高文強(qiáng), 劉　坤, 周　艷, 劉寒旸, 湯黎明

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院 胃腸外科, 江蘇 常州, 213164)

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腺苷對(duì)人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖與凋亡的影響

高文強(qiáng), 劉坤, 周艷, 劉寒旸, 湯黎明

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院 胃腸外科, 江蘇 常州, 213164)

摘要:目的觀察腺苷(adenosine)對(duì)人胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖、凋亡的影響。方法CCK-8法檢測(cè)不同濃度腺苷(0.01～10 mmol/L)對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的影響。流式細(xì)胞儀檢測(cè)腺苷(0.25、0.5、1 mmol/L)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。Western blot檢測(cè)腺苷處理后細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)量。結(jié)果腺苷能抑制胃癌MGC-803細(xì)胞的活力，并且呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性(P<0.05)。腺苷(0.25、0.5、1 mmol/L)處理24 h后，細(xì)胞的總凋亡率顯著升高(P<0.01)。腺苷可以引起凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3活化片段的蛋白表達(dá)量上調(diào)(P<0.01)。腺苷能誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)相關(guān)蛋白Caspase-4活化片段、p-JNK、CHOP、GRP78的表達(dá)量上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論腺苷可以抑制胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖，并且促進(jìn)凋亡，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能參與了腺苷引起的凋亡。

關(guān)鍵詞:胃癌; 腺苷; 增殖; 凋亡; 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)GLOBOCAN 2012的統(tǒng)計(jì)，全世界每年新發(fā)胃癌約95.1萬例，其發(fā)病率目前在全球范圍內(nèi)居第5位，每年因胃癌死亡約72.3萬例，其死亡率在全球范圍內(nèi)位居第3位[1-2]。在中國，大部分胃癌病例在確診時(shí)已是進(jìn)展期，手術(shù)治療難以達(dá)到治愈，常常需要配合系統(tǒng)性化療[3]。雖然目前化療藥物種類繁多，但是探索新的抗癌藥物一直是治療腫瘤的研究方向。腺苷是三磷酸腺苷ATP經(jīng)過內(nèi)源性核苷酸酶催化的代謝產(chǎn)物[4]。正常情況下，腺苷的濃度維持在極低的水平，可以通過轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)或者直接作用于細(xì)胞膜表面的腺苷受體來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能[5]。高濃度的胞外腺苷能誘導(dǎo)肺癌[6]、肝癌[7]、卵巢癌[8]、乳腺癌[9]等多種腫瘤細(xì)胞的凋亡。本研究探討腺苷對(duì)于胃癌的作用和機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1材料

人胃癌MGC-803細(xì)胞株(中科院細(xì)胞庫)；腺苷(A4036，Sigma公司，美國); CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(同仁化學(xué)研究所，日本)；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司，美國)；Annexin V PE凋亡檢測(cè)試劑盒(Affymetrix公司，美國)；cleaved Caspase-3、Caspase-4、cleaved Caspase-4、JNK、p-JNK、CHOP和GRP78一抗(Cell Signaling公司，美國)；Tubulin一抗、HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗和HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(南京諾唯贊公司)；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白測(cè)定試劑盒和ECL顯影試劑盒(上海碧云天公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：MGC-803細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基，含有10%胎牛血清和1%雙抗，于37℃飽和濕度、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2～3 d換液，傳代細(xì)胞使用0.25%胰酶-EDTA消化液消化2 min。

1.2.2CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC-803細(xì)胞制成混懸液，分別以5×104個(gè)/mL細(xì)胞密度接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種100 μL混懸液，樣本孔四周用PBS填充。每隔24 h檢測(cè)1次，連續(xù)監(jiān)測(cè)3 d，每次各組5個(gè)孔分別加入10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)1 h 后使用酶標(biāo)儀(Molecular Devices 公司，美國)測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處的吸光度值，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組吸光度的比值，取百分?jǐn)?shù)，制作細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：加入不同濃度腺苷處理24 h后，收集各組大約1×105個(gè)細(xì)胞，用PBS溶液洗滌，離心，加入100 μL緩沖液重懸。細(xì)胞懸液加入5 μL Annexin VPE，室溫下避光孵育15 min。1×緩沖液洗滌離心1次，加入200 μL緩沖液重懸。細(xì)胞懸液加入5 μL 7-AAD, 4 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，保持樣品2～8℃且避光。檢測(cè)分析早期凋亡(Annexin V PE+, 7-AAD-)和晚期凋亡(Annexin V PE+, 7-AAD+)的所占比率。

1.2.4Western blot：細(xì)胞使用RIPA裂解液裂解，45 min后提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白樣品含量，加入上樣緩沖液后100℃加熱5 min。12%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。5% BSA室溫下封閉1 h, 一抗4℃孵育過夜后PBST洗膜3次，計(jì)入HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h, PBST洗膜3次。采用ECL試劑盒顯影，凝膠電泳成像系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)攝片分析，蛋白條帶的灰度值由ImageJ軟件進(jìn)行分析。

2結(jié)果

2.1腺苷對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8法檢測(cè)腺苷對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖能力的影響。每組含有腺苷的細(xì)胞與空白對(duì)照組的比值表示細(xì)胞的增殖能力。濃度為0.5 mmol/L腺苷處理48 h組的細(xì)胞增殖能力比空白對(duì)照組顯著降低(P<0.01)。MGC-803細(xì)胞的增殖能力隨著腺苷濃度的增加而下降，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，呈濃度和時(shí)間依賴性。見圖1。

與對(duì)照組(腺苷0mmol/L)比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3

2.2腺苷對(duì)MGC-803細(xì)胞凋亡的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腺苷對(duì)MGC-803細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示MGC-803細(xì)胞經(jīng)過腺苷(0.5 mmol/L)處理后的總凋亡率為(30.59±4.1)%，與空白對(duì)照組的總凋亡率(4.44±1.4)%相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。相比空白對(duì)照組的晚期凋亡率，3組腺苷處理組的晚期凋亡率顯著升高(P<0.01)。腺苷處理組的早期凋亡率與空白對(duì)照組相比沒有變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖2。

表1　MGC-803細(xì)胞經(jīng)過腺苷處理后的凋亡率的變化　 %

與對(duì)照組(腺苷0 mmol/L)比較, **P<0.01。

圖2 腺苷對(duì)MGC-803細(xì)胞凋亡的影響

2.3腺苷對(duì)MGC-803細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活化片段的表達(dá)量的影響

采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活化片段的表達(dá)量變化。結(jié)果顯示，在腺苷處理48 h后，濃度為0.25、0.5、1 mmol/L腺苷處理組細(xì)胞內(nèi)的Caspase-3活化片段的蛋白表達(dá)量要顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)，并且Caspase-3活化片段的蛋白表達(dá)量隨著腺苷濃度的增加而升高。在腺苷處理濃度為0.5 mmol/L時(shí)，腺苷處理24、48、72 h組細(xì)胞內(nèi)的Caspase-3活化片段的蛋白表達(dá)量都顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)，并且Caspase-3活化片段的蛋白表達(dá)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。見圖3。

A: Western blot檢測(cè)Caspase-3活化片段的蛋白表達(dá)水平;B: 重復(fù)檢測(cè)樣本的量化數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果(與對(duì)照組相比較, **P<0.01, n=3)

2.4腺苷對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Caspase-4活化片段、p-JNK、CHOP和GRP78的蛋白表達(dá)量變化。結(jié)果顯示，經(jīng)過濃度為0.25、0.5、1 mmol/L腺苷處理組細(xì)胞內(nèi)的Caspase-4活化片段、p-JNK、CHOP和GRP78的表達(dá)量顯著高于各自的空白對(duì)照組(P<0.05)。隨著腺苷濃度的升高，細(xì)胞內(nèi)Caspase-4活化片段、p-JNK、CHOP和GRP78的表達(dá)量也隨之增加。見圖4。

A: Western blot檢測(cè)的Caspase-4活化片段、p-JNK、CHOP、GRP78的蛋白表達(dá)水平;B: 重復(fù)檢測(cè)樣本的量化數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果(與對(duì)照組相比較, **P<0.01, n=3)

3討論

目前，進(jìn)展期胃癌的術(shù)后復(fù)發(fā)和預(yù)后差等問題依然是綜合治療需要攻克的難關(guān)，局部或遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌無法治愈的主要原因。因此，對(duì)進(jìn)展期胃癌進(jìn)行局部和全身系統(tǒng)性的化療變得尤為重要。所以在綜合治療模式下，積極探索新型化療藥物和新方案的組合已然是當(dāng)務(wù)之急[10-11]。

本研究觀察到腺苷能抑制胃癌細(xì)胞MGC-803的生長(zhǎng)，并且呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)到了腺苷處理24 h過后的MHC-803細(xì)胞發(fā)生了凋亡。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)的Caspase-3活化片段的蛋白表達(dá)量顯著增加。研究結(jié)果表明，腺苷能通過激活Caspase-3誘導(dǎo)凋亡，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖。本研究還發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白Caspase-4活化片段、p-JNK、CHOP、GRP78的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)與細(xì)胞的凋亡關(guān)系密切，可以經(jīng)過多種途徑激活凋亡蛋白Caspase-3，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡[12]。在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)感受到外界的刺激時(shí)，就會(huì)引起蛋白的錯(cuò)誤折疊。為了抵抗蛋白的錯(cuò)誤折疊，細(xì)胞會(huì)上調(diào)GRP78蛋白來結(jié)合未折疊的蛋白，從而減少錯(cuò)誤折疊的蛋白，這種細(xì)胞保護(hù)機(jī)制叫做未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)[13-14]。隨著外界刺激的持續(xù)，未折疊的蛋白越來越多，細(xì)胞的這種保護(hù)機(jī)制克服不了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，細(xì)胞凋亡就會(huì)被激活。在這過程中，未折疊蛋白反應(yīng)會(huì)引起3種蛋白的表達(dá)量的上調(diào)，即IRE1，PERK和ATF6[15]。作為IRE1，PERK和ATF6的下游蛋白，Caspase-4活化片段、p-JNK和CHOP蛋白的表達(dá)量也會(huì)被激活上調(diào)，最后激活細(xì)胞的凋亡蛋白Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16]。

在研究治療腫瘤的過程中，促進(jìn)其發(fā)生凋亡是一種重要的治療方法[17]。本研究發(fā)現(xiàn)腺苷能通過誘導(dǎo)凋亡來抑制胃癌細(xì)胞的增殖，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能參與了腺苷誘導(dǎo)的凋亡。細(xì)胞凋亡的機(jī)制是復(fù)雜的，腺苷作用于胃癌細(xì)胞的機(jī)制還需要繼續(xù)進(jìn)一步研究。

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收稿日期:2015-12-16

中圖分類號(hào):R 735.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2016)13-044-04

DOI:10.7619/jcmp.201613013

Effects of adenosine on proliferation and apoptosis in human gastric cancer cell line MGC-803

GAO Wenqiang, LIU Kun, ZHOU Yan, LIU Hanyang, TANG Liming

(1.DepartmentofGastrointestinalSurgery,ChangzhouSecondPeople′sHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Changzhou,Jiangsu, 213000)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the influence of adenosine on proliferation and apoptosis in human gastric cancer cell line MGC-803.MethodsMGC-803 cells were treated with different concentrations of adenosine (0.01～10 mmol/L), and CCK-8 was used to observe cell proliferation.Flow cytometry (FCM) was used to analyze cells apoptosis after treatment of adenosine.Apoptosis protein Caspase-3 and endoplasmic reticulum stress (ERS) related proteins (casepase-4, p-JNK, CHOP, GRP78) were detected by Western blotting.ResultsAdenosine significantly inhibited the MGC-803 cells viability in a concentration- and time-dependent manner (P<0.05).After treatment with adenosine (0.25, 0.5, 1 mmol/L) for 24 h, total apoptosis rate of cells significantly increased (P<0.01).Expression of cleaved Caspase-3 was significantly up-regulated after treatment with adenosine (P<0.01).ERS related proteins (casepase-4, p-JNK, CHOP, GRP78) were significantly up-regulated in adenosine treated group (P<0.05).ConclusionAdenosine can significantly suppress proliferation and induce apoptosis in MGC-803 cells, while endoplasmic reticulum stress is involved in adenosine-induced apoptosis.

KEYWORDS:gastric carcinoma; adenosine; proliferation; apoptosis; endoplasmic reticulum stress