V-FITC凋亡檢測工具進行染色，然后用FACSCaliburTM流式細胞儀檢測和CELLQuest軟件進行分析，碘化丙啶陰性而膜聯(lián)蛋白V陽性的為凋亡細胞，二者皆陽性的為壞死細胞。

1.5 線粒體膜電位的測定

RAFLS在37℃用濃度1 μg/ml的熒光探針JC-1染色處理10 min，洗滌后用流式細胞儀分析。對JC-1單體，其熒光計被設(shè)置為490 nm激發(fā)波長和390 nm發(fā)射波長。對JC-1總體，熒光計被設(shè)置為525 nm激發(fā)波長和590 nm發(fā)射波長。用FACSCaliburTM流式細胞儀測量熒光效應(yīng)。在健康細胞，JC-1作為一個單體存在于胞質(zhì)中，也作為聚合物在線粒體中積累。在凋亡細胞，C-1只在單體形式存在并產(chǎn)生一個綠色的胞質(zhì)信號。

1.6 Western blot

將2×105細胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中經(jīng)上述處理后收集細胞，分別通過ReadyPrep血清總蛋白提取工具和胞漿、核蛋白提取工具，提取血清總蛋白、胞漿蛋白、核內(nèi)蛋白。通過染色法確定蛋白質(zhì)濃度，蛋白通過10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，在室溫下用5%脫脂牛奶在三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水和Tween 20 (10 mmol/l Tris-Cl [pH 8.0], 150 mmol/l NaCl, 0.05% Tween 20)中阻斷硝酸纖維素膜1 h，然后在4℃下過夜后孵化出主要抗體，如Bcl-2抗體、Bax抗體、cytochrome c抗體、cleaved caspase-9抗體、cleaved caspase-3抗體、p65抗體、IκBα抗體、Akt抗體、pAkt抗體、β-actin抗體，用TBST洗滌后，在室溫下與二抗連同辣根過氧化物酶一起孵育1 h。通過增強化學(xué)發(fā)光檢測裝備和Hyperfilm-ECL試劑(發(fā)射極耦合邏輯)成像，并用Quantity One圖像軟件(由Bio-Rad公司提供)分析信號強度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果用SPSS16.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，用方差分析統(tǒng)計分析兩組以上的平均值。P值<0.05視為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牛蒡甙元對RAFLS的影響

為了檢測牛蒡甙元對RAFLS活性的影響，RAFLS以不同作用時間和不同濃度與牛蒡甙元反應(yīng)，用MTT實驗檢測細胞活性，乳酸脫氫酶檢測牛蒡甙元細胞毒性。如圖1所示，牛蒡甙元抑制了RAFLS的增殖。10 μM的牛蒡甙元處理后12和24 h，活性細胞數(shù)量無明顯影響，但處理后48 h細胞數(shù)量減少了23%(P<0.05)；20 μM牛蒡甙元處理后12 h，細胞生長未受明顯影響，但處理后24和48 h細胞死亡率分別為21%和30%(圖1)。另外，30 μM牛蒡甙元作用12小時即可抑制細胞增殖(P<0.05)。圖1顯示，40～160 μM的牛蒡甙元可以進一步抑制RAFLS增殖，及誘導(dǎo)細胞毒性。本實驗中，我們選用了10～30 μM牛蒡甙元來檢測其對RAFLS的影響，結(jié)果印證了牛蒡甙元對RAFLS增殖的抑制作用。

圖1 牛蒡甙元對RAFLS細胞活性的影響。RAFLS(1×104)接種于96孔板上。細胞分別在有或無牛蒡甙元(0～160 μM)的環(huán)境下培養(yǎng)48 h(圖1A、1B)，或在有或無牛蒡甙元(0～30 μM)環(huán)境下培養(yǎng)0、12、24、48 h后(圖1C)用MTT實驗檢測細胞活性，并用LDH實驗檢測牛蒡甙元誘導(dǎo)的細胞毒性。數(shù)據(jù)用3個獨立實驗的平均值±標準差表示,*P<0.05, **P<0.01。Fig.1 The effects of arctigenin on the cell viability of RAFLSs. RAFLSs (1×104) were seeded into 96-well plates. Cells were cultured in the presence or absence of arctigenin (0-160 μM) for 48 h (A) and (B) or in the presence or absence of arctigenin (0-30 μM) for 0, 12, 24, and 48 h (C). The cell viability was measured by MTT assay. Arctigenin induced cytotoxicity was assessed by LDH assay. Data are shown as mean ±SD (n=3) from three independent experiments.*P<0.05,**P<0.01, relative to control RAFLSs.

2.2 牛蒡甙元誘導(dǎo)RAFLS凋亡

本實驗也同時明確了牛蒡甙元所導(dǎo)致的RAFLS數(shù)量減少，除了抑制細胞增殖外，是否與促進細胞凋亡有關(guān)。實驗用膜細胞凋亡的標志——磷脂酰絲氨酸外部化，來檢測細胞凋亡[21]。如表圖2所示，牛蒡甙元顯著誘導(dǎo)RAFLS凋亡，但10 μM牛蒡甙元誘導(dǎo)作用較弱，早期凋亡比例只有8.61%，而20、30 μM牛蒡甙元誘導(dǎo)作用較強，早期凋亡比例分別為15.16%和22.21%。

圖2 牛蒡甙元誘導(dǎo)RAFLS細胞凋亡。RAFLS用相應(yīng)濃度牛蒡甙元(0～30 μM) 處理48h后用膜聯(lián)蛋白V(annexin V)和碘化丙啶(PI)雙套染，并用流式細胞儀分析凋亡細胞。凋亡細胞是annexin V-陽性而PI-陰性細胞(右下象限)。(圖A)RAFLS用相應(yīng)濃度牛蒡甙元(0-30μM) 處理48h后流式細胞儀結(jié)果。(圖B)顯示RAFLS 的凋亡比例(%)。數(shù)據(jù)用3個獨立實驗的平均值±標準差表示,*P<0.05, ** P<0.01。Fig.2 Arctigenin induces RAFLS apoptosis. RAFLSs were treated with various concentrations of arctigenin (0-30 μM) for 48 h and examined by annexin V/ propidium iodide (PI) double staining. Apoptosis was analyzed using flow cytometry. Apoptotic cells were annexin V-positive and PI-negative cells (lower right quadrant). (A) Representative flow cytometry results for RAFLSs exposed to arctigenin (0-30 μM) for 48 h. (B) The histogram shows the apoptosis ratio (%) of RAFLSs. The data represent three independent experiments.*P<0.05,**P<0.01, relative to control RAFLSs.

2.3 牛蒡甙元介導(dǎo)的RAFLS凋亡途徑——線粒體途徑

為明確牛蒡甙元所激活的凋亡途徑，本實驗用JC-1檢測了RAFLS與牛蒡甙元作用時的線粒體膜電位的變化。圖3A顯示牛蒡甙元在RAFLS凋亡途徑中線粒體膜電位的去極化。在分別與10、20、30 μM牛蒡甙元作用后，RAFLS中低線粒體膜電位的細胞百分比為9.56±1.59%、16.85±1.46%和23.28±2.36%(圖3A)。同樣，Western blot檢測也顯示牛蒡甙元能上調(diào)促凋亡蛋白Bax，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2，增加細胞色素C釋放進入胞質(zhì)，并導(dǎo)致胱解酶-9，胱解酶-3和PARP的裂解(圖3B-D)

2.4 牛蒡甙元抑制NF-κB和Akt信號通路的活性

既往研究表明NF-κB和Akt信號通路的激活在RAFLS凋亡中起重要作用[8-9]，因此本實驗用Western blot檢測牛蒡甙元對上述信號通路激活的影響(圖4)。結(jié)果顯示牛蒡甙元能抑制p65的核轉(zhuǎn)運及IκBα的降解，提示牛蒡甙元降低NF-κB通路的活性(圖4A)。同樣，牛蒡甙元可以使Akt的磷酸化減弱，但對總Akt的表達沒有影響(圖4B)。

3 討論

本研究提示牛蒡甙元能抑制RAFLS的細胞活性并導(dǎo)致細胞的凋亡。實驗中牛蒡甙元處理的RAFLS線粒體膜電位降低，證明牛蒡甙元通過線粒體途徑導(dǎo)致RAFLS凋亡。與此同時，牛蒡甙元能上調(diào)促凋亡蛋白Bax，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2，促進細胞色素C釋放進入胞質(zhì)，并加強胱解酶-9，胱解酶-3和PARP的裂解。此外，牛蒡甙元在RAFLS中減弱NF-κB和Akt信號通路的活性。提示牛蒡甙元通過線粒體途徑，以及抑制NF-κB和Akt信號通路，從而導(dǎo)致RAFLS的凋亡。

RAFLS是RA的發(fā)生和病理過程的主要效應(yīng)細胞之一，其主要特點為快速增殖和凋亡缺陷[22]。本實驗研究了牛蒡甙元對RAFLS的細胞活性及凋亡的影響，研究發(fā)現(xiàn)牛蒡甙元可以降低RAFLS的細胞活性并誘導(dǎo)凋亡。研究結(jié)果提示牛蒡甙元誘導(dǎo)的細胞毒性可能是中藥牛蒡能緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的機制之一。而且，牛蒡甙元已證實可以抑制人類卵巢癌OVCAR3和SKOV3細胞的增殖[23]，提高人類肺癌細胞H460對順鉑的化療敏感性[24],減低膀胱癌細胞T24的細胞活性，誘導(dǎo)肺癌細胞A549、肝癌細胞HepG2和胃癌細KATO III的細胞毒作用[18]?？傊?，上述結(jié)果顯示牛蒡甙元對多種腫瘤或腫瘤樣細胞的增殖有抑制作用。

圖3 牛蒡甙元誘導(dǎo)RAFLS線粒體凋亡。(圖A)RAFLS用相應(yīng)濃度牛蒡甙元(0～30 μM) 處理48 h后進行然后用JC-1染色。并通過FACS分析JC-1平均熒光密度。上圖1分別是3個實驗結(jié)果。下圖1為定量FACS分析。(圖B、C、D)RAFLS用相應(yīng)濃度牛蒡甙元(0～30 μM) 處理48 h后進行Western blot分析。 數(shù)據(jù)用3個獨立實驗的平均值±標準差表示(n=3),*P<0.05, **P<0.01。Fig.3 Arctigenin induces mitochondrial apoptosis of RAFLSs. (A) Cells were treated with indicated concentrations of arctigenin (0-30 μM) for 48 h and stained with JC-1. The mean JC-1 fluorescence intensity was detected by FACS analysis. Images are representative of three independent experiments (upper panel). Quantification of FACS analysis is shown in the lower panel. (B)-(D) Cells were treated with indicated concentrations of arctigenin (0-30 μM) for 48 h and subjected to Western blot analysis. Data are shown as mean±SD (n=3) from three independent experiments. *P<0.05,**P<0.01, relative to control RAFLSs.

圖4 牛蒡甙元抑制RAFLS中的NF-κB和Akt信號通路。RAFLS用相應(yīng)濃度牛蒡甙元(0～30 μM)處理48 h后進行Western blot分析。上圖A顯示p65核轉(zhuǎn)位和IκBα的降解，上圖B顯示Akt的磷酸化。下圖顯示定量Western blot分析。 數(shù)據(jù)用3個獨立實驗的平均值±標準差表示 (n=3),*P<0.05,**P<0.01。Fig.4 Arctigenin inhibits NF-κB and Akt signaling pathways in RAFLSs. RAFLSs were treated with indicated concentrations of arctigenin (0-30 μM) for 48 h and subjected to Western blot analysis. The nuclear translocation of p65 and the degradation of IκBα (A) and the phosphorylation of Akt (B) are shown in the upper panel. Quantification of Western blot analysis is shown in the lower panel. Data are shown as mean±SD (n=3) from three independent experiments. *P<0.05,**P<0.01, relative to control RAFLSs.

內(nèi)在的凋亡通路包括非受體介導(dǎo)的細胞內(nèi)信號，通過降低線粒體膜電位導(dǎo)致細胞凋亡[25]。研究表明線粒體途徑對RAFLS凋亡有重要作用。為了研究牛蒡甙元誘導(dǎo)RAFLS凋亡的機制，本實驗檢測牛蒡甙元處理后RAFLS線粒體膜電位，發(fā)現(xiàn)牛蒡甙元增加了RAFLS中線粒體低電位細胞的比例，故導(dǎo)致線粒體膜電位的減低。此外已有研究證實牛蒡甙元通過線粒體途徑引起膀胱癌細胞T24的凋亡[17]。與此同時，Bcl-2蛋白家族是線粒體凋亡途徑的重要調(diào)節(jié)蛋白，家族成員包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白[26]。RAFLS中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達對線粒體穩(wěn)態(tài)和細胞活性十分重要[7]。牛蒡甙元處理后RAFLS中Bcl-2表達減少，Bax是Bcl-2家族的一種促凋亡蛋白，可以同其他促凋亡因子組成同源或異源二聚體，比如Bak，以破壞線粒體膜的完整性，并導(dǎo)致細胞色素酶C等凋亡因子釋放[27]。本實驗結(jié)果顯示牛蒡甙元能上調(diào)Bax的表達。牛蒡甙元處理的RAFLS中Bcl-2的下調(diào)和Bax的上調(diào)表明Bcl-2和Bax可能參與牛蒡甙元介導(dǎo)的線粒體途徑。此外本實驗觀察到細胞色素C釋放到胞質(zhì)，同樣其細胞色素C的釋放也被顯著增強。一旦細胞色素C釋放，凋亡蛋白酶—血小板激活因子1(Apaf1)、胱解酶-9前體和ATP將受到抑制，并誘導(dǎo)胱解酶-9裂解[28]。裂解和激活的胱解酶-9誘導(dǎo)胱解酶-3的激活，導(dǎo)致細胞骨架、核骨架、基因修復(fù)和細胞周期蛋白的裂解[29]。牛蒡甙元處理后RAFLS中胱解酶-9、胱解酶-3和PARP的裂解增強，揭示了胱解酶-9和胱解酶-3參與了牛蒡甙元介導(dǎo)的凋亡。綜上所述，牛蒡甙元處理后RAFLS通過線粒體途徑誘導(dǎo)凋亡。

RA滑膜細胞中NF-κB的表達和激活已被既往研究所廣泛證實,NF-κB激活后可通過促進RAFLS增殖及抑制凋亡而使滑膜細胞增生[30]。研究證實牛蒡甙元抑制p65的核轉(zhuǎn)位以及IκBα的降解，從而抑制NF-κB的活性，這也顯示抑制NF-κB的活性是牛蒡甙元誘導(dǎo)凋亡的途徑之一。 Akt在RAFLS活性中也有重要作用[9，31]，故本實驗也研究了牛蒡甙元對Akt磷酸化的影響。研究發(fā)現(xiàn)牛蒡甙元減低RAFLS中Akt的磷酸化。所以，牛蒡甙元誘導(dǎo)的凋亡也可能是通過對NF-κB和Akt通路的抑制實現(xiàn)的。

總之，本實驗結(jié)果顯示牛蒡甙元通過線粒體途徑的激活和NF-κB及Akt信號通路的抑制這兩條途徑，實現(xiàn)其對RAFLS的細胞毒性及凋亡的影響。體外實驗表明牛蒡甙元可能是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的新藥劑，然而在進入臨床試驗之前，仍需進行大量檢驗牛蒡甙元抗增殖和抗炎效應(yīng)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動物實驗。另外，對牛蒡甙元同其他經(jīng)典藥物在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎上的協(xié)同、增效或拮抗作用也需要進一步研究。