杜希劍, 余開湖, 章凱敏, 何　立

(1.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 湖北 武漢, 430071;2.咸寧市中心醫(yī)院 同濟(jì)咸寧醫(yī)院 湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院 介入中心, 湖北 咸寧, 437000)

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有氧、乏氧環(huán)境下齊墩果酸對腫瘤細(xì)胞的放射增敏作用

杜希劍1, 2, 余開湖2, 章凱敏2, 何立1

(1.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 湖北 武漢, 430071;2.咸寧市中心醫(yī)院 同濟(jì)咸寧醫(yī)院 湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院 介入中心, 湖北 咸寧, 437000)

摘要:目的觀察有氧、乏氧環(huán)境下齊墩果酸(OA)的放射增敏作用。方法以人 A549 肺腺癌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，進(jìn)行有氧和乏氧處理，觀察OA對有氧、乏氧狀態(tài)下A549 細(xì)胞的放射增敏作用。采用MTT法確定有氧、乏氧環(huán)境下OA 半數(shù)有效抑制濃度(IC50)。使用多靶單擊模型擬合細(xì)胞集落生成實(shí)驗(yàn)中A549細(xì)胞存活曲線，計(jì)算出細(xì)胞的放射增敏比(SER)。結(jié)果有氧組A549細(xì)胞的IC50濃度為29 μg/mL，乏氧組IC50濃度為78 μg/mL，分別采用50%IC50、IC50兩種濃度對A549 細(xì)胞進(jìn)行處理，處于有氧、乏氧環(huán)境下，IR(單純照射)+50%IC50處理的A549細(xì)胞SER顯著低于IR+IC50處理的A549細(xì)胞的SER(P<0.05)。有氧環(huán)境下IR+50%IC50處理的A549細(xì)胞的SER顯著高于乏氧環(huán)境下IR+IC50處理的A549細(xì)胞的SER(P<0.05)。結(jié)論在有氧和乏氧環(huán)境下，OA都能明顯上調(diào)腫瘤細(xì)胞的放射增敏作用。

關(guān)鍵詞:齊墩果酸; 惡性腫瘤; 放射增敏

放射治療是一種局部殺傷腫瘤細(xì)胞的治療方法，其療效取決于腫瘤組織、器官對于放射敏感性，一般增殖活躍、分化程度高的腫瘤細(xì)胞放射敏感性較高[1]。此外腫瘤細(xì)胞中的氧含量也能影響放療的治療效果。有研究[2]發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中的乏氧細(xì)胞對放射線的耐受性是有氧細(xì)胞的

2.5～4倍，放射敏感性明顯降低，直接限制了放射治療的效果。對于放射敏感性低的腫瘤患者的治療，臨床上常使用放射增敏劑來提高放射治療的效果，改善患者的預(yù)后[3]。近年來發(fā)現(xiàn)，放射增敏劑主要分為親電子化合物、DNA修復(fù)抑制劑、生物還原活性物、巰基抑制劑及氧利用抑制劑5種[4]，可以通過不同的機(jī)制加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞放射性損傷，降低患者腫瘤的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)。齊墩果酸(OA)是一種從天然植物中提取的化合物，具有抑制腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的效果[5-7]。近年來有學(xué)者[8-9]指出，齊墩果酸也具有增加放射治療的敏感性的作用。本文主要觀察有氧、乏氧環(huán)境下齊墩果酸對腫瘤細(xì)胞的放射增敏作用的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)及預(yù)處理

A549細(xì)胞(人A549 肺腺癌細(xì)胞株)采用含 10% 胎牛血清的 RPMI Medium 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，分裝入25 mL的培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞密度至2×105個/mL活細(xì)胞，置 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)。每3～4 d傳代 1 次，達(dá)一定數(shù)目后進(jìn)行后續(xù)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

A549細(xì)胞置于CoCl2模擬乏氧環(huán)境下，采用100 μmol/L CoCl2預(yù)處理 4 h, 且在后續(xù)實(shí)驗(yàn)的過程中保證培養(yǎng)基終濃度始終為100 μmol/L。NAC 預(yù)處理是指在用齊墩果酸處理腫瘤細(xì)胞之前，先用5 mmol/L的NAC預(yù)處理24 h。

1.2實(shí)驗(yàn)方法及觀察指標(biāo)

1.2.1有氧、乏氧環(huán)境下齊墩果酸半數(shù)有效抑制濃度(IC50)測定：取A549對數(shù)期生長細(xì)胞，接種于96孔板中，毎孔5 000個細(xì)胞(200 μL)設(shè)置3個實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長時(shí)，分別用 125、62.5、31.2、7.8、3.9 μg/mL的 OA 處理(上海微蒙生物科技有限公司出品，純度 99%)，培養(yǎng)24 h后加入RPMI Medium 1640培養(yǎng)基和MTT溶液(9∶1)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，測定光吸收值，得出實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組細(xì)胞抑制率。以齊墩果酸濃度梯度為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞生存率為縱坐標(biāo)，分別做出有氧和乏氧環(huán)境下齊墩果酸給藥濃度與細(xì)胞生存曲線，計(jì)算得出齊墩果酸半數(shù)有效抑制濃度(IC50)。

1.2.2有氧、乏氧環(huán)境下齊墩果酸對A549細(xì)胞的放射增敏作用：2組研究對象分別給予單純射線照射(IR)、IR+50% IC50和IR+IC50共3種方法進(jìn)行處理，細(xì)胞培養(yǎng)在60 mm 培養(yǎng)皿中，進(jìn)行 X 射線照射，源靶距為100 cm, 劑量率 250 cGy/min，照射野根據(jù)培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿個數(shù)而定，照射劑量設(shè)定為 0、1、2、3、5、7 Gy。固定染色后測定細(xì)胞集落數(shù)，重復(fù)試驗(yàn)3次，取其平均值，計(jì)算生存分?jǐn)?shù)(SF)，使用多靶單擊模型擬合細(xì)胞存活曲線，計(jì)算平均致死量(D0)、準(zhǔn)閾劑量(Dq)及放射增敏比(SER)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1有氧、乏氧環(huán)境下不同齊墩果酸給藥濃度對A549細(xì)胞生存情況的影響

通過分析有氧和乏氧環(huán)境下齊墩果酸給藥濃度與細(xì)胞生存曲線發(fā)現(xiàn)，在有氧環(huán)境下，當(dāng)齊墩果酸給藥濃度達(dá)到15.6 μg/mL時(shí)，細(xì)胞生存率明顯下降，且隨著齊墩果酸給藥濃度的提高，A549細(xì)胞生存率呈現(xiàn)下降的趨勢(P<0.05)。有氧組A549細(xì)胞的IC50濃度為29 μg/mL, 在乏氧組IC50濃度為78 μg/mL。見圖1。

與對照組比較,*P<0.05,▼P<0.05

2.2有氧、乏氧環(huán)境下齊墩果酸對A549細(xì)胞的放射增敏作用比較

使用50% IC50和IC50兩種濃度的齊墩果酸對有氧、乏氧環(huán)境下A549細(xì)胞預(yù)處理24 h后，待細(xì)胞增殖呈集落后進(jìn)行染色計(jì)數(shù)。帶入多靶單擊模型進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合后發(fā)現(xiàn)，隨著放射劑量的增加，細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(SF)降低，通過比較后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)放射劑量大于2 Gy時(shí)，有氧、乏氧環(huán)境下經(jīng)IR+IC50及IR+IC50處理A549細(xì)胞SF明顯低于單純照射組(IR)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。比較有氧、乏氧環(huán)境下齊墩果酸對A549細(xì)胞的放射增敏比(SER)發(fā)現(xiàn)，處于有氧、乏氧環(huán)境下，IR+50% IC50處理的A549細(xì)胞SER明顯低于IR+IC50處理的A549細(xì)胞的SER，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組間比較發(fā)現(xiàn)，有氧環(huán)境下IR+50%IC50處理的A549細(xì)胞的SER顯著高于乏氧環(huán)境下IR+IC50處理的A549細(xì)胞的SER(P<0.05)。見表1、圖3。

A為有氧組，B為乏氧組

圖3 齊墩果酸對有氧、乏氧環(huán)境下A549細(xì)胞的放射增敏比的影響(▼P<0.05)

表1　單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線下相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)比較

3討論

放射增敏劑是指與放射線共同使用才提高射線殺傷腫瘤細(xì)胞作用的一類藥物，其單獨(dú)使用不殺傷細(xì)胞[10]。近年來研究[11]發(fā)現(xiàn)，影響腫瘤放射敏感性的因素主要與腫瘤組織中乏氧細(xì)胞的數(shù)量、谷胱甘肽的含量、細(xì)胞放射損傷的修復(fù)能力、細(xì)胞周期、再氧合作用、射線照射的劑量等因素有關(guān)。放射增敏劑可以使腫瘤細(xì)胞DNA靶分子自由基奪取電子，增加DNA堿基氧化與吸電子還原修復(fù)的能力[12]，此外還可以使細(xì)胞內(nèi)的巰基化合物細(xì)胞修復(fù)損傷能力受到抑制，達(dá)到提高放射敏感性的作用[13]。

齊墩果酸廣泛存在自然界植物中，主要以游離或苷化物的形式存在，臨床上可起到護(hù)肝、解毒、降血糖血脂、抗炎抗病毒、抗過氧化作用、抗癌、抗突變等作用[14]。有文獻(xiàn)[15-16]指出，齊墩果酸可以直接抑制腫瘤生長，降低放射治療對造血組織的損傷，具有抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡及抑制血管新生等作用，可對多種腫瘤細(xì)胞起作用，可為腫瘤的治療提供一種新的藥物選擇。本研究發(fā)現(xiàn)，通過分析有氧和乏氧環(huán)境下齊墩果酸給藥濃度與細(xì)胞生存曲線發(fā)現(xiàn)，在有氧環(huán)境下，當(dāng)齊墩果酸給藥濃度達(dá)到15.6 μg/mL時(shí)細(xì)胞生存率明顯下降，且隨著齊墩果酸給藥濃度的提高，A549細(xì)胞生存率呈現(xiàn)下降的趨勢(P<0.05)。有氧環(huán)境下A549細(xì)胞的IC50濃度為29 μg/mL，在乏氧環(huán)境下IC50濃度為78 μg/mL，表明齊墩果酸可以有效抑制腫瘤增殖，隨著藥物濃度的增加，腫瘤細(xì)胞生存率降低，有氧環(huán)境下較乏氧環(huán)境下半數(shù)有效抑制濃度(IC50)降低，提示齊墩果酸在有氧環(huán)境下對人肺腺癌細(xì)胞細(xì)胞毒性較強(qiáng)，具有明顯抑制腫瘤生長的作用，而在乏氧環(huán)境下細(xì)胞毒性較弱。

對于齊墩果酸放射增敏機(jī)制主要和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中調(diào)控因子紊亂、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)[17]，有研究[18]報(bào)道，低濃度的齊墩果酸可以抑制G2M期Jurkat細(xì)胞增殖，而高濃度的齊墩果酸則殺傷G0/G1期Jurkat細(xì)胞。齊墩果酸可以通過恢復(fù)調(diào)控因子的功能達(dá)到修復(fù)受損細(xì)胞、抑制腫瘤的作用[19]。齊墩果酸還能激活凋亡蛋白Bax，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，影響線粒體結(jié)構(gòu)和功能，合成凋亡小體，上調(diào)Caspase-9的表達(dá)，使得腫瘤細(xì)胞DNA斷裂促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生[6，20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，使用50%IC50和IC50兩種濃度的齊墩果酸對有氧、乏氧環(huán)境下A549細(xì)胞預(yù)處理24 h后，待細(xì)胞增殖呈集落后進(jìn)行染色計(jì)數(shù)。帶入多靶單擊模型進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合后發(fā)現(xiàn)，隨著放射劑量的增加，細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(SF)降低。通過比較后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)放射劑量大于2 Gy時(shí)，有氧、乏氧環(huán)境下經(jīng)IR+IC50及IR+IC50處理A549細(xì)胞SF顯著低于單純照射組(IR)。

比較有氧、乏氧環(huán)境下齊墩果酸對A549細(xì)胞的放射增敏比(SER)發(fā)現(xiàn)，處于有氧、乏氧環(huán)境下，IR+50%IC50處理的A549細(xì)胞SER明顯低于IR+IC50處理的A549細(xì)胞的SER，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組間比較發(fā)現(xiàn)，有氧環(huán)境下IR+50%IC50處理的A549細(xì)胞的SER顯著高于乏氧環(huán)境下IR+IC50處理的A549細(xì)胞的SER(P<0.05)。說明在有氧和乏氧環(huán)境下，隨著齊墩果酸濃度的上升，腫瘤細(xì)胞放射增敏作用加強(qiáng)。當(dāng)齊墩果酸濃度達(dá)到IC50時(shí)，乏氧環(huán)境下腫瘤細(xì)胞放射敏感性低于有氧環(huán)境下腫瘤細(xì)胞。當(dāng)給予齊墩果酸濃度50%IC50時(shí)，二者無顯著差異。這可能與腫瘤細(xì)胞接受放射治療后，腫瘤周邊組織對于放射敏感的細(xì)胞優(yōu)先死亡，大劑量的齊墩果酸可加強(qiáng)乏氧細(xì)胞與血管氧交換的功能，乏氧細(xì)胞向有氧細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度加大，亦可上調(diào)放射增敏作用[21]。

參考文獻(xiàn)

[1]Sharabi A B, Lim M, DeWeese T L, et al.Radiation and checkpoint blockade immunotherapy：radiosensitisation and potential mechanisms of synergy[J].Lancet Oncol, 2015, 16(13): e498-509.

[2]陸海鵬, 農(nóng)英高.抗腫瘤放射增敏劑的臨床研究進(jìn)展[J].中國藥業(yè), 2012, 21(3): 87-88.

[3]Alberti C.Molecularly targeted radiosensitization chances towards gene aberration-due organ confined/regionally advanced prostate cancer radioresistance[J].G Chir, 2015, 36(3): 133-136.

[4]冉晨曦, 何人可, 湯小玲, 等.腫瘤放射治療中輻射增敏劑的應(yīng)用進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥, 2015, 55(3): 86-88.

[5]胡華杰.齊墩果酸藥理作用與臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué), 2012, 24(3): 92-94.

[6]Pratheeshkumar P, Kuttan G.Oleanolic acid induces apoptosis by modulating p53, Bax, Bcl-2 and caspase-3 gene expression and regulates the activation of transcription factors and cytokine profile in B16F[J].J Environ Pathol Toxicol Oncol, 2011, 30(1): 21-31.

[7]Li L, Wei L, Shen A, et al.Oleanolic acid modulates multiple intracellular targets to inhibit colorectal cancer growth[J].Int J Oncol, 2015, 47(6): 2247-2254.

[8]徐慧琴, 張雨, 汪會, 等.18F-FDG PET/CT評估齊墩果酸放射增敏作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華核醫(yī)學(xué)與分子影像雜志, 2015, 35(3): 217-221.

[9]Shin B, Park W.Synergistic Effect of Oleanolic Acid on Aminoglycoside Antibiotics against Acinetobacter baumannii[J].PLoS One, 2015, 10(9): e0137751.

[10]Dong G Z, Wang D G, Gao H Q, et al.Study of the radiotherapy sensitizea-tion of retroperitoneal lymph node metastasis in patients by sodium glycididazole[J].Pak J Pharm Sci, 2015, 28(Suppl 5): 1835-1838.

[11]陳志輝, 徐良梅, 李建平.齊墩果酸研究進(jìn)展[J].飼料博覽, 2010(6): 7-9.

[12]溫林春, 章龍珍.新型放射增敏劑Dbait的研究進(jìn)展[J].中華放射腫瘤學(xué)雜志, 2010, (2): 142-144.

[13]Konopka-Filippow M, Zabrocka E, Wojtowicz A, et al.Pain management during radiotherapy and radiochemotherapy in oropharyngeal cancer patients: single-institution experience[J].Int Dent J, 2015, 65(5): 242-248.

[14]楊澤, 李陽, 萬小亞, 等.腫瘤放射治療增敏劑研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2015, 12(30): 42-45.

[15]王奇, 蘆柏震.齊墩果酸的研究進(jìn)展[J].中國藥房, 2008, 19(9): 711-712.

[16]Gao L, Xu Z, Wang Y, et al.Anticancer effect of SZC017, a novel derivative of oleanolic acid, on human gastric cancer cells[J].Oncol Rep, 2016, 35(2): 1101-1108.

[17]Rawendra R D, Lin P Y, Chang C D, et al.Potentiation of Acute Promyelocytic Leukemia Cell Differentiation and Prevention of Leukemia Development in Mice by Oleanolic Acid[J].Anticancer Res, 2015, 35(12): 6583-6590.

[18]李杰, 許良中, 朱偉萍, 等.熊果酸與齊墩果酸體外抗Jurkat淋巴瘤細(xì)胞的研究[J].中國癌癥雜志, 1999(Z1): 41-43.

[19]Zhang J, Lu L, Zhou L.Oleanolic acid activates daf-16 to increase lifespan in Caenorhabditis elegans[J].Biochem Biophys Res Commun, 2015, 468(4): 843-849.

[20]董靜, 吳勃巖, 劉艷秋, 等.齊墩果酸對H22荷瘤小鼠腫瘤組織中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2015, 21(14): 129-131.

[21]周厚清.腫瘤放射增敏劑及增敏機(jī)制研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué): 腫瘤學(xué)分冊, 2001(06): 432-435.

收稿日期:2016-04-01

基金項(xiàng)目:湖北省衛(wèi)計(jì)委科研基金項(xiàng)目(WJ2015MB232)

通信作者:章凱敏, E-mail: 1470708440@qq.com

中圖分類號:R 734

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)13-040-04

DOI:10.7619/jcmp.201613012

Radiosensitizing effect of oleanolic acid on tumor cells in aerobic and anoxic environments

DU Xijian1, 2, YU Kaihu2, ZHANG Kaimin2, HE Li1

(1.BasicMedicalCollegeofWuhanUniversity,Wuhan,Hubei, 430071; 2.InterventionalCenter,XianningCentralHospital,TongjiXianningHospital,TheFirstAffiliatedHospitalofHubeiUniversityofScienceandTechnology,Xianning,Hubei, 437000)

ABSTRACT:Objective: To explore the radiosensitizing effect of oleanolic acid (OA) in aerobic and anoxic environments.MethodsHuman A549 lung adenocarcinoma cells were treated with oxygen and hypoxic culture, and the effects of OA on A549 cells were observed.MTT method was used to determine the median effective inhibitory concentration (IC50) of OA under aerobic and anoxic conditions.Cell survival curves were fitted by using a multi target click model to describe the A549 cell survival curve, and the radiation enhancement ratio (SER) was calculated.ResultsThe IC50 concentration of A549 cells in the aerobic group was 29 μg/mL, and the concentration of IC50 in the hypoxia group was 78 μg/mL.50% IC50 and IC50 concentrations were used to process A549 in oxygen and hypoxic oxygen conditions.SER of A549 cell processed with IR (irradiation) +50% IC50 was significantly lower than that of A549 cells processed with IR+IC50 treatment of (P<0.05).SER of A549 cells processed with IR+50%IC50 in the aerobic environment was significantly higher than that processed with IR+IC50 in hypoxic conditions (P<0.05).ConclusionOA can significantly up-regulate the radiation sensitivity of tumor cells in aerobic and hypoxic environments.

KEYWORDS:oleanolic acid; malignant tumor; radiosensitizing effect