于 莉，吳 璇，汪旻旻，黃升海

◇經(jīng)驗(yàn)與體會(huì)◇

呼吸道合胞病毒空斑形成實(shí)驗(yàn)的條件優(yōu)化

于 莉，吳 璇，汪旻旻，黃升海

采用空斑形成實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定呼吸道合胞病毒（RSV）的滴度，加入覆蓋層倒置培養(yǎng)27、30、34、40 h后經(jīng)固定染色、剔除覆蓋層后，可見(jiàn)清晰透明空斑，邊緣清晰、形態(tài)均為圓形或類(lèi)圓形，空斑直徑分別為1、1.5、3、5 mm左右。加入覆蓋層后培養(yǎng)病毒的時(shí)間可以影響RSV最終所形成的空斑大小，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)空斑逐漸增大，在30～34 h所形成的空斑大小最佳，易于計(jì)數(shù)。病毒的稀釋度也會(huì)影響空斑最終形成的數(shù)量，且隨著稀釋度的增加，空斑數(shù)量逐漸減少。關(guān)鍵詞 呼吸道合胞病毒；空斑形成實(shí)驗(yàn)；甲醛-結(jié)晶紫

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-3-8 8：29：02 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.064.htm l

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）被認(rèn)為是引起世界范圍內(nèi)嬰幼兒嚴(yán)重下呼吸道感染最常見(jiàn)的病原體，也是引起免疫力低下患者和老年人下呼吸道感染的病原體之一［1-3］。因此RSV越來(lái)越受到重視，而對(duì)RSV致病機(jī)制的研究及抗RSV藥物和疫苗的研發(fā)均需對(duì)RSV的滴度進(jìn)行定量測(cè)定。國(guó)內(nèi)外通常采用空斑計(jì)數(shù)對(duì)病毒進(jìn)行滴度檢測(cè)。該實(shí)驗(yàn)采用甲醛-結(jié)晶紫空斑法在原有的空斑形成實(shí)驗(yàn)方法上［4-5］，通過(guò)對(duì)營(yíng)養(yǎng)覆蓋物培養(yǎng)時(shí)間的改變，就RSV在人喉癌上皮細(xì)胞（human larynx carcinoma epithelial cell，Hep-2）上在培養(yǎng)時(shí)間及病毒稀釋度改變的條件下所形成空斑的大小及數(shù)量進(jìn)行研究，進(jìn)而進(jìn)行條件優(yōu)化。擬達(dá)到相對(duì)較好的實(shí)驗(yàn)條件，能夠更精確地對(duì)病毒滴度進(jìn)行檢測(cè)，并且重復(fù)性相對(duì)較好，為臨床病程的判斷提供更準(zhǔn)確的參考信息。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及病毒 Hep-2細(xì)胞為人喉癌上皮細(xì)胞，RSV為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株Long株，以上均由安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室保存。

1.2 主要試劑 新生牛血清（杭州四季青公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；瓊脂糖（上海生工生物工程股份有限公司）；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（中國(guó)Nest Biotechnology公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及病毒增殖 用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞，長(zhǎng)至80%時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代；將細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～70%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，取10 m l RSV加入Hep-2細(xì)胞中，37℃、5%CO2條件下孵育，15～30 min搖晃1次；2 h后，棄去上清液，加入含3%新生牛血清的DMEM病毒維持液10 ml，37℃、5% CO2條件下孵育；至Hep-2細(xì)胞典型融合病變達(dá)90%～100%時(shí)，將細(xì)胞刮下，4℃、3 000 r/min離心10 min，收集上清液分裝后凍于-80℃或液氮罐中備用。

1.4 空斑形成實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)過(guò)程：①以5.0×105的密度接種Hep-2細(xì)胞于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使其24 h內(nèi)長(zhǎng)成單層；②在冰盤(pán)上用DMEM將RSV作10倍連續(xù)系列稀釋?zhuān)▓D1），即在一系列2 ml的EP管中先加入1.8 m l DMEM，取0.2ml RSV加入第一支Ep管中，充分混勻后的該RSV病毒懸液的稀釋度為10-1，取混合后的0.2 ml病毒懸液加入第二支EP管中，該管中的病毒稀釋度為10-2，依此類(lèi)推作系列稀釋?zhuān)瑒t得到連續(xù)10倍稀釋的病毒懸液。隨著稀釋度的增加，病毒的毒力逐漸減弱；③棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中各孔中的培養(yǎng)液，取稀釋度為10-7～10-11的病毒懸液1 ml加入培養(yǎng)板中，剩下1孔不加病毒僅加入1 ml的DMEM作為正常對(duì)照，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中吸附3 h，期間每15～30 min搖動(dòng)1次，以保證病毒分布均勻；④棄去各孔中的病毒液，用PBS輕輕洗滌3次。每孔加入3 ml的營(yíng)養(yǎng)瓊脂覆蓋層（含5%新生牛血清的 2×DMEM與1%瓊脂糖等體積混勻），新生牛血清的終濃度為2.5%，瓊脂糖為0.5%。室溫下水平放置15 min使其凝固；⑤置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。分別培養(yǎng)27、30、34、40 h后取出培養(yǎng)板，每孔加入2 ml含甲醛的結(jié)晶紫固定過(guò)夜。次日剔除覆蓋層，用自來(lái)水輕輕沖洗后即可觀察到清晰的空斑。

圖1 RSV作10倍連續(xù)系列稀釋

2 結(jié)果

加入營(yíng)養(yǎng)瓊脂覆蓋層分別倒置培養(yǎng)27、30、34、40 h后，每孔加入2 ml含4%甲醛的結(jié)晶紫溶液固定染色。結(jié)果可見(jiàn)，加入覆蓋層后培養(yǎng)27 h，進(jìn)行固定染色過(guò)夜，剔除覆蓋層，用自來(lái)水輕輕沖洗后可觀察到直徑約1 mm、形態(tài)為圓形或者類(lèi)圓形的空斑，邊緣整齊，清晰透明；且隨著病毒稀釋度的增加，空斑的數(shù)量逐漸減少。該培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)所形成的空斑面積較小，不易于計(jì)數(shù)（圖2）。培養(yǎng)30 h及34 h的細(xì)胞培養(yǎng)板剔除覆蓋層后，可觀察到比27 h的空斑略大，直徑分別約為1.5和3 mm，該時(shí)間段內(nèi)形成的空斑較易于觀察計(jì)數(shù)，且空斑的數(shù)量亦隨著病毒的稀釋逐漸減少（圖3～4）。而培養(yǎng)40 h后則觀察到直徑為5 mm左右的大空斑，不易于計(jì)數(shù)，空斑形成的數(shù)量與病毒的稀釋程度呈反比（圖5）。

圖2 加入覆蓋層倒置培養(yǎng)27 h后經(jīng)固定染色、剔除覆蓋層所形成的空斑A：空白對(duì)照；B～F：病毒稀釋度分別為　10-7～10-11

3 討論

RSV是嬰幼兒細(xì)支氣管炎和病毒性肺炎的最重要原因，在嬰幼兒中有較高的發(fā)病率及死亡率，而且可以引起中耳炎及呼吸暫停等一系列疾?。?，6］。在全球不同地區(qū)統(tǒng)計(jì)每年因RSV感染死亡的人數(shù)高達(dá)16萬(wàn)，而因并發(fā)RSV感染死亡的人數(shù)近60萬(wàn)［7］。因此，檢測(cè)、預(yù)防和治療RSV感染的研究非常重要。而在進(jìn)行上述RSV相關(guān)基礎(chǔ)研究時(shí)，首先要對(duì)RSV病毒的滴定進(jìn)行測(cè)定。

圖3 加入覆蓋層倒置培養(yǎng)30 h后經(jīng)固定染色、剔除覆蓋層所形成的空斑A：空白對(duì)照；B～F：病毒稀釋度分別為　10-7～10-11

圖4 加入覆蓋層倒置培養(yǎng)34 h后經(jīng)固定染色、剔除覆蓋層所形成的空斑A：空白對(duì)照；B～F：病毒稀釋度分別為　10-7～10-11

由于RSV是RNA病毒，屬于副黏病毒屬，對(duì)其進(jìn)行病毒滴度的測(cè)定比DNA病毒更難。此前也有學(xué)者用免疫法測(cè)定 RSV滴度，但是一旦RSV融合（F）蛋白發(fā)生突變，抗F蛋白的單克隆抗體就會(huì)失效，從而導(dǎo)致空斑實(shí)驗(yàn)失?。?］。而傳統(tǒng)的病毒空斑技術(shù)操作較繁雜，影響病毒空斑形成的因素較多，且用中性紅染色的標(biāo)本不能固定保存［9］。針對(duì)這些問(wèn)題本研究采用甲醛-結(jié)晶紫空斑法對(duì)RSV進(jìn)行空斑形成實(shí)驗(yàn)的研究。甲醛-結(jié)晶紫空斑法是利用病毒感染細(xì)胞后形成一個(gè)局限性的病變細(xì)胞區(qū)，由于結(jié)晶紫是堿性染料，可以與細(xì)胞核中的核酸結(jié)合，把核染成紫色。正常細(xì)胞經(jīng)結(jié)晶紫染色后呈紫色，經(jīng)甲醛作用固定于培養(yǎng)板上。而病毒感染所致病變的細(xì)胞則不能固定，被自來(lái)水沖掉形成空斑，肉眼可見(jiàn)圓形或類(lèi)圓形斑。理論上一個(gè)最初感染細(xì)胞的病毒顆粒形成一個(gè)空斑，經(jīng)結(jié)晶紫染色后即可直接肉眼觀察、計(jì)數(shù)空斑，精確測(cè)定病毒感染單位量［10］。

圖5 加入覆蓋層倒置培養(yǎng)40 h后經(jīng)固定染色、剔除覆蓋層所形成的空斑A：空白對(duì)照；B～F：病毒稀釋度分別為　10-7～10-11

應(yīng)用此法測(cè)定RSV滴度簡(jiǎn)便易行、耗時(shí)短、成本低，能準(zhǔn)確測(cè)定病毒的滴度，還可保留實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并且重復(fù)性好，具有較高的穩(wěn)定性［9］。但是影響空斑形成的因素有很多，本研究主要檢測(cè)了在其他條件不變的情況下，培養(yǎng)時(shí)間及病毒毒力變化對(duì)空斑大小及其數(shù)量的影響。研究顯示，RSV空斑形成實(shí)驗(yàn)中，感染RSV后加入覆蓋層培養(yǎng)病毒的時(shí)間可以影響RSV最終所形成的空斑大小，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)空斑逐漸增大。在加入覆蓋層后培養(yǎng)感染RSV的Hep-2細(xì)胞30～34 h，得到的空斑清晰且易于計(jì)數(shù)；而且隨著病毒的毒力減弱，空斑的數(shù)量逐漸減少。該條件下得到的空斑敏感性更高、定量更精確，且重復(fù)性好，能夠?yàn)榕R床病程的判斷提供更準(zhǔn)確的參考信息，更好地為臨床服務(wù)。

本實(shí)驗(yàn)中只對(duì)RSV病毒的空斑形成實(shí)驗(yàn)做了條件優(yōu)化，沒(méi)有以其他的病毒作為對(duì)照；另外也只做了不同培養(yǎng)時(shí)間和病毒稀釋度這兩個(gè)方面的影響因素，對(duì)瓊脂糖濃度等條件并沒(méi)有進(jìn)行探討，有待進(jìn)一步完善。

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Condition optim ization for plaque form ing test of respiratory syncytial virus

Yu Li，Wu Xuan，Wang Minmin，et al
（Dept of Microbiology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

Respiratory syncytial virus（RSV）titerswere investigated by plaque formation assay.Clarity and boundary clear plaques could be visible after fixed dyeing and removed covers after joining covering cultivation 27，30，34，and 40 h.Round or class round plaque morphologies and plaques in 1，1.5，3 and 5 mm diameter were formed in different layer inversion training time，respectively.Plaques size which was formed by RSV could be affected by virus incubation time after added layer and plaques dimensionswere increased gradually with the time extending in the plaque formation assay for RSV.The plaques were easy to be counted during 30～34 h in which the best size and number ofplaques could be detected.The number of plaques formed eventually could also be affected by the dilution of virus and with the increase of dilution degrees，the reduction of plaque quantitieswas observed. Key words respiratory syncytial viruses；plaque forming assay；formaldehyde-crystal violet

R 373.14

A

1000-1492（2016）04-0595-04

2016-01-18接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81371797）；安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：KJ2012A152）

安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，合肥 230032作者簡(jiǎn)介：于 莉，女，碩士研究生；
黃升海，男，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：huangshh68@aliyun.com