李周勇，陳云，史玉東，楊嵐，母智深（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司研發(fā)中心，內(nèi)蒙古呼和浩特011500）

云南傳統(tǒng)乳扇制品中優(yōu)質(zhì)乳酸桿菌的篩選與鑒定

李周勇，陳云，史玉東，楊嵐，母智深*
（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司研發(fā)中心，內(nèi)蒙古呼和浩特011500）

從云南省洱源縣鄧川、江尾等地區(qū)多戶白族居民家中共采集到乳扇及其酸湯樣20余個，從中分離到乳桿菌39株。經(jīng)試驗篩選，其中3株具有優(yōu)良的發(fā)酵特性，它們分別是YNEY-15、YNEY-28及YNEY-36。經(jīng)16s rDNA種屬鑒定與API50糖發(fā)酵試驗相結(jié)合，確定YNEY-15為副干酪乳桿菌副干酪亞種3、YNEY-28為植物乳桿菌2、YNEY-36為德氏乳桿菌保加利亞亞種。將3株乳桿菌與實驗室保藏的嗜熱鏈球菌進行組合發(fā)酵，并將產(chǎn)品與市售酸奶進行對照，最終確定YNEY-36為目標(biāo)菌株，具有繼續(xù)研究成為酸奶發(fā)酵劑的可能性。

發(fā)酵特性；乳酸桿菌；分子鑒定；組合發(fā)酵

分離篩選具有優(yōu)良發(fā)酵特性的乳酸菌，開發(fā)出擁有完全自主知識產(chǎn)權(quán)的酸奶發(fā)酵劑對我國乳品工業(yè)的發(fā)展有著十分重要的意義。乳酸菌的產(chǎn)酸、產(chǎn)黏、后酸化及產(chǎn)香等發(fā)酵特性對發(fā)酵乳的口感、風(fēng)味、質(zhì)地和營養(yǎng)價值有著極其重要的作用［1］。近年來，時常有學(xué)者從我國不同地區(qū)的不同傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離得到具有優(yōu)良特性的乳酸菌，并投入到工業(yè)生產(chǎn)中［2］。

云南省地域遼闊，少數(shù)民族眾多，傳統(tǒng)乳制品加工歷史悠久，且制作方法繁多［3］。云南大理洱源地區(qū)的白族居民具有悠久的生產(chǎn)加工和食用乳扇（Dairy Fan）的歷史。乳扇的制作工藝是一個典型的牛乳自然發(fā)酵過程［4］。養(yǎng)牛戶在自產(chǎn)奶中加入前次生產(chǎn)乳扇時留下的酸湯即酸乳清作為自然發(fā)酵劑，待開始凝乳時，加熱至牛奶呈半固體狀態(tài)，制成扇狀或條片狀，在自然條件下風(fēng)干，即為新制成的乳扇［5］。新制乳扇低溫下保質(zhì)期為30天左右，食用時可煎炒或蒸食，風(fēng)味鮮香獨特。試驗對乳扇及其酸湯中的乳桿菌進行了分離鑒定及發(fā)酵特性研究，為乳扇中微生物的研究提供一定的數(shù)據(jù)參考。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試劑

蒙牛原味酸奶：市售；雀巢脫脂乳粉、0.1 mol/L NaOH、甘油、結(jié)晶紫染液、酚酞、乙醇、番紅染液：北京陸橋技術(shù)有限公司。

1.1.2菌株

39株乳桿菌：采自云南省洱源縣鄧川、江尾等地多個白族家庭自制的傳統(tǒng)乳扇及其酸湯，使用超低溫冰箱于-80℃保存；嗜熱鏈球菌MN01：蒙牛研發(fā)中心微生物試驗室保藏。

1.1.3培養(yǎng)基

MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基、12%脫脂乳培養(yǎng)基（115℃、15 min滅菌）、API50CHL糖發(fā)酵培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)有限公司。

1.2試驗設(shè)備

Premium U410超低溫冰箱：美國NBS公司；CP21GⅡ高速冷凍離心機：日立公司；HV-110高壓滅菌鍋：日本Hirayama公司；G560E漩渦混合器：美國SCIENTIFIC Instruments公司；Sartorius pH計：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；CINAC乳品發(fā)酵監(jiān)控儀：法國Alliance；LVDV-Ⅱ旋轉(zhuǎn)式粘度計：美國Brookfield公司；SVE-6A1超凈臺：新加坡ESCO公司。

1.3方法

1.3.1乳桿菌的活化及純化

采用濃度為12%的脫脂乳培養(yǎng)基三代活化凍存的39株乳桿株，并于MRS培養(yǎng)基上劃線接種，37℃條件下培養(yǎng)48 h。挑取單菌落繼續(xù)于MRS培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，革蘭氏染色鏡檢［6］，直到確認為純菌。采用MRS斜面培養(yǎng)基劃線接菌培養(yǎng)，于4℃冰箱內(nèi)保藏備用。

1.3.2優(yōu)良發(fā)酵特性菌株的篩選

酸度測定方法：發(fā)酵乳樣品凝乳后，經(jīng)24 h后熟，采用國標(biāo)規(guī)定的酸堿滴定法測定酸度［7］。

粘度測定方法［8］：采用LVDV-Ⅱ旋轉(zhuǎn)式粘度計做一點式測定，經(jīng)預(yù)試驗探索，最終確定在4℃條件下，使用92號轉(zhuǎn)子，2 r/min轉(zhuǎn)速，測量10 s記數(shù)。重復(fù)3次取算術(shù)平均值，單位為mPa·s。

發(fā)酵特性篩選試驗：

1.3.2.1凝乳時間

活化并純化好的菌株按2%的接菌量接種到12%的脫脂乳內(nèi)，混勻后置于43℃下恒溫發(fā)酵，采用乳品發(fā)酵監(jiān)控儀連續(xù)測定樣品pH，以0.5 h為最小單位，記錄樣品pH降低到4.6及4.6以下所用的時間，即為菌株發(fā)酵脫脂乳的凝乳時間。

1.3.2.2產(chǎn)酸速度［9］

樣品在發(fā)酵初始和15 h時，分別測定pH及酸度。計算每小時pH和酸度的平均變化量即為相應(yīng)菌株的產(chǎn)酸速度。

1.3.2.3后酸化程度［10］

12%的脫脂乳在接菌后的發(fā)酵過程中，定點在15 h和60 h時，分別測定脫脂乳樣品的pH和酸度。計算此45 h內(nèi)平均每小時pH及酸度的變化量，即為菌株發(fā)酵的后酸化程度。

1.3.2.4黏度測定

根據(jù)前期試驗結(jié)果，選擇凝乳時間在6 h內(nèi)、產(chǎn)酸速度快且后酸化程度相對較弱的菌株進行發(fā)酵。至樣品凝乳后，取出破乳，并置于4℃條件下后熟24 h，取出采用一點式測定樣品黏度。

1.3.3菌株鑒定

1.3.3.116s rDNA鑒定［11］

采用美國Promega細菌DNA提取試劑盒進行菌株的DNA提取，并進行PCR擴增。

PCR擴增：體系50 μL，反應(yīng)條件為：95℃/5 min、95℃/30s、50℃/30s、72℃/1min，31個循環(huán)；75℃/5 min。收集PCR產(chǎn)物后，送由天津生物芯片責(zé)任有限公司進行測序并比對結(jié)果。

1.3.3.2API50輔助鑒定［12］

目前，任何一種分子生物學(xué)的方法都無法單獨完成對所有乳酸菌的鑒定。必須與傳統(tǒng)的生化試驗相結(jié)合才能將鑒定結(jié)果做到最好。16s rDNA鑒定也不例外，其結(jié)果有時無法將菌株鑒定至種水平。API50CHL是由含有49種碳水化合物的試驗條組成的簡易型培養(yǎng)基，適于乳酸桿菌和相關(guān)菌的鑒定。采用16s rDNA鑒定的方法，結(jié)合API50的鑒定結(jié)果，能較好地將乳桿菌鑒定至種水平。

1.3.4組合發(fā)酵試驗

將篩選出的發(fā)酵特性較好的乳桿菌與標(biāo)準嗜熱鏈球菌按1∶1的接種比例［13］，3%的接菌總量進行組合發(fā)酵。以市售蒙牛原味酸奶為參照，在樣品后熟24 h后進行各項指標(biāo)測定，綜合評定篩選出的菌株是否具有進一步開發(fā)成為酸奶發(fā)酵劑的可能，菌株組合比例的優(yōu)化在此不做研究。

1.3.4.1酸奶制作工藝［14］

牛奶（雜菌＜5×105CFU/mL）→配料加入8%白砂糖、攪拌1 h→均質(zhì)（20 MPa）→高溫滅菌（95℃，5 min）→冷卻至42℃→接種（接種量3%）→恒溫發(fā)酵（42℃）→破乳后，4℃后熟24 h。

1.3.4.2測定指標(biāo)

黏稠度：粘稠度的測定采用LVDV-Ⅱ旋轉(zhuǎn)式粘度計進行，通過前期預(yù)試驗，選擇62號轉(zhuǎn)子，50 r/min，在4℃條件下，測定10 s計數(shù)。照此方法重復(fù)測量3次取平均值，黏稠度單位為mPa·s。

乳清析出率［15］：取100 g 4℃條件下貯藏的酸奶樣品，倒入含120目鋼絲網(wǎng)的漏斗中靜置2 h，收集下方析出的乳清并稱重。乳清析出率/%=乳清的質(zhì)量（g）/樣品的質(zhì)量（g）×100

感官品評：由蒙牛研發(fā)中心的20名感官品評小組成員，對發(fā)酵乳樣品的總體感官（包括色澤、組織狀態(tài)及滋氣味等）進行評價?？偡指哂?0的，為優(yōu)質(zhì)酸奶；總分介于80至90之間的，為良質(zhì)酸奶；總分低于80的，為次質(zhì)酸奶。酸奶感官評定標(biāo)準如表1所示。

表1　酸奶感官評定標(biāo)準［16］Table 1　Standard of organoleptic investigation for yogurt

2　結(jié)果與分析

2.1乳桿菌分離純化結(jié)果

試驗從云南省洱源縣鄧川、江尾等地區(qū)多戶白族居民家中共采集到乳扇及酸湯樣20余個。通過革蘭氏染色鏡檢及過氧化氫酶試驗，初步確認從中分離到乳酸菌76株，其中含乳酸桿菌39株，根據(jù)菌株來源依次命名為“YNEY-”系列。經(jīng)多次傳代純化以后，采用MRS斜面培養(yǎng)基劃線接菌培養(yǎng)，于4℃冰箱內(nèi)保藏備用。

2.2優(yōu)良發(fā)酵特性菌株篩選結(jié)果

2.2.1菌株產(chǎn)酸試驗結(jié)果

2.2.1.1凝乳時間測定結(jié)果

采用乳品發(fā)酵監(jiān)控儀連續(xù)測定樣品pH，對樣品凝乳時間進行監(jiān)控，測定結(jié)果見表2。

表2　凝乳時間測定結(jié)果Table 2　Measurement results of curd time

續(xù)表2 凝乳時間測定結(jié)果Continue table 2　Measurement results of curd time

由以上試驗結(jié)果可以看出，39株乳桿菌在43℃恒溫箱中發(fā)酵，共有12株菌能在6 h內(nèi)發(fā)酵脫脂乳至凝乳。它們分別是YNEY-01、YNEY-06、YNEY-07、YNEY-10、YNEY-15、YNEY-16、YNEY-17、YNEY-23、YNEY-28、YNEY-31、YNEY-36、YNEY-38，各自凝乳時間從3.5 h～6 h不等。因此，保留這12個乳桿菌進行后續(xù)其它發(fā)酵特性試驗并進行對比評價。

2.2.1.2產(chǎn)酸速度及后酸化測定結(jié)果

在固定時間點測定樣品的pH和酸度，測得不同菌株產(chǎn)酸速度及后酸化結(jié)果如表3所示。

表3　菌種產(chǎn)酸速度及后酸化測定結(jié)果Table 3　Measurement results of speed of strains produce acid and degree of after acidification

由以上試驗結(jié)果可以看出，產(chǎn)酸速度相對較快的乳桿菌共有7株，分別是YNEY-06、YNEY-07、YNEY-15、YNEY-16、YNEY-28、YNEY-31及YNEY-36。通過數(shù)據(jù)分析我們得知，它們的產(chǎn)酸速度和其余菌株差異顯著。其中，YNEY-16和YNEY-31的后酸化度嚴重，酸度變化分別為1.64°T/h和1.84°T/h，與其余5株菌差異顯著。因此，最終選擇產(chǎn)酸速度快且后酸化程度弱的5株菌YNEY-06、YNEY-07、YNEY-15、YNEY-28、YNEY-36進行后續(xù)的黏度試驗。

2.2.2菌株產(chǎn)黏結(jié)果

樣品在4℃環(huán)境下后熟24 h后，黏度測定結(jié)果如表4所示。

表4 菌種黏度試驗結(jié)果Table 4　Results of strains produce viscosity

通過表4可以看出，不同菌株發(fā)酵樣經(jīng)4℃環(huán)境后熟24 h后，黏度差異明顯。YNEY-15、YNEY-28及YNEY-36發(fā)酵樣的黏度較大，分別為6 842 mPa·s、6 514.5 mPa·s和7 674.5 mPa·s，經(jīng)分析與YNEY-06、YNEY-07發(fā)酵樣的黏度值差異顯著。

根據(jù)以上結(jié)果，試驗初步確認篩選出3株具有較好發(fā)酵特性的乳桿菌，分別是YNEY-15、YNEY-28及YNEY-36，它們同時具有較好的產(chǎn)酸和產(chǎn)黏特性。試驗最終選擇這3株菌進行鑒定，并繼續(xù)下一步的混合發(fā)酵試驗。

2.3菌株種屬鑒定結(jié)果

2.3.1菌株16s rDNA分子鑒定結(jié)果

經(jīng)16s rDNA分子鑒定，結(jié)果顯示，YNEY-15與副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）的16s基因序列同源性高達100%，基本可確定為副干酪乳桿菌。YNEY-28的16s基因序列同時與戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）有著相同的99.8%的同源性，暫時無法區(qū)分其種屬。YNEY-36與德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）的16s基因序列有著高達100%的同源性，可基本確定為德氏乳桿菌。

2.3.2菌株API50發(fā)酵結(jié)果

菌株YNEY-15、YNEY-28、YNEY-36與API50 CH試驗條中的49種不同可發(fā)酵碳水化合物反應(yīng)，所得的反應(yīng)圖譜如圖1所示。

根據(jù)圖1中YNEY-15、YNEY-28、YNEY-36的API50反應(yīng)圖譜，與API50反應(yīng)標(biāo)準圖譜對照表［17］進行比對，試驗最終確定YNEY-15為副干酪乳桿菌副干酪亞種3（Lactobacillus paracasei ssp paracasei 3），YNEY-28為植物乳桿菌2（Lactobacillus plantarum 2），YNEY-36為德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus）。

2.3.3菌株組合發(fā)酵試驗結(jié)果

將菌株YNEY-15、YNEY-28、YNEY-36與標(biāo)準嗜熱鏈球菌混合發(fā)酵，試驗結(jié)果見表5。

圖1菌株YNEY-15、YNEY-28及YNEY-36的API50鑒定圖譜Fig.1　API50 identification map of YNEY-15、YNEY-28 and YNEY-36

表5 菌株組合發(fā)酵試驗結(jié)果Table 5　Test results of strains mixed fermentation

由表5可知，3個試驗組酸奶發(fā)酵樣品的乳清析出率均高于參照組，但差異并不顯著。YNEY-36+ MN01發(fā)酵樣品的黏度略高于參照組，但無明顯差異；YNEY-15+MN01和YNEY-28+MN01樣品的黏度均顯著低于參照組，可能是由于試驗菌株和標(biāo)準菌株之間產(chǎn)生了某種產(chǎn)黏拮抗作用。經(jīng)試驗室專業(yè)人員感官品評，YNEY-36+MN01組樣品對參照樣感官最相近，均評定為優(yōu)質(zhì)酸奶。YNEY-15+MN01和YNEY-28+ MN01組樣品感官品質(zhì)得分低于參照組，評定為良質(zhì)酸奶。

根據(jù)上述試驗結(jié)果，綜合考慮樣品的乳清析出率、黏度、總體感官以及今后可能用于發(fā)酵劑開發(fā)，試驗最終確定YNEY-36為目標(biāo)菌株，用于進一步深入研究。

3　結(jié)論

試驗從云南省洱源縣鄧川、江尾等地區(qū)的乳扇及其酸湯樣中共分離到乳桿菌39株。經(jīng)試驗篩選，其中3株具有優(yōu)良的發(fā)酵特性，它們分別是YNEY-15、YNEY-28及YNEY-36。經(jīng)16s rDNA分子鑒定與API50糖發(fā)酵試驗相結(jié)合，確定YNEY-15為副干酪乳桿菌副干酪亞種3（Lactobacillus paracasei ssp paracasei 3），YNEY-28為植物乳桿菌2（Lactobacillus plantarum 2），YNEY-36為德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus）。經(jīng)菌株組合發(fā)酵試驗，最終確定YNEY-36為目標(biāo)菌株，可用于深入研究和工業(yè)發(fā)酵的開發(fā)。

［1］劉屹峰．乳酸菌的生理特性和生物學(xué)功能［J］．丹東紡專學(xué)報，2002，9（2）：6-7

［2］秦虹．甘肅藏區(qū)自然發(fā)酵牦牛乳中乳酸菌的篩選及鑒定［J］．生物工程，2013，19（34）：241-242

［3］劉蔭武，張以芳．云南省乳品中乳桿菌的鑒定［J］．微生物學(xué)通報，1993，20（4）：203-206

［4］吳少雄．云南白族傳統(tǒng)乳扇的研制及營養(yǎng)學(xué)評價［J］．食品工業(yè)科技，2005（3）：170-171

［5］Takano Dr T.Anti-hypertensive activity of fermented dairy products containing biogenic peptides［J］.Antonie van Leeuwenhoek，2002，82 （2）：330-340

［6］郭興華．益生菌基礎(chǔ)與應(yīng)用［M］.北京：北京科學(xué)技術(shù)出版社，2000：1-21

［7］東秀珠，蔡妙英．常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］．9版.北京：科學(xué)出版社，2001：1-42

［8］凌代文．乳酸細菌分類鑒定及實驗方法［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，1999：172-184

［9］金世琳．乳酸菌的科學(xué)與技術(shù)［J］．中國乳品工業(yè)，1998：26（2）：14－15

［10］Chammas G I，Saliba R，Corrieu G，et al.Characterization of lactic acid bacteria isolated from fermented milk［J］．International Journal of Food Microbiology，2006，110（1）：50-62

［11］Riener J，Noci F，Cronin D A，et al.The effect of thermosonication of milk yoghurt gels during fermentation［J］．Food Chemistry，2009，114 （2）：800-906

［12］劉麗波，李春，孟祥晨，等．1株高產(chǎn)EPS嗜熱鏈球菌的篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化［J］．中國食品學(xué)報，2007，7（3）：64-68

［13］劉景，張雪洪，王萌榆，等.酸奶保質(zhì)期內(nèi)風(fēng)味物質(zhì)與風(fēng)味變化的研究［J］.食品工業(yè)科技，2011，32（7）：152-156

［14］Mathara J M，Schillinger U，Kutima P M，et al.Isoaltion identification and characterization if the dominant microorganisms of kule naoto the maasai traditional fermented milk in Kenya［J］.International Journal of Food Microbiology，2004，94（4）：267-277

［15］韓育梅，孫吉.馬鈴薯丁二酸酯化交聯(lián)淀粉在攪拌型酸奶中的應(yīng)用研究［J］.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，30（1）：149-153

［16］Joseph Yun，David M，Barbano，et al．Mozzarella cheese：Impact of coagulant of coagulant type on chemical composition and proteolysis ［J］．Dairy sci，1993，76（3）：3633-3670

［17］馬麗婭，鄭華，蘇建軍，等.新疆野生優(yōu)良乳酸菌的分離篩選及鑒定［J］．中國乳品工業(yè)，2010，38（8）：11-14

Screening and Identification for Lactobacillus from Traditional Dairy Fan Products in Yunnan Province

LI Zhou-yong，CHEN Yun，SHI Yu-dong，YANG Lan，MU Zhi-shen*
（Inner Mongolia Mengniu Dairy Industry（Group）Co.Ltd.R&D Center，Hohhot 011500，Inner Mongolia，China）

Test isolated 39 lactobacillus strains from 20 traditional dairy fan products and sour soup which made by several herding families in Eryuan league of Yunnan province.By test screening，3 lactobacillus with good fermentation characteristics were got，they are YNEY-15，YNEY-28 and YNEY-36.By 16 s rDNA appraisal and API50 sugar fermentation tests，determine the YNEY-15 for Lactobacillus paracasei ssp paracasei 3，YNEY-28 for lactobacillus plantarum 2 and the YNEY-36 for Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus.The mixed fermentation experiment was carried out with three lactobacillus and streptococcus thermophilus，and compared with commercially available yogurt，determine the YNEY-36 for target strains eventually，as the possibility become for yoghurt starter cultures.

fermentation characteristics；lactobacillus；molecular identification；mixed fermentation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.046

李周勇（1987—），男（漢），初級工程師，碩士研究生，研究方向：乳制品研究與開發(fā)。
*

母智深，副教授，主要從事乳品營養(yǎng)與工程方面的研究。

2015-04-07