李俊，劉芳，宋亞曼，譚宇哲，楊雪梅，馮艷萍

（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科，河北 石家莊 050031）

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論著

人魚精蛋白1多態(tài)性與漢族男性生育力的相關(guān)性分析*

李俊，劉芳，宋亞曼，譚宇哲，楊雪梅，馮艷萍

（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科，河北 石家莊 050031）

摘要：目的研究人類魚精蛋白1（PR M1）C321A多態(tài)性與漢族男性生育力的相關(guān)性。方法選取174例原發(fā)不育男性患者為觀察組，172例生育男性為對照組，分別分析兩組常規(guī)精液參數(shù)，采用限制性酶切及DNA測序技術(shù)對PR M1 C321A位點進行基因分型。結(jié)果不育患者PR M1 C321A位點AA基因型頻率（8.05%）顯著高于生育男性（2.33%）（P<0.01），分析顯示AA基因型與男性不育的遺傳易感性明顯相關(guān)[＾OR=4.24（95%CI：1.33，13.51）]。AA基因型可使精子前向運動能力及正常形態(tài)比例等參數(shù)明顯下降，可能是其導(dǎo)致男性不育的主要因素。結(jié)論PR M1 C321A多態(tài)性改變與漢族男性生育力相關(guān)。

關(guān)鍵詞：人魚精蛋白1；單核苷酸多態(tài)性；男性不育；遺傳易感性

在精子發(fā)生的圓形精子細胞期組蛋白被過渡蛋白替換，在隨后的長形精子細胞期魚精蛋白取代過渡蛋白與精子DNA緊密結(jié)合。人魚精蛋白1（Protamine 1，PRM1）、人魚精蛋白2（Protamine 2，PRM2）分別由位于16p13.3的PRM1、PRM2基因編碼，魚精蛋白在精子DNA凝聚及包裝中發(fā)揮重要作用，是主要的DNA結(jié)合蛋白[1]。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠敲除魚精蛋白基因可導(dǎo)致魚精蛋白表達量減少、精子DNA損傷及功能下降?；蚯贸∈箅m可產(chǎn)生精子，但精子形態(tài)異常、活力下降，影響其受精能力[2]。

鑒于魚精蛋白在精子細胞分化中發(fā)揮重要作用，推測其基因序列的改變可導(dǎo)致男性不育。研究發(fā)現(xiàn)PRM2 C248T多態(tài)性改變與日本男性生育力相關(guān)[3]，10%的美國男性不育患者可檢測出PRM1 G197T位點的多態(tài)性改變[4]。但也有研究指出PRM基因多態(tài)性位點與男性生育力無明顯相關(guān)性。TANAKA等[3]發(fā)現(xiàn)，PRM基因存在8個多態(tài)性位點，其中7個單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點（PRM1中的A133G、C160A、G320A、C321A、A431G；PRM2基因中的G398C及A473C）在日本生育及不育男性中的分布頻率無差異，研究指出PRM1 C321A及PRM2 C248T位點多態(tài)性改變與伊朗男性生育力無相關(guān)性[1]。

目前尚未見PRM1 C321A位點多態(tài)性與漢族男性生育力的相關(guān)性研究，為探明該多態(tài)性位點對漢族男性生育力的影響，本研究分析PRM1 C321A基因型在生育及不育組男性中的分布頻率及不同基因型對常規(guī)精液參數(shù)的影響。

1　資料與方法

1.1研究對象

選取2013年8月-2014年12月于河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科就診患者為研究對象。不育組為排除女方因素，未避孕≥1年未育的男性患者，已知臨床因素（如精索靜脈曲張、輸精管梗阻等）和遺傳因素（如染色體異常、Y染色體微缺失等）導(dǎo)致不育的患者除外。生育組（對照組）男性為未借助輔助生殖技術(shù)的已育查體患者。實驗包括174例不育患者，172例男性對照組患者。

1.2方法

1.2.1精液分析患者禁欲2～7 d手淫法無菌采集精液，按世界衛(wèi)生組織標準[5]稱量精液體積，分析精子形態(tài)，精子濃度及前向運動精子比例采用計算機輔助分析方法。

1.2.2PR M1 C321A位點基因型分析應(yīng)用DNA提取試劑盒由精液標本分離DNA（北京康為世紀生物科技有限公司），正向引物：5'-CAGAGTTCCACCT GCTCACA-3'，反向引物：5'-TCCCCTCTCAAGAACA AGGA-3'，建立25μl聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體系，包括2μl模板DNA，12.5μl高保真2×Gold Star Taq Master Mix（北京康為世紀生物科技有限公司），正、反向引物各1μl，雙蒸水8.5μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸5min。擴增產(chǎn)物為514bp，將擴增得到的PCR產(chǎn)物純化（北京天根生化科技有限公司凝膠純化試劑盒）后雙向測序（上海英濰捷基公司）及酶切（Bst UI酶60℃消化過夜），酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，χ2檢驗用來檢測SNP位點在檢測人群中的分布是否符合哈迪-溫伯格定律并檢測基因型在不育組及對照組中的分布頻率、關(guān)聯(lián)比值比（odds ratio，OR）及95%置信區(qū)間（confidence interval，CI），單因素方差分析用于比較不同基因型對常規(guī)精子參數(shù)的影響，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1　目的片段限制性酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果

2　結(jié)果

2.1PRM1基因C321A位點基因型分析

生育及不育男性組均可檢測到CC、CA、AA 3種基因型，限制性酶切及DNA測序結(jié)果分別見圖1、2。

2.2PRM1基因C321A位點多態(tài)性與漢族男性生育力的相關(guān)性分析

經(jīng)檢測，PRM1基因C321A位點基因型頻率在檢測標本中符合哈迪-溫伯格平衡定律。不育組男性AA基因型頻率為8.05%，高于生育組（2.33%）（P< 0.01），分析表明AA基因型可增加男性不育癥的發(fā)病風(fēng)險[＾OR=4.24（95%CI：1.33，13.51）]。見表1。

2.3PRM1基因C321A位點多態(tài)性對常規(guī)精液參數(shù)的影響

PRM1基因C321A位點多態(tài)性對常規(guī)精液參數(shù)的影響見表2。AA基因型的前向運動精子比例低于CC基因型（P=0.023），正常精子形態(tài)比例亦低于CC基因型（P=0.017），而精子總數(shù)在基因型間無差異。箱線圖分析亦表明CC基因型前向運動精子比例及正常精子形態(tài)比例中位數(shù)均高于AA基因型（見圖3）。

圖2　目的片段PRM1 C321A位點DNA測序結(jié)果

表1　生育組及不育組男性PRM1 C321A基因型頻率分布 例（%）

表2　不同PRM1 C321A基因型對常規(guī)精液參數(shù)的影響（±s）

表2　不同PRM1 C321A基因型對常規(guī)精液參數(shù)的影響（±s）

注：?與CC比較，P<0.05

PRM1C321A基因型正常精子形態(tài)比例/% CC　532.41±333.00　43.18±15.11　6.57±3.24 CA　541.65±360.91　40.35±16.32　6.65±3.40 AA　554.80±501.53　30.44±15.10?　3.78±2.11?精子總數(shù)/ ×106個前向運動精子比例/%

圖3　PRM1 C321A基因型與常規(guī)精液參數(shù)間的箱線圖分析

3　討論

據(jù)報道不孕不育患者占已婚夫婦的10%～15%，男性因素造成的不育達50%[6]，遺傳異常是男性不育的主要因素[7]。魚精蛋白是精子核中主要的DNA結(jié)合蛋白，其基因突變可致精子發(fā)生異常、印跡缺陷，誘導(dǎo)精子染色質(zhì)損傷及DNA斷裂，與男性不育密切相關(guān)[1]。近年來多項研究探討魚精蛋白基因多態(tài)性與男性不育的相關(guān)性，結(jié)果因研究對象遺傳背景差異而不同。本文首次分析PRM1 C321A位點與漢族男性生育力的關(guān)系。

C321A多態(tài)性位點位于PRM1基因編碼區(qū)，其主要基因型為CC基因型[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，AA基因型是漢族男性不育的易感基因型，其不育癥的發(fā)病風(fēng)險為CC基因型的4.24倍，該結(jié)果與先前報道不一致[1，3]，研究對象的選擇標準及遺傳背景差異可能是導(dǎo)致不同結(jié)論的原因。FANG等[6]指出由于單一多態(tài)性的低顯性遺傳效應(yīng)通常取決于與其他多態(tài)性位點的相互作用及包括飲食、生活方式等在內(nèi)的特定環(huán)境因素的綜合影響，因此遺傳變異的影響可能為其他尚未發(fā)現(xiàn)的致病因素所掩蓋。

研究指出>90%的男性不育是由精液質(zhì)量差引起的，PRM基因多態(tài)性改變可影響常規(guī)精液參數(shù)。PRM1 C190A位點多態(tài)性改變與西班牙男性精子頭部異常相關(guān)[8]，HE等[9]指出PRM1 rs35576928位點多態(tài)性改變與漢族男性重度少精癥相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)由PRM1 230A>C、PRM2 298G>C及373C>A組成的ACC單倍型與精子濃度及總數(shù)間存在顯著連鎖不平衡，ACC單倍型精子濃度、總數(shù)為非ACC型的2倍[10]，說明PRM1/PRM2多態(tài)性在調(diào)控精子發(fā)生中發(fā)揮作用。本研究分析PRM1 C321A位點多態(tài)性改變對常規(guī)精液參數(shù)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各基因型間精子總數(shù)無差異，但AA基因型中前向運動精子比例及正常精子形態(tài)比例均低于CC基因型，由于前向運動精子及正常形態(tài)精子比例是衡量男性生育能力的重要指標[5]，因此其可能是AA基因型男性生育力下降的主要因素。

正常精子發(fā)生過程中，85%～95%的精子DNA與魚精蛋白相互結(jié)合[11]，魚精蛋白表達異常與精子形態(tài)異常、精子總數(shù)及活力下降相關(guān)[12-13]，研究發(fā)現(xiàn)，魚精蛋白基因編碼區(qū)及非編碼區(qū)基因的微小改變可導(dǎo)致魚精蛋白的表達異常[9]。由上推斷，C321A位點多態(tài)性改變可能引起魚精蛋白表達量異常，從而影響精子運動能力及正常形態(tài)比例，造成男性生育力下降。

綜上所述，PRM1 C321A多態(tài)性改變與漢族男性生育力相關(guān)。AA基因型可使精子前向運動能力及正常形態(tài)比例顯著降低，可能是導(dǎo)致男性不育的重要原因。

參考文獻：

[1]SIASI E,ALEYASIN A,MOWLA J,et al.Association study of six SNPs in PRM1,PRM2 and TNP2 genes in iranian infertile men with idiopathic azoospermia[J].Iran J Reprod Med,2012,10(4): 329-336.

[2]CHO C,JUNG H H,WILLIS W D,et al.Protamine 2 deficiency leads to sperm DNA damage and embryo death in mice[J].Biol Reprod,2003,69(1):211-217.

[3]TANAKA H,MIYAGAWA Y,TSUJIMURA A,et al.Single nucleotide polymorphisms in the protamine-1 and-2 genes of fertile and infertile human male populations[J].Mol Hum Reprod, 2003,9(2):69-73.

[4]IGUCHI N,YANG S,LAMB D J,et al.An SNP in protamine 1:a possible genetic cause of male infertility[J].J Med Genet, 2006,43(4):382-384.

[5]World Health Organization.WHO laboratory mannual for the examination and processing of human semen[M].Cambridge University Press:5th ed,New York,2010.

[6]FANG J,WANG S,WANG H,et al.The Cytochrome P4501A1 gene polymorphisms and idiopathic male infertility risk:a metaanalysis[J].Gene,2014,535(2):93-96.

[7]GE Y Z,XU L W,JIA R P,et al.Association of polymorphisms in estrogen receptors(ESR1 and ESR2)with male infertility:a meta-analysis and systematic review[J].J Assist Reprod Genet, 2014,31(5):601-611.

[8]GAZQUEZ C,ORIOLA J,De MATEO S,et al.A common protamine 1 promoter polymorphism(-190 C->A)correlates with abnormal sperm morphology and increased protamine P1/P2 ratio in infertile patients[J].J Androl,2008,29(5):540-548.

[9]HE X J,RUAN J,DU W D,et al.PRM1 variant rs35576928 (Arg>Ser)is associated with defective spermatogenesis in the Chinese Han population[J].Reprod Bio Med Online,2012,25(6): 627-634.

[10]TUTTELMANN F,KRENKOVA P,ROMER S,et al.A common haplotype of protamine 1 and 2 genes is associated with higher sperm counts[J].Int J Androl,2010,33(1):240-248.

[11]BALHORN R.The protamine family of sperm nuclear proteins[J]. Genome Biol,2007,8(9):227.

[12]UTSUNO H,MIYAMOTO T,OKA K,et al.Morphological alterations in protamine-deficient spermatozoa[J].Hum Reprod, 2014,29(11):2374-2381.

[13]FRANCIS S,YELUMALAI S,JONES C,et al.Aberrant protamine content in sperm and consequential implications for infertility treatment[J].Hum Fertil(Camb),2014,17(2):80-89.

（申海菊編輯）

中圖分類號：R 698.2

文獻標識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.13.009

文章編號：1005-8982（2016）13-0048-04

收稿日期：2015-12-01

*基金項目：河北省人口和計劃生育委員會基金（No：2013-A08）

[通信作者]楊雪梅，E-mail：meicherrymissyou@163.com

Association ofPRM1gene polymorphism with male infertility in Chinese Han population*

Jun Li，F(xiàn)ang Liu，Ya-man Song，Yu-zhe Tan，Xue-mei Yang，Yan-ping Feng
（Department of Reproductive Medicine，the First Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang，Hebei 050031，China）

Abstract:Objective To determine the association of single nucleotide polymorphism（SNP）locus C321A in human protamine 1（PRM1）with male infertility in Chinese Han population.Methods A total of 174 infertile men were recruited as the observation group and 172 fertile men were recruited as the control group. Routine semen analysis was performed.Restricted enzyme digestion and DNA direct sequencing of C321A in PRM1gene of the infertile and fertile men were conducted to identify the genotype of C321A SNP locus. Results The frequency of AA genotype ofPRM1C321A was significantly different between the infertile men （8.05%）and the fertile men（2.33%，P＜0.01）and it was associated with increased risk of male infertility （OR＾ =4.24；95%CI:1.33，13.51）.Moreover，it was discovered that sperm progressive motility as well as normal morphology rate of AA genotype were dramatically decreased compared with that of CC genotype（P＜0.05），which would probably lead to infertility.ConclusionsPRM1C321A polymorphism is associated with male infertility as well as routine semen characteristics in Chinese Han population.

Keywords:PRM1；single nucleotide polymorphism；male infertility；genetic susceptibility