L-核糖的生物合成及其在藥物中的應(yīng)用

王　靜，武首香

(1.天津市輕工業(yè)化學(xué)研究所有限公司，天津 300350；2.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300350)

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L-核糖的生物合成及其在藥物中的應(yīng)用

王靜1,2，武首香2

(1.天津市輕工業(yè)化學(xué)研究所有限公司，天津 300350；2.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300350)

摘要：L-核糖是一種重要的藥物中間體。綜述了以核糖醇及L-阿拉伯糖為原料的L-核糖的生物合成方法，介紹了L-核糖在L-核苷類藥物、糖綴合物、寡核苷酸中的應(yīng)用進展。

關(guān)鍵詞：L-核糖；生物合成；L-核苷類藥物；糖綴合物；寡核苷酸

核糖是一種典型的五碳糖，是與生物遺傳相關(guān)的重要稀少糖類，其在生理上具有十分特殊的作用，是各種核糖核酸、核苷酸輔酶、ATP及NADP的組成成分。L-核糖是D-核糖的手性對映異構(gòu)體，在自然界中并不存在，一般只能通過合成的方法得到[1]，其分子結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1　L-核糖的分子結(jié)構(gòu)1　The molecular structure of L-ribose

合成L-核糖屬于國際上功能糖領(lǐng)域的尖端技術(shù)，目前主要有化學(xué)合成法與生物合成法兩種?；瘜W(xué)合成法路線繁雜，所需試劑昂貴，副產(chǎn)物多，不利于L-核糖分離，最終產(chǎn)率不高，且存在環(huán)境污染等問題[2]；與化學(xué)合成法相比，生物合成法以天然糖為原料，生產(chǎn)條件溫和，副產(chǎn)物少，利于L-核糖的分離和回收再利用，綠色環(huán)保，更具工業(yè)化應(yīng)用前景。

1L-核糖的生物合成

目前，生物合成法主要是以核糖醇及L-阿拉伯糖為原料，經(jīng)酶催化合成L-核糖。

1.1以核糖醇為原料合成L-核糖

1999年，Kawaguchi等[3]報道了L-核糖異構(gòu)酶的制備，使得以核糖醇為原料合成L-核糖得以實現(xiàn)。核糖醇可經(jīng)兩種途徑合成L-核糖，一種是由微生物細胞先將核糖醇轉(zhuǎn)化為L-核酮糖，再經(jīng)L-核糖異構(gòu)酶(L-RI)催化生成L-核糖(圖2)。這種方法主要由Izumori課題組[4-5]提出，利用醋酸桿菌將核糖醇轉(zhuǎn)化為L-核酮糖，再通過大腸桿菌表達來源于不動桿菌DL-28的L-RI使L-核酮糖轉(zhuǎn)化為L-核糖，轉(zhuǎn)化達到平衡時，L-核糖與L-核酮糖之比為70∶30。隨后，Izumori等[6]又發(fā)現(xiàn)了源于解鳥氨酸拉烏爾菌MB426的L-RI，與DL-28的L-RI相比，其熱穩(wěn)定性更好，相同條件下，溫度可提高15 ℃。核糖醇市場價格貴且較難從天然物質(zhì)中分離得到，因此該法生產(chǎn)L-核糖的成本較高。為解決這一問題，Kawaguchi等[7]在該法的基礎(chǔ)上，以價格相對較低的葡萄糖為原料，經(jīng)真菌類絲孢酵母發(fā)酵生產(chǎn)核糖醇后，再用葡萄糖桿菌的細胞和L-RI將核糖醇分兩步轉(zhuǎn)化為L-核糖，反應(yīng)24 h后，1 L發(fā)酵液中可含39.1 g L-核糖、16.0 g L-核酮糖和7.0 g二羥基丙酮，有效地降低了生產(chǎn)成本，使L-核糖的工業(yè)化生產(chǎn)成為可能。

圖2　兩步法核糖醇轉(zhuǎn)化L-核糖Fig.2　Two-step conversion of L-ribose from ribitol

Woodyer等[8]提出了另一種新的生物合成途徑(圖3)，即通過大腸桿菌表達來自于芹菜籽中的甘露糖醇-1-脫氫酶(MDH)，可將核糖醇直接轉(zhuǎn)化為L-核糖，100 g·L-1核糖醇72 h轉(zhuǎn)化率可達55%，遠高于其它生物合成法。但該法在誘導(dǎo)過程中需改變溫度及使用昂貴的誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷，因而限制了其發(fā)展。為解決這些問題，Woodyer課題組[9]展開了深入研究，在原有的基礎(chǔ)上采取易錯聚合酶鏈反應(yīng)(error-prone PCR)使大腸桿菌基因突變，并表達來自于芹菜籽中的MDH，改善了MDH的熱穩(wěn)定性和活性，同時提高了L-核糖產(chǎn)率。

1.2以L-阿拉伯糖為原料合成L-核糖

相比核糖醇，L-阿拉伯糖是一種來源豐富、價格低廉的原料，其液體形式的市場價僅為0.1美元·kg-1，而L-核糖市場價大約為500美元·kg-1[10]，因此，以L-阿拉伯糖為原料合成L-核糖是目前最可能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的一種方法。L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為L-核糖主要有兩種路線：一種是Helanto等[11]利用L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(L-AI)和不同酶源(大腸桿菌和植物乳桿菌)的L-RI催化合成L-核糖，轉(zhuǎn)化率均為20%左右；另一種是利用L-AI和甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶(MPI)催化得到L-核糖，其產(chǎn)率高于前一途徑。如圖4所示。

圖4　L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)化L-核糖的兩種路線Fig.4　Two routes of conversion of L-ribose from L-arabinose

Yeom等[12]對MPI展開了深入研究，將從枯草芽孢桿菌獲得的MPI基因轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中誘導(dǎo)表達，得到的MPI表現(xiàn)出對L-核酮糖的高度選擇特異性，L-核酮糖的單步反應(yīng)最高轉(zhuǎn)化率達71%，遠遠高于L-RI。在此基礎(chǔ)上，獲得了R142N突變體MPI，L-核糖產(chǎn)率是野生型MPI的1.5倍[13]。Lim等[14]從熱脫硝芽孢桿菌中獲得三點組合突變體MPI(W17Q-N90A-L129F)，酶的最高催化效率可達1 120 L·mmol-1·s-1，L-核糖產(chǎn)率可達213 g·L-1·h-1。Kim等[15]將源于熱脫硝芽孢桿菌的L-AI和MPI同時轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中誘導(dǎo)表達，通過固定細胞催化L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為L-核糖，轉(zhuǎn)化率達33%，是此途徑轉(zhuǎn)化率報道的最高值。

目前，生產(chǎn)成本較高和產(chǎn)率較低是制約L-核糖進一步工業(yè)化發(fā)展的主要瓶頸，而解決以上問題的關(guān)鍵是催化所用的酶，因此生物合成法目前的研究熱點主要集中在熱穩(wěn)定性好、成本低、高產(chǎn)酶的菌株的開發(fā)和異構(gòu)酶的表征研究[10，16-18]，以期實現(xiàn)低成本L-核糖的規(guī)?；a(chǎn)。

2L-核糖在藥物中的應(yīng)用

L-核糖可代替D-核糖導(dǎo)入生物機體中，在細胞內(nèi)合成L-核糖核酸[19]，而L-核糖核酸可在生物機體內(nèi)被異常細胞利用，通過破壞病毒轉(zhuǎn)錄，干擾或終止病毒核酸的合成而具有抗病毒作用[20]，或通過干擾腫瘤DNA的合成，影響核酸的轉(zhuǎn)錄過程，抑制蛋白質(zhì)的合成，從而達到治療腫瘤的效果，因此，L-核糖的衍生物在臨床上可用作治療病毒和腫瘤的藥物。

2.1L-核糖在L-核苷類藥物中的應(yīng)用

20世紀90年代，L-核苷類化合物被證實了在抗肝炎B病毒(HBV)、肝炎C病毒(HCV)、肝炎D病毒(HDV)、人類皰疹病毒第四型病毒(EBV)、巨細胞病毒(CMV)等方面的強大潛能[21-22]。目前已進入臨床階段的可由L-核糖合成的L-核苷類藥物見圖5。

圖5　由L-核糖制備的L-核苷類藥物Fig.5　L-Nucleosides medicine prepared from L-ribose

克拉夫定即氟代替比夫定，是由University of Georgia 和Yale University 開發(fā)的一種抗HBV的長效制劑，目前處于Ⅲ期臨床階段。1995年，Chu等[23]以L-核糖為起始原料首次合成了克拉夫定，并通過研究其對2.2.15、H1、MT2、CEM細胞的作用，發(fā)現(xiàn)克拉夫定對HBV和HDV具有高度的抗性且副作用小。隨后，通過改變尿嘧啶和胸腺嘧啶的取代基，合成了一系列克拉夫定類似物，研究發(fā)現(xiàn)，僅2種嘧啶衍生物2′-脫氧-2′-氟代-β-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶(L-FAC)和2′-脫氧-2′-氟代-5-碘-β-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶(L-FIAC)具有較強的抗HBV活性，但活性遠遠低于克拉夫定[24]，其結(jié)構(gòu)見圖6。

圖6　新型L-核苷類化合物結(jié)構(gòu)Fig.6　The structure of the new L-nucleosides

Koszalka等[25]開發(fā)了一種抗CMV藥物馬里巴韋，該藥物具有更高的抗巨細胞病毒潛力，細胞毒性小且安全性高，對CMV病毒抗性專一，目前處于Ⅲ期臨床階段。

左利巴韋林是利巴韋林的左旋異構(gòu)體，是一種抗HCV藥物，與目前使用的利巴韋林相比具有更好的抗HCV活性和更高的安全性。但臨床研究發(fā)現(xiàn)其口服生物利用度較低[26]。Huang等[27]將左利巴韋林與纈氨酸進一步反應(yīng)，酯化得到R1518，提高了其口服生物利用度。目前，左利巴韋林處于Ⅲ期臨床階段，R1518處于Ⅱ期臨床階段。

2.2L-核糖在糖綴合物中的應(yīng)用

糖綴合物是指糖與蛋白質(zhì)、多肽、脂質(zhì)、核酸和抗體等生物分子以及其它小分子以共價鍵相互連接而形成的化合物，具有多種生物功能，在醫(yī)藥領(lǐng)域逐步得到應(yīng)用，如研究發(fā)現(xiàn)地洋黃毒苷不僅可以治療心血管疾病，還具有抗癌活性。Thorson等[28]通過L-核糖修飾地洋黃毒苷得到一種地洋黃毒苷類似物，研究發(fā)現(xiàn)其對人體癌細胞和腫瘤都具有細胞毒活性，其結(jié)構(gòu)見圖7。

圖7　L-核糖修飾的地洋黃毒苷類似物Fig.7　Digitoxin analogues modified by L-ribose

2.3L-核糖在寡核苷酸中的應(yīng)用

寡核苷酸是一類只有20個以下堿基的短鏈核苷酸的總稱。調(diào)控寡核苷酸用于抑制RNA片段，防止其翻譯成蛋白，在抑制癌細胞活動方面能起一定的作用。早期，L-核糖被應(yīng)用在寡核苷酸領(lǐng)域主要是為了研究RNA的結(jié)構(gòu)和生物功能[29]。隨著寡核苷酸在臨床藥物中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)寡核苷酸對核苷酶的耐受性較差，其應(yīng)用受到限制。而以L-核糖為起始原料合成的L-RNA寡核苷酸具有較好的核苷酶耐受性，避免了其在未到達體內(nèi)病灶時就被核苷酶降解[30]，從而擴寬了L-核糖在寡核苷酸上的應(yīng)用。

3結(jié)語

在L-核糖的合成方法中，生物合成法是一種綠色方法，對環(huán)境污染小，具有化學(xué)合成法所無法比擬的優(yōu)越性，發(fā)展前景誘人。隨著低毒高活性的L-核苷類藥物、寡核苷酸等的生產(chǎn)和新藥研發(fā)的需求，L-核糖的需求量將日益增多，其生物合成研究也將取得更大的進展。

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基金項目：天津市科技計劃項目(15YFFCTG00130)

收稿日期：2016-03-17

作者簡介：王靜(1978-)，女，遼寧沈陽人，博士，副教授，研究方向：精細化學(xué)品合成與應(yīng)用，E-mail：wangjing-1110@163.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.07.002

中圖分類號：TQ 464.6

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)07-0007-04

Biosynthesis of L-Ribose and Its Application in Pharmaceuticals

WANG Jing1,2，WU Shou-xiang2

(1.TianjinLightIndustryChemicalResearchInstituteCo.,Ltd.,Tianjin300350,China;2.TianjinModernVocationalTechnologyCollege,Tianjin300350,China)

Abstract：L-Ribose is an important pharmaceutical intermediate.The biosynthesis methods for L-ribose with ribitol or L-arabinose as a raw material were reviewed,and its applications in L-nucleosides medicine,glycoconjugates and oligonucleotides were introduced.

Keywords：L-ribose;biosynthesis;L-nucleosides medicine;glycoconjugate;oligonucleotide

王靜，武首香.L-核糖的生物合成及其在藥物中的應(yīng)用[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(7)：7-10，14.