劉　珂　杜景霞　阮林海

(河南科技大學第一附屬醫(yī)院血液科，洛陽471003)

?

急性白血病患者MSC的免疫原性及抑制異體T淋巴細胞增殖功能和機制研究

劉珂杜景霞①阮林海

(河南科技大學第一附屬醫(yī)院血液科，洛陽471003)

[摘要]目的：研究分析急性白血病患者的骨髓間充質細胞(MSC)對異體T淋巴細胞增殖功能的抑制作用及其作用機制。方法：選取30例確診急性髓細胞白血病(AML組)患者及30例急性淋巴細胞白血病(ALL組)，同期健康研究對象30例(健康組)，分離培養(yǎng)三組研究對象的MSC細胞，測定三組MSC細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子的表達水平，采用Transwell培養(yǎng)檢測三組MSC對T淋巴細胞增殖的抑制作用，采用混合淋巴細胞方法檢測MSC對異體T淋巴細胞增殖的抑制作用。結果：AML組上清液中的TGF-β1、HGF水平顯著低于ALL組和健康組(P<0.05)，ALL組的IL-11水平顯著高于AML組、健康組(P<0.05)；三組間MSC上清液中IL-6的水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。AML、ALL、健康組的MSC細胞分泌的細胞因子對T淋巴細胞增殖仍然具有顯著的抑制作用，接觸性共培養(yǎng)和不直接接觸的情況下對T淋巴細胞增殖的抑制作用差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在加入MSC后，三組的T細胞增殖作用受到顯著的抑制，在加入抗TGF-β1抗體、抗HGF抗體后T細胞增殖抑制作用較單純加入MSC時明顯降低(P<0.05)。 結論：急性白血病患者的MSC對異體T淋巴細胞增殖具有抑制作用，其作用原理可能與細胞因子的分泌有關。

[關鍵詞]急性白血病；骨髓間充質細胞；異體；T淋巴細胞；增殖；抑制作用

骨髓間充質細胞(Mesenchymal cells,MSC)為具有潛在干細胞分化成熟能力的骨髓細胞，在定向誘導分化的情況下可以分化為骨、軟骨、筋膜以及其他間質成分。MSC在骨髓中具有調節(jié)造血細胞分化、穩(wěn)定造血速度以及原始早幼或者晚幼細胞的功能，對于正常的骨髓造血具有較為重要的意義。近年來，相關研究證實，MSC能夠增加機體免疫耐受、抑制T細胞介導的異體源性免疫反應[1,2]，其機制可能與分泌不同細胞調節(jié)因子有關，但具體機制仍然不清。迄今為止對于骨髓異常造血情況下MSC能夠參與免疫耐受的調節(jié)以及其機制的研究較少。急性白血病主要包括急性髓性、淋巴細胞性以及粒細胞性白血病，對于不同白血病的根治性治療主要依靠異體骨髓移植。白血病異常病理造血情況下的MSC的免疫耐受的機制研究有利于延長骨髓抑制后抑制免疫排斥反應，具有廣闊的臨床應用前景[3]。本研究重在探討MSC對異體T淋巴細胞增殖功能的抑制作用及其作用機制。

1資料與方法

1.1一般資料選取30例確診急性髓細胞白血病(AML組)患者及30例急性淋巴細胞白血病(ALL組)，同期健康研究對象30例(健康組)，AML組30例，其中男18例、女12例，年齡21～58歲，平均年齡(35.4±11.6)歲，依據形態(tài)學、細胞學及免疫學分類標準：M1 5例、M2 9例、M3 8例、M4 3例、M5 5例。ALL組30例，其中男17例、女13例，年齡19～55歲，平均年齡(33.6±10.9)歲，其中L1 11例、L2 19例。健康組30例，其中男15例、女15例，年齡19～56歲，平均年齡(35.2±12.0)歲。

1.2實驗方法

1.2.1MSC分離培養(yǎng)方法自髂后上棘抽取骨髓，加入淋巴細胞分離液，1 000 r/min離心20 min，獲取全部單個核細胞，計數(shù)后接種于含40%MCDB、20 g/L血清的DF2培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后換液，去除未貼壁細胞。當細胞達到80%融合時，應用胰酶/EDTA消化后，按照1∶3的比例傳代。采用PRIM含10%的胎牛血清的培養(yǎng)基，加入尼龍柱內后采用培養(yǎng)基沖出非黏附細胞為T淋巴細胞，將MSC注入96孔板內，加入2×108L-1的T淋巴細胞100 μl，給予植物血凝素刺激T淋巴細胞轉化。

1.2.2MSC上清液中細胞因子測定應用轉化生長因子β1(TGF-β1)、肝細胞生長因子(HGF)、白細胞介素11(IL-11)和IL-6酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測試劑盒，按照試劑盒說明書檢測原代AML、不同代數(shù)ALL和正常成人骨髓MSC培養(yǎng)上清中上述細胞因子的水平。

2結果

2.1MSC的培養(yǎng)情況經過2周培養(yǎng)，AML組、ALL組及健康組均成功分離出MSC細胞，在倒置相差顯微鏡下觀察，MSC細胞表現(xiàn)為梭形，均平行排列呈漩渦樣生長，核仁明顯，圖1分別為AML組、ALL組及健康組的MSC培養(yǎng)后的MSC貼壁生長效果圖。

2.2三組MSC上清液中細胞因子分泌情況AML組上清液中的TGF-β1、HGF水平顯著低于ALL組和健康組(P<0.05)，ALL組的IL-11水平顯著高于AML組、健康組(P<0.05)；三組間MSC上清液中IL-6的水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。表1。

2.3MSC對T淋巴細胞增殖的抑制作用觀察在不同數(shù)量的MSC細胞下，三組MSC對T淋巴細胞增殖的抑制作用見表2，AML組、ALL組及健康組三組的在MSC細胞數(shù)量逐漸增加的情況下，對T淋巴細胞的增殖抑制作用均逐漸增強，ALL組MSC對T淋巴細胞的增殖抑制作用與健康組基本一致，AML組MSC對T淋巴細胞增殖的抑制作用顯著弱于ALL組和健康組(P<0.05)。

2.4MSC分泌細胞因子對T淋巴細胞增殖的抑制作用觀察在Transwell培養(yǎng)的情況下，MSC細胞不能與T淋巴細胞進行直接接觸，但是AML、ALL、健康組的MSC細胞分泌的細胞因子對T淋巴細胞增殖仍然具有顯著的抑制作用，接觸性共培養(yǎng)和不直接接觸的情況下對T淋巴細胞增殖的抑制作用差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,表3)。

2.5MSC細胞因子抗體對T淋巴細胞增殖的抑制作用觀察在未加入MSC及細胞因子抗體的情況下，AML、ALL、健康組T細胞增殖作用差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，在加入MSC后，三組的T細胞增殖作用受到顯著的抑制，在加入抗TGF-β1抗體、抗HGF抗體后T細胞增殖抑制作用較單純加入MSC時明顯降低(P<0.05，表4)。

圖1　MSC培養(yǎng)情況(×200)Fig.1　MSC culture(×200)Note: A.AML group；B.ALL group；C.Health group.

GroupsnTGF-β1IL-6IL-11HGFAMLgroup30358.62±36.9754.82±13.0878.14±11.082)220.74±65.17ALLgroup30568.91±55.481)59.17±14.05102.95±25.61650.18±114.911)Healthgroup30580.35±72.611)65.27±17.0388.25±17.052)641.87±120.861)

Note：Compared with AML group，1)P<0.05；compared with ALL group，2)P<0.05.

GroupsNoMSCgroup0.5×1041.0×1042.0×1045.0×104AMLgroup4.02±0.713.58±0.602.89±0.622)1.80±0.592)1.15±0.202)ALLgroup3.84±0.691.96±0.321)1.58±0.301)2)0.92±0.211)2)0.21±0.111)2)Healthgrou3.92±0.772.01±0.371)1.64±0.331)2)1.00±0.231)2)0.25±0.121)2)

Note：Compared with AML group，1)P<0.05；comparison with the the number of MSC cells was 0.5×104，2)P<0.05.

TranswellcultureNoMSCgroupAMLgroupALLgroupHealthgroupDirectcontact4.06±0.510.89±0.201)1.96±0.251)1.25±0.161)Contactcoculture4.12±0.600.91±0.221)1.92±0.231)1.20±0.191)t0.4170.3680.6451.12P>0.05>0.05>0.05>0.05

Note：Compared with the case without MSC，1)P<0.05.

GroupsNoMSCMSCMSC+antiIL-11antibodyMSC+antiIL-6antibodyMSC+antiTGF-β1MSC+antiHGFantibodyAMLgroup4.06±0.641.12±0.201)1.18±0.191)1.16±0.201)2.91±0.411)2)3.42±0.451)2)ALLgroup4.11±0.811.01±0.191)1.14±0.171)1.10±0.211)3.02±0.471)2)3.35±0.511)2)Healthgroup4.14±0.751.20±0.221)1.23±0.241)1.25±0.241)2.98±0.451)2)3.47±0.481)2)

Note：Compared with the case without MSC，1)P<0.05；compared with the addition of MSC，2)P<0.05.

3討論

急性白血病患者骨髓造血異常，過度非正常白血病造血不僅導致機體參與抗感染等過程的細胞數(shù)量減少。同時其對于正常血細胞、血小板等造血功能的抑制，往往造成全血細胞減少的臨床癥狀。重癥白血病患者可以因重度感染、顱內出血以及繼發(fā)性彌漫性血管內出血而死亡，異體骨髓移植為其治愈的唯一方式。抑制物抗宿主病是困擾骨髓移植的主要并發(fā)癥，嚴重的抗宿主病將導致患者出現(xiàn)急性血管型或者細胞型免疫反應[4]，威脅白血病患者的生命安全。如何誘導免疫抑制、減輕抑制排斥反應是血液科醫(yī)生關注的重要課題。雖然部分免疫抑制劑已廣泛應用于骨髓移植后抗免疫排斥治療，但其長期免疫誘導抑制的能力較弱，部分骨髓移植患者術后6個月之后出現(xiàn)了明顯的排斥反應[5]。MSC不僅具有潛在干細胞分化功能，其對于造血細胞的免疫抑制、T淋巴細胞的共刺激抗原分子的沉默等作用[6]，還可在骨髓移植的同時進行MSC移植治療[7,8]。但其治療效果尚無大規(guī)模研究證實。病理狀態(tài)下MSC對于淋巴細胞介導免疫的抑制作用以及相關機制的研究，對于骨髓移植具有極為重要的臨床應用前景。

AML組、ALL組及健康組均成功分離出MSC細胞，在倒置相差顯微鏡下觀察，MSC細胞表現(xiàn)為梭形，均平行排列呈漩渦樣生長，細胞結構較為清晰，細胞核以及細胞膜周邊膜性結構較豐富，提示了MSC的典型形態(tài)。三組分離培養(yǎng)的MSC細胞均能夠貼壁生長，細胞增殖活性較高，在無造血細胞存在的情況下，可以呈現(xiàn)集落式生長。將自體骨髓MSC聯(lián)合外周血造血干細胞移植，自體MSC可以促進受者造血，更為重要的是MSC對于移植物排斥反應的抑制作用，但并未對于不同移植數(shù)量級的MSC細胞進行細胞數(shù)量依賴性分析[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，AML組、ALL組及健康組均成功分離出MSC細胞對于淋巴細胞增殖均具有明顯抑制作用，在MSC數(shù)量逐漸增多的情況下，T淋巴細胞的增殖抑制作用均逐漸增強，提示了MSC對于淋巴細胞介導的免疫應答的誘導抑制作用。有趣的是，AML組MSC對T淋巴細胞增殖的抑制作用較弱，AML骨髓MSC不表達HLA-DR和共刺激分子CD80、CD86和CIM0，其對于免疫誘導的抑制作用的下降可能與第一類以及第二類T細胞信號系統(tǒng)的免疫原性的下降有關[10]。骨髓增生極度活躍或明顯活躍，骨髓中原始粒細胞占30%～89%(非紅系)，早幼粒、中幼粒和成熟粒細胞比例較高，該病理特征的異常造血可能導致的免疫調控的病理改變[11]，但結論需要進一步證實。本研究發(fā)現(xiàn)，在Transwell培養(yǎng)的情況下，MSC細胞不能與T淋巴細胞進行直接接觸，在接觸以及不接觸的情況下，三組MSC均具有明顯的T淋巴細胞抑制作用，提示了MSC可能通過分泌細胞因子發(fā)揮抑制T淋巴細胞增殖作用的，如Song等[12]學者認為，MSC對于淋巴細胞增殖的抑制作用與TGF-β1有關。為了證實這一觀點，本次研究加入抗TGF-β1抗體、抗HGF抗體后T細胞增殖抑制作用得到有效的逆轉作用，表明MSC通過細胞因子發(fā)揮免疫調節(jié)作用，而TGF-β1和HGF是MSC發(fā)揮免疫抑制作用的主要分泌因子。

綜上所述，急性白血病患者的MSC對異體T淋巴細胞增殖具有抑制作用，AML、ALL白血病患者骨髓MSC對于免疫耐受的誘導作用具有MSC細胞數(shù)量的依賴性，同時病理狀態(tài)下MSC對于淋巴細胞的增殖抑制作用可能與TGF-β1和HGF等細胞因子的分泌有關。臨床上對于符合骨髓移植治療的白血病患者，在骨髓抑制的同時進行MSC細胞體外培養(yǎng)移植，可以誘導機體免疫耐受，而TGF-β1和HGF等細胞因子的外源性加入可能進一步加強MSC的抗免疫宿主病的作用，降低機體免疫排斥反應，具有較為廣闊的臨床應用前景，但需要大量以及長期的臨床前期試驗和論證。

參考文獻：

[1]馬玉花,鄒亞偉,徐清云,等.肝細胞生長因子在白血病兒童中的表達[J].廣東醫(yī)學,2014,33(21):3322-3325.

[2]趙智剛,孫立,張翼鷟,等.骨髓增生異常綜合征和急性髓細胞白血病骨髓間充質干細胞的病理學特征[J].臨床血液學雜志,2010,22(6):671-674.

[3]馮丹琴,黃波,劉靜,等.慢性粒細胞白血病患者骨髓間充質干細胞的分離培養(yǎng)及成脂分化[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2012,24(1):7-9.

[4]李小龍,趙厚嶺,劉文華,等.TGF-β1對 rhBMP-2促進大鼠骨髓間充質干細胞增殖分化的影響[J].濰坊醫(yī)學院學報,2015,33(1):42-44.

[5]王昭霞,鄒亞偉,李敏敏,等.急性淋巴細胞白血病患兒骨髓間充質干細胞對K562和K562/AO_2細胞耐藥的影響[J].實用兒科臨床雜志,2012,45(19):1507-1510.

[6]李海瑞,鄭棟,江燦,等.大鼠骨髓間充質干細胞增殖及定向分化能力的增齡性變化[J].中國組織工程研究,2015,25(1):18-23.

[7]朱希山,宋雨光,張紅梅,等.慢性粒細胞白血病患者骨髓間充質干細胞的生物學特性及其造血調控[J].中國組織工程研究與臨床康復,2010,42(45):8377-8381.

[8]王明,張赫,楊生,等.鈦納米管及不同化學誘導條件對骨髓間充質干細胞成骨分化的影響[J].重慶醫(yī)科大學學報,2015,22(2):191-196.

[9]Bozok Cetintas V,Aktug H,Oltulu F,etal.The effects of mesenchymal stem cells on lymphoblastic leukemia cell proliferation[J].J BUON,2014,19(4):1006-1017.

[10]Entrena A,Varas A,Vázquez M,etal.Mesenchymal stem cells derived from low risk acute lymphoblastic leukemia patients promote NK cell antitumor activity[J].Cancer Lett,2015,363(2):156-165.

[11]Yang GC,Xu YH,Chen HX,etal.Acute lymphoblastic leukemia cells inhibit the differentiation of bone mesenchymal stem cells into osteoblasts in vitro by activating notch signaling[J].Stem Cells Int,2015,34(4):162-165.

[12]Song N,Gao L,Qiu H,etal.Mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells inhibit leukemia/lymphoma cell proliferation in vitro and in a mouse model of allogeneic bone marrow transplant[J].Int J Mol Med,2015,36(1):139-149.

[收稿2015-10-09修回2015-11-18]

(編輯張曉舟)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.028

作者簡介：劉珂(1976年-)，女，主治醫(yī)師，主要從事血液學方面的研究，E-mail：lllkkk_1976@sina.com。

中圖分類號R733.71

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)07-1056-04

Study on immune function and mechanism of T lymphocyte proliferation in patients with acute leukemia MSC

LIU Ke，DU Jing-Xia，RUAN Lin-Hai.

Department of Hematology，the First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China

[Abstract]Objective:To study the inhibitory effect of bone marrow mesenchymal stem cells (MSC) on the proliferation of allogeneic T lymphocytes in patients with acute leukemia and its mechanism.Methods: 30 patients with acute myeloid leukemia (AML),30 patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL),and 30 healthy subjects (healthy group) were selected.MSC cells were isolated and cultured in three groups.The expression level of MSC cells in three groups were determined by MSC assay.The inhibitory effect of MSC on the proliferation of T cells was detected by Transwell assay.Results: AML group supernatant TGF-β1,HGF levels were significantly lower than the ALL group and the healthy group (P<0.05),significantly higher than the levels of IL-11 ALL group of AML group,healthy group (P<0.05); three groups MSC supernatant IL-6 levels difference was not statistically significant (P> 0.05).AML,ALL,MSC cells secrete cytokines healthy group of T lymphocyte proliferation still had a significant inhibitory effect,inhibition of differences in the case of contact and not in direct contact co-culture of T lymphocyte proliferation was not statistically significant (P> 0.05); after joining the MSC,T cell proliferation in the three groups was significantly inhibited upon addition of anti-TGF-β1 antibody,anti-HGF antibody after T cell proliferation effective than a simple reversal join MSC (P<0.05).Conclusion: MSC for acute leukemia patients inhibit allogeneic T lymphocyte proliferation,functioning principle may be related to the secretion of cytokines.

[Key words]Acute leukemia;Bone marrow mesenchymal stem cells;Allogeneic;T lymphocyte;Proliferation;Inhibition

①河南科技大學，洛陽471003。