李光耀，莢衛(wèi)東，程 亞，盛須仁

CNTN-1表達在肝癌術后早期復發(fā)中的預測價值

李光耀，莢衛(wèi)東，程 亞，盛須仁

目的 探討神經黏附分子接觸蛋白-1（CNTN-1）在原發(fā)性肝細胞性肝癌（肝癌）根治術后早期復發(fā)中的預測價值。方法 應用免疫組化法研究90例肝癌組織和癌旁組組中CNTN-1的表達。分析CNTN-1與肝癌臨床病理特征及術后早期復發(fā)的關系。結果 CNTN-1在肝癌組織中表達明顯高于癌旁組織（P＜0.01）。CNTN-1表達與腫瘤直徑、有無完整包膜和TNM分期相關（P＜0.05）。單因素Logistic回歸分析表明CNTN-1、腫瘤大小、有無完整包膜、微血管侵犯、甲胎蛋白（AFP）、Edmondson分級和TNM分期與肝癌根治術后早期復發(fā)密切相關；多因素Logistic回歸分析表明CNTN-1高表達是肝癌根治術后早期復發(fā)的獨立危險因素。結論 CNTN-1的高表達是肝癌根治術后早期復發(fā)的潛在預測因子。

肝癌；CNTN-1；早期復發(fā)

網絡出版時間：2016-3-8 8：29：02 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.060.htm l

原發(fā)性肝細胞性肝癌（簡稱肝癌）是世界范圍內第五大常見惡性腫瘤，其死亡率在癌癥相關死因中位列第三，5年生存率僅為10%［1-2］。雖然肝切除是目前治療早中期肝癌最有效的手段，但術后約50%的患者2年內出現(xiàn)復發(fā)，導致患者長期生存率較低［3］。因此尋找特異性腫瘤標志物對預測肝癌術后早期復發(fā)和改善患者預后具有重要價值。神經黏附分子接觸蛋白-1（contactin 1，CNTN-1）是免疫球蛋白超家族成員之一，在調節(jié)神經軸突生長、突觸形成等方面發(fā)揮重要作用［4-5］。但CNTN-1在肝癌組織中的表達情況及其與臨床意義尚不清楚。該研究采用免疫組化法檢測CNTN-1在肝癌組織和癌旁組織中的表達，分析CNTN-1與肝癌臨床病理特征、術后早期復發(fā)的關系。為肝癌術后早期復發(fā)高?；颊叩蔫b別提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病理標本 肝癌標本均取自2006年1月～2010年12月安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院肝臟外科收治經術后病理證實為肝癌組織及相應的癌旁組織（距離癌組織＞2cm的肝臟組織）的石蠟標本90例，隨訪截止至2013年12月，所有患者術前術后未行放療、化療、介入等抗癌治療。肝癌根治術后2年內復發(fā)的為早期復發(fā)，2年以上未復發(fā)為非早期復發(fā)［6］。其中男83例，女17例；年齡19～74（54.30 ±10.90）歲，＜60歲56例，≥60歲34例；腫瘤?＜5 cm 28例，≥5 cm 62例；病理學組織學分型：高分化44例，中低分化46例。腫瘤分期參照美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）TNM分期手冊第七版［7］。

1.2 主要試劑 鼠抗人CNTN-1單克隆抗體購自英國Abcam公司；相應二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法 采用免疫組化法檢測CNTN-1蛋白的表達。連續(xù)組織切片（4μm）經二甲苯脫蠟、枸櫞酸鹽（pH 6.0）微波抗原修復后3%去離子過氧化氫溶液封閉內源性過氧化物酶活性，滴加一抗CNTN-1（濃度1∶500），4℃過夜。復溫后滴加二抗，DAB顯色。最后蘇木精復染、脫水、透明、封片。由兩位未參與實驗、經驗豐富的病理科醫(yī)師對切片進行半定量評分，評分標準：每張切片在400倍顯微鏡下隨機選取5個視野，每個視野記數(shù)200個細胞，根據(jù)染色細胞所占百分率評分：無明顯細胞著色為0分；1%～10%細胞著色為1分；10%～30%細胞著色為2分；＞30%細胞著色為3分。再根據(jù)染色強度評分：未顯色或顯色不清為0分；淺黃色為l分；棕黃色為2分；深褐色為3分。每張切片最終得分為染色百分率和染色強度平均分數(shù)的乘積，得分≥3分者即定為高表達，得分＜3分者即定為低表達。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0軟件進行分析，連續(xù)資料以±s表示。分類變量采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。單因素和多因素的Logistic回歸分析用于尋找影響肝癌術后早期復發(fā)的因素。將單因素分析中有統(tǒng)計學意義的變量納入到多因素分析。在Logistic回歸基礎上使用受試者工作特征曲線（ROC）分析判斷各種危險因子預測肝癌術后早期復發(fā)的可靠性。

2 結果

2.1 肝癌組織及癌旁組織中CNTN-1的表達 免疫組化結果顯示CNTN-1主要定位于細胞質，見圖1。CNTN-1在90例肝癌和癌旁組織中的高表達率分別為54.4%（49/90）和12.2% （11/90），兩者差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.718，P=0.01）。

圖1 CNTN-1在肝癌和癌旁組織中的表達 DAB染色A：CNTN-1在肝癌組織中的陽性表達；B：CNTN-1在癌旁組織中的陰性表達；1：×100；2：×400

2.2 CNTN-1的表達與肝癌臨床病理參數(shù)及早期復發(fā)的關系 CNTN-1在肝癌組織中的高表達與更大的腫瘤直徑（P=0.004）、無完整包膜（P＜0.001）、更晚的TNM分期（P＜0.001）和術后早期復發(fā)（P＜0.000）顯著相關。而CNTN-1的表達與年齡、性別、腫瘤分化程度、微血管侵犯、甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、乙肝表面抗原、肝硬化及Child分級均無關。見表1。

2.3 早期復發(fā)相關因素的logistic回歸分析 為了尋找肝癌術后早期復發(fā)的影響因素，本研究對相關因素進行了Logistic回歸分析。在單因素分析中，較大的腫瘤直徑、無完整包膜、微血管侵犯、更高的AFP水平、更高的Edmondson分級、更晚的TNM分期、CNTN-1的高表達是肝癌術后早期復發(fā)的危險因子。見表2。在多因素分析中，微血管侵犯、更晚的TNM分期及CNTN-1的高表達是肝癌術后早期復發(fā)的獨立危險因子。見表3。

2.4 早期復發(fā)相關因素的ROC曲線分析 分別對肝癌患者各個臨床病例特征和CNTN-1表達做ROC曲線分析，結果表明腫瘤大小、有無完整包膜、微血管侵犯、AFP、Edmondson分級、TNM分期、CNTN-1表達的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.637、0.721、0.645、0.622、0.616、0.749、0.715。接著將各個臨床病理特征聯(lián)合做ROC曲線分析，AUC為0.849。最后將所有臨床病理特征與CNTN-1表達聯(lián)合做ROC曲線分析，AUC為0.870。見表4、圖2。

表1 CNTN-1表達與肝癌臨床病理特征及術后早期復發(fā)的相關性（n）

3 討論

本研究通過免疫組化法檢測了CNTN-1蛋白在90例原發(fā)性肝癌患者癌組織及相應癌旁組織中的表達情況，結果表明CNTN-1在肝癌組織中呈高表達，并且在肝癌組織中的表達與腫瘤直徑、有無完整包膜和TNM分期顯著相關，而與年齡、性別、腫瘤分化程度、微血管侵犯、AFP、乙肝表面抗原、肝硬化及Child分級均無關。重要的是 CNTN-1的高表達與肝癌患者術后早期復發(fā)密切相關，并且是肝癌術后早期復發(fā)的獨立危險因子。該研究結果提示CNTN-1與肝癌的侵襲能力及術后早期復發(fā)存在一定的相關性，可能成為預測肝癌患者術后早期復發(fā)和評估預后的有效指標。

研究［8］顯示CNTN-1在胃癌中的mRNA和蛋白水平均明顯增高，其高表達與TNM分期、淋巴結轉移及淋巴管侵犯密切相關。與胃癌中研究結果一致，Liu etal［9］發(fā)現(xiàn)CNTN-1在食管癌組織中mRNA和蛋白表達水平均明顯高于癌旁組織。并且，CNTN-1的高表達與腫瘤分期、淋巴結轉移及淋巴管侵犯密切相關。研究［10-11］顯示CNTN-1在肺癌組織中呈高表達狀態(tài)，并且與腫瘤分期及淋巴結轉移相關。本研究也顯示CNTN-1蛋白在肝癌組織中呈高表達狀態(tài)，并且與腫瘤的侵襲性臨床病理特征如無完整包膜、更大的腫塊直徑、更晚的TNM分期顯著相關，表明其在肝癌的侵襲和轉移中扮演著重要的角色。

表2 肝癌術后早期復發(fā)相關因子的單因素Logistic回歸分析

表3 肝癌術后早期復發(fā)相關因子的多因素Logistic回歸分析

表4 肝癌術后早期復發(fā)相關因子的　ROC曲線分析

圖2 Logistic回歸分析基礎上使用　ROC曲線比較CNTN-1與臨床病理危險因素預測肝癌術后早期復發(fā)的準確性

研究［12］表明，CNTN-1在口腔鱗癌的表達與患者術后復發(fā)相關。然而CNTN-1的表達與肝癌復發(fā)的關系國內外尚未見報道，因此，本研究采用了Logistic回歸分析來判斷CNTN-1表達與肝癌患者術后早期復發(fā)的關系。單因素分析表明更大的腫瘤直徑、無完整包膜、微血管侵犯、更高的AFP水平、更高的Edmondson分級、更晚的TNM分期、高表達的CNTN-1是肝癌術后早期復發(fā)的危險因子。多因素分析進一步表明微血管侵犯、更晚的TNM分期及CNTN-1的高表達是肝癌術后早期復發(fā)的獨立危險因子。為進一步證實CNTN-1預測肝癌術后早期復發(fā)的可靠性，在Logistic回歸基礎上使用ROC曲線構建了包括CNTN-1表達、單個臨床病理特征、各臨床病理特征聯(lián)合及臨床病理特征聯(lián)合CNTN-1表達在內的9個模型。結果顯示CNTN-1表達聯(lián)合所有臨床病理特征有更大的AUC，表明此模型在預測肝癌術后早期復發(fā)中可靠性更強。CNTN-1與肝癌術后早期復發(fā)密切相關，進一步揭示了CNTN-1基因在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起著至關重要的作用。本研究為肝癌術后早期復發(fā)的預測及早期干預治療提供了新的思路。然而，CNTN-1促進肝癌術后早期復發(fā)的具體機制尚不清楚，需要進一步深入研究。

［1］ Jemal A，Bray F，Center M M，etal.Global cancer statistics［J］. CA Cancer JClin，2011，61（2）：69-90.

［2］ Altekruse S F，McGlynn K A，Reichman M E.Hepatocellular carcinoma incidence，mortality，and survival trends in the United States from 1975 to 2005［J］.JClin Oncol，2009，27（9）：1485 -91.

［3］ Chun JM，Kwon H J，Sohn J，etal.Prognostic factors after early recurrence in patientswho underwent curative resection for hepatocellular carcinoma［J］.JSurg Oncol，2011，103（2）：148-51.

［4］ Berglund EO，Murai K K，F(xiàn)redette B，et al.Ataxia and abnormal cerebellar microorganization in mice with ablated contactin gene expression［J］.Neuron，1999，24（3）：739-50.

［5］ Fujita N，Saito R，Watanabe K，et al.An essential role of the neuronal cell adhesion molecule contactin in development of the Xenopus primary sensory system［J］.Dev Biol，2000，221（2）：308-20.

［6］ Takayama T，Sekine T，Makuuchi M，et al.Adoptive immunotherapy to lower postsurgical recurence rates of hepatocellular carcinoma：a randomized trial［J］.Lancet，2000，356（9232）：802 -7.

［7］ Edge SB，Compton C C.TheAmerican Joint Committee on Cancer：the 7th edition of the AJCC cancer stagingmanual and the future of TNM［J］.Ann Surg Oncol，2010，17（6）：1471-4.

［8］ Yu JW，Wu SH，Lu R Q，et al.Expression and significances of contactin-1 in human gastric cancer［J］.Gastroenterol Res Pract，2013：210205.

［9］ Liu P，Chen S，Wu W，et al.Contactin-1（CNTN-1）overexpression is correlated with advanced clinical stage and lymph nodemetastasis in oesophageal squamous cell carcinomas［J］.Jpn JClin Oncol，2012，42（7）：612-8.

［10］Su JL，Yang C Y，Shih JY，etal.Knockdown of contactin-1 expression suppresses invasion andmetastasis of lung adenocarcinoma ［J］.Cancer Res，2006，66（5）：2553-61.

［11］Su JL，Yang PC，Shih JY，et al.The VEGF-C/Flt-4 axis promotes invasion and metastasis of cancer cells［J］.Cancer Cell，2006，9（3）：209-23.

［12］Wu H M，CaoW，Ye D，et al.Contactin 1（CNTN1）expression associates with regional lymph nodemetastasis and is a novel predictor of prognosis in patients with oral squamous cell carcinoma ［J］.Mol Med Rep，2012，6（2）：265-70.

stage.Multivariate analysis identified CNTN-1 was an independent risk factor for early recurrence of HCC after hepatectomy.Conclusion High expression of CNTN-1 is a potentialpredictive factor for early recurrence of HCC after hepatectomy.
Key wordshepatocellular carcinoma；CNTN-1；early recurrence

Predictive value of CNTN-1 expression in early recurrence of hepatocellular carcinoma after hepatectom y

LiGuangyao，JiaWeidong，Cheng Ya，et al
（Dept of General Surgery，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

Objective To investigate the predictive value of CNTN-1 expression in early recurrence of hepatocellular carcinoma（HCC）after hepatectomy.Methods Immunohistochemistry was used to detect the expression of CNTN-1 in tumor tissues and adjacent non-tumor tissues from 90 HCC patients.The relationships of CNTN-1 expression with clinicopathological parameters and early postoperative recurrence were evaluated.Resu lts CNTN-1 expression was significantly higher in tumor tissues than that in adjacentnon-tumor tissues（P＜0.01）.Besides，CNTN-1 expression was significantly associated with tumor size，tumor capsula，and tumor-node-metastasis（TNM）stage.Univariate logistic regression analysis indicated that early postoperative recurrence of HCC was significantly correlated with CNTN-1，tumor size，tumor capsula，vascular invasion，serum AFP，Edmondson grade，and TNM

R 735.7

A

1000-1492（2016）04-0587-05

2016-01-08接收

國家自然科學基金（編號：81172364）；安徽省科技攻關項目（編號：1301042199）

安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院普外科，合肥 230001

李光耀，男，碩士研究生；
莢衛(wèi)東，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，責任作者，E-mail：jwd2013@126.com