大米鎘結合蛋白的分離純化及純度鑒定

陳 露，陳季旺，2，*，蔡 俊，丁文平，2，吳永寧，3（.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2.農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430023；3.國家食品安全風險評估中心，北京 0002）

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大米鎘結合蛋白的分離純化及純度鑒定

陳 露1，陳季旺1，2，*，蔡 俊1，丁文平1，2，吳永寧1，3
（1.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2.農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430023；3.國家食品安全風險評估中心，北京 100021）

摘 要：采用石墨爐原子吸收光譜法（graphite furnace atomic absorption spectrometry，GFAAS）測定不同品種、不同加工精度大米及大米4 種蛋白質中的鎘含量。選用鎘含量較高的大米為實驗原料，采用Osborne分級法提取大米中的4 種蛋白質（清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白），以及超濾、離子交換色譜從鎘含量較高的大米蛋白中分離純化出均一純度的大米鎘結合蛋白（rice Cd-binding protein，RCBP），十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）鑒定RCBP的純度及測定分子質量。結果表明：秈米中鎘含量高于糯米及粳米；隨著加工精度的增加，同種大米中的鎘含量依次降低。4 種大米蛋白中的鎘含量分別為0.66、0.31、0.63、0.23 μg/g，清蛋白中鎘含量最高。超濾分離大米清蛋白（rice albumin，RA）得到大米超濾清蛋白（rice ultrafiltration albumin，RUA），離子交換色譜純化RUA得到目標鎘結合蛋白（組分c），SDS-PAGE鑒定組分c為單一條帶，分子質量為14 kD。

關鍵詞：大米鎘結合蛋白；分離純化；離子交換色譜；分子質量

引文格式：

陳露， 陳季旺， 蔡俊， 等.大米鎘結合蛋白的分離純化及純度鑒定［J］.食品科學， 2016， 37（13）: 60-64.DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201613011. http://www.spkx.net.cn

CHEN Lu， CHEN Jiwang， CAI Jun， et al.Separation， purification， and purity identification of Cd-binding protein from rice［J］.Food Science， 2016， 37（13）: 60-64.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613011.http://www.spkx.net.cn

近年來我國出現(xiàn)的鎘污染問題有許多報道，有針對性的檢測和研究工作開展較多［1］。研究者對我國20世紀80年代確認的南方某省的土壤鎘污染進行了研究，檢測了蔬菜、糧食、肉類、禽蛋等樣品中的鎘含量，研究結果顯示肉類、禽蛋樣品中鎘含量均未超標，不同種類的蔬菜鎘含量的超標率各不相同，糧食中的大米鎘含量的超標率高達63.5%［2］，大米中重金屬超標已是迫切需要解決的問題［3］。

鎘可與食品成分結合呈現(xiàn)絡合態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)污染地區(qū)貽貝體內的鎘以與分子質量約60 kD的蛋白質結合形態(tài)存在［4］；大豆中的鎘與蛋白質以結合的形態(tài)存在，其分子質量在150～200 kD以上，約占大豆總鎘的30%。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)大豆蛋白可絡合鎘從而緩解了毒性［5］，因此，研究大米鎘結合蛋白（rice cadmium binding protein，RCBP）具有重要的現(xiàn)實意義和實際價值。

目前國內外對鎘與不同來源的蛋白質結合形成的鎘結合蛋白已有很多報道，已發(fā)現(xiàn)了海洋動物［6-8］、昆蟲［9］、小鼠［10］等動物源以及大豆［5］、亞麻籽［11］、玉米［12］、柱狀田頭菇［13］等植物源鎘結合蛋白，其中富含巰基、能螯合大量金屬離子的金屬硫蛋白的研究較多，研究方法也比較成熟。1957年，鎘結合蛋白首次由Margoshes等［14］從馬的腎臟皮質中分離得到，分析成分發(fā)現(xiàn)該鎘結合蛋白質中硫元素含量較高。Pedersen等［15］依次采用離子交換樹脂樹脂Q Sepharose、凝膠層析Superdex 30純化大麥蟲中的鎘結合蛋白，得到一個表觀分子質量為7 500 D的鎘結合蛋白；Winge等［10］采用Sephadex G-75純化大鼠肝臟中的鎘結合蛋白，分析氨基酸組成發(fā)現(xiàn)該鎘結合蛋白是金屬硫蛋白。但植物源鎘結合蛋白的研究處于初步階段，有關RCBP的研究未見報道。孔慶新［16］和楊居榮［17］等的研究分析了稻谷中鎘的分布位置及大米中鎘以結合蛋白質的方式存在，尚未分析鎘結合蛋白的理化性質及鎘與大米蛋白的結合機理。

本實驗通過分析不同品種及加工精度大米中的鎘含量，選用一種鎘含量較高的大米為原料。根據(jù)Osborne分級法提取大米中的4 種蛋白質組分：清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，分析4 種蛋白質組分中的鎘含量。提取鎘含量較高的大米蛋白組分，經(jīng)超濾分離，離子交換色譜純化，制備出純度均一的RCBP，以期為研究RCBP的形成機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

X1～X5（秈米）、J1～J5（粳米）、N1～N5（糯米） 武漢市武商量販常青花園店；X6～X9（秈稻） 武漢市糧庫。

甘氨酸、考馬斯亮藍R-2 5 0、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、NaCl、鹽酸 國藥集團化學試劑有限公司；牛血清白蛋白 上海碧云天生物技術有限公司；三羥甲基氨基甲烷（tris（hydroxymethyl）metyl aminomethane，Tris） 美國Sigma公司；DEAE-Sephadex A-25 美國Pharmacia公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DDS-11C電導率儀 上海雷磁儀器廠；LD5-10型離心機 北京醫(yī)用離心機廠；LG-3型冷凍干燥機 蕪湖萬通集團；Φ3.0 cm×30 cm玻璃層析柱 武漢集思儀器設備有限公司；HD-3紫外檢測儀、BSZ-100自動部分收集器、HL-2S恒流泵 上海滬西分析儀器廠；FD-1冷凍干燥機 天津儀器公司；TAS-990原子吸收光譜儀（配GFH-990石墨爐） 北京普析通用儀器有限責任公司；Bio-Rad Mini-PROTEAN-3電泳儀（配電泳槽） 美國Bio-Rad公司；超濾裝置（膜面積為0.2 m2，截留分子質量5 000 D） 上海亞東核級樹脂有限公司；RE52CS旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 大米及其蛋白質中鎘含量的測定

采用石墨爐原子吸收光譜法（graphite furnace atomic absorption spectrometry，GFAAS），濕法消化［18］。

1.3.2 不同品種大米選取

選取秈米、粳米和糯米各3 種，大米去雜質，超純水洗凈，晾干，磨碎，過80 目篩，貯藏于密封袋中，測定其鎘含量。

1.3.3 不同加工精度大米制備

碾米：分別設定不同的檢驗精米機碾白時間，每次用天平稱取20 g糙米倒入檢驗精米機，碾削得到精米，在這一過程中碾米時間不同，得到碾削程度不同的精米。

檢驗：采用品紅石碳酸溶液染色法［19］對所有大米樣品進行樣品加工精度等級判斷，分別制備出糙米、一等米、二等米和三等米，大米去雜質，超純水洗凈，晾干，磨碎，過80 目篩，貯藏于密封袋中，測定不同加工精度大米的鎘含量。

1.3.4 4 種大米蛋白組分的提取

參考Osborne分級法提取大米中的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白組分，具體提取步驟見圖1［20］。測定4 種大米蛋白組分的鎘含量。

1.3.5 超濾分離

采用上海亞東核級樹脂有限公司生產(chǎn)的內壓式聚砜中空纖維超濾膜，膜面積為0.2 m2，截留分子質量5 000 D。取4 種大米蛋白中鎘含量最高，為0.7 mg/mL大米蛋白液5 L，超濾膜對該大米蛋白液分離、濃縮，濃縮倍數(shù)為5 倍，測定超濾濃縮液中蛋白質及鎘含量。

1.3.6 離子交換色譜純化

采用DEAE-Sephadex A-25多孔凝膠作為固定相，純化色譜條件：先用起始緩沖液進行洗脫，起始緩沖液為pH 8.0 Tris-HCl緩沖液，洗脫體積為100 mL；再用離子濃度從0～1 mol/L NaC1、0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液線性洗脫，洗脫體積為450 mL；最后用2 mol/L NaC1、0.05 mol/L Tris-HC1緩沖液進行洗脫，洗脫體積為50 mL。洗脫速率為1.5 mL/min、檢測波長為280 nm。

利用連續(xù)梯度混合器，分步收集100 個組分，每個組分相當于約1%總梯度體積，在280 nm波長處測各組分的吸光度以確定蛋白質峰。

1.3.7 透析脫鹽

將透析袋放在3 L盛滿蒸餾水的燒杯中，置室溫下透析，每隔4～5 h更換一次燒杯中的蒸餾水，更換兩次，再隔夜透析一次，換水前后均測電導率，直至透析外液的電導率接近蒸餾水時，終止透析。

1.3.8 干燥

采用旋轉蒸發(fā)儀，水浴溫度設為40 ℃，蒸發(fā)濃縮除去大部分水分。先將濃縮好的樣品置于－18 ℃冷凍過夜后，置于真空冷凍干燥機中冷凍干燥。

1.3.9 SDS-PAGE分析

蛋白質質量濃度均為10 mg/mL的提取、超濾和離子交換層析制備的RCBP分別于1.5 mL離心管中，加入5×SDS的上樣緩沖液20 μL，混勻，沸水浴10 min，冷卻待用。將10 μL樣品注入樣品池，電壓先調到60 V，40 min后改為110 V。采用12%分離膠、5%濃縮膠，用0.1%考馬斯亮藍R-250染色，10%醋酸-5%乙醇洗脫液脫色，直至蛋白條帶清晰［19］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)應用Excel軟件、Origin軟件及SPSS軟件進行處理和分析。采用方差分析（analysis of variance，ANOVA），并采用Duncan's檢驗進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同品種和加工精度大米的鎘含量分析

采集15 個武漢當?shù)厥惺鄢Ｓ么竺讟悠?，采用GFAAS法測定其鎘含量，測定結果見表1。單樣本K-S檢驗分析大米中鎘含量得：P＞0.05，即數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，其鎘含量范圍為21.86～213.43 μg/kg，平均值為97.14 μg/kg，中位數(shù)為78.33 μg/kg，平均值和中位數(shù)均低于國家標準限量（200 μg/kg）［21］，20%秈米樣品鎘含量超標。

從品種上分，粳米的鎘含量范圍為21.86～80.94 μg/kg，平均值為4 9.9 3 μ g/k g，秈米的鎘含量范圍為151.74～213.43 μg/kg，平均值為176.80 μg/kg，糯米的鎘含量范圍為26.51～108.50 μg/kg，平均值為64.72 μg/kg，根據(jù)現(xiàn)有大米樣品分析結果得出，秈米的鎘含量高于粳米和糯米，糯米的鎘含量高于粳米。

注：表中結果均以干基計。下同。

選取4 種秈米，由糙米依次加工成三等大米、二等大米和一等大米，測定其鎘含量，結果見表2。隨著加工精度的增加，同種大米中的鎘含量依次降低，不同品種的大米降低程度不同，4 種不同加工精度大米中的鎘平均值按照糙米、三等大米、二等大米、一等大米的順序分別為215.31、173.64、156.06、142.72 μg/kg，糙米和一等大米差異顯著（P＜0.05），說明加工精度在一定程度上影響了大米中的鎘含量。其中，將糙米加工到一等大米，能顯著性降低大米中鎘含量。這可能是大米中的有機鎘主要是鎘結合蛋白，蛋白質在稻米中呈不均勻分布，在胚及糊粉層中含量較高，胚乳中較低，一等大米主要是稻米的胚乳部分，90%以上的糊粉層及胚被除去。但糙米的平均值為215.31 μg/kg，高于國家標準限量（200 μg/kg）［21］，因此選用秈糙米研究鎘結合蛋白的形成機理具有現(xiàn)實意義。本研究選取鎘含量最高的秈糙米X9為實驗原料，提取鎘結合蛋白。

注：同行小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

2.2 4 種大米蛋白組分中的鎘含量

根據(jù)鎘Osborne分級法提取4 種大米蛋白組分，測定鎘含量，結果見表3。鎘在4 種大米蛋白組分中的含量差異明顯，鎘含量分別為0.66、0.31、0.63、0.23 μg/g，清蛋白中鎘含量最高，其次為醇溶蛋白、球蛋白、谷蛋白。與楊居榮等［17］得出可溶于水的清蛋白中鎘的濃度較高的結論類似。該結果表明鎘更易與清蛋白和醇溶蛋白相結合，因此制備鎘結合蛋白時，對清蛋白進行分離純化更容易得到目標鎘結合蛋白。

表 3 4 種大米蛋白中鎘含量（x±s，n=3）Table 3 Cadmium contents in four rice proteins （x±s，n= 3）蛋白質種類 蛋白質質量/g 鎘質量/μg 鎘與蛋白質質量比/（μg/g）清蛋白 0.66±0.01 0.44±0.00 0.66球蛋白 0.81±0.01 0.25±0.00 0.31醇溶蛋白 0.44±0.01 0.28±0.00 0.63谷蛋白 5.19±0.02 1.19±0.01 0.23

2.3 超濾前后清蛋白的成分變化

大米清蛋白（rice albumin，RA）超濾前后蛋白質和鎘質量變化結果見表4。蛋白質的損失率為6.65%，鎘的損失率為8.28%，蛋白質和鎘的損失率未超過10%，說明超濾可用于濃縮RA。

注：同列小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

2.4 離子交換色譜純化

采用DEAE-Sephadex A-25離子交換色譜純化大米超濾清蛋白（rice ultrafiltration albumin，RUA）中的鎘結合蛋白，RUA質量濃度為50 mg/mL，上樣量5 mL，收集不同的組分，結果見圖2。樣品的部分收集組分在280 nm波長處的吸光度變化出現(xiàn)3 個紫外吸收峰，得到組分a、b、c。

2.5 純化各組分中蛋白質及鎘含量分析

離子交換色譜純化RUA得到的組分a、組分b和組分c及組分經(jīng)透析脫鹽、冷凍干燥得到固體組分a、組分b和組分c。取各組分0.1 g，測定其蛋白質質量和鎘含量，并計算各組分中蛋白質含量、鎘質量及每克蛋白質中含有的鎘質量，結果見表5。3 個組分的蛋白質含量差異不明顯，均為82 mg左右，而鎘含量差異明顯。組分a、組分b和組分c中，每克蛋白質中鎘質量分別為498.99、574.61 ng和2 309.95 ng，組分c中每克蛋白質中鎘質量是組分a、組分b的6 倍左右，即組分c的持鎘能力遠高于組分a和組分b，因此確定組分c是目標鎘結合蛋白，且DEAE-Sephedex A-25凝膠層析色譜可以用于RCBP的純化。

表 5 組分a、b、c中蛋白質和鎘的質量Table5 Contents of protein and cadmiumin fractions a， b and c樣品 蛋白質質量/mg 鎘質量/ng 鎘與蛋白質質量比/（ng/g）a 82.05 40.91 498.99 b 81.14 46.54 574.61 c 83.32 191.73 2 309.95

2.6 SDS-PAGE分析

采用SDS-PAGE鑒定RA、RUA和組分c的純度以及測定分子質量，RA、RUA和RCBP的SDS-PAGE圖譜如圖3、4所示。由圖3可知，RA、RUA在35、20、14 kD附近有條帶，在14 kD出現(xiàn)的條帶最清晰，RA的電泳結果與李亦蔚［22］報道的基本一致。組分c顯示出一個單一的條帶14 kD（圖4），去除了35、20 kD的蛋白質，說明該提取、分離及純化方法能制備出純度均一的RCBP，即組分c。Thomas等［23］從鱒魚的鰓部、肝臟組織中分離出分子質量分別為13.5 kD和14 kD的兩種非金屬硫蛋白。Meisch等［24］從菌類中提取出一種鎘結合蛋白，分子質量約12 kD。Dohi等［25］從海螺體內提取了分子質量分別為8 kD和13 kD的兩種鎘結合蛋白。楊紅玉等［26］通過鎘誘導綠藻中的蛋白質，成功提取了兩種分子質量分別為12.6 kD和12.0 kD的鎘結合蛋白。RCBP的分子質量與上述研究者研究的鎘結合蛋白的分子質量類似，是一種低分子質量的鎘結合蛋白。

3 結 論

分析15 種武漢當?shù)厥惺鄢Ｓ么竺讟悠分墟k含量顯示，秈米中鎘含量高于糯米及粳米；隨著加工精度的增加，糙米和一級大米差異顯著，說明品種和加工精度明顯影響大米中的鎘含量。清蛋白中鎘濃度最高，其次為醇溶蛋白、球蛋白、谷蛋白，表明鎘更易與清蛋白結合，因此制備鎘結合蛋白時，對清蛋白進行分離純化更容易得到目標鎘結合蛋白。采用超濾、離子交換色譜從RA中分離純化得到目標鎘結合蛋白（組分c），SDS-PAGE鑒定組分c為單一蛋白質組分，其分子質量為14 kD，說明超濾、離子交換色譜是分離純化RCBP的良好手段。

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DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613011

中圖分類號：TS254.4

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）13-0060-05

收稿日期：2015-12-26

基金項目：糧食公益性行業(yè)科研專項（201513006-3）；武漢輕工大學重大項目培育專項（2011Z05）；武漢市國際合作項目（201231234466）；湖北省自然科學基金面上項目（2014CFB888）；武漢輕工大學研究生創(chuàng)新基金項目（2012cx012；2013cx011）

作者簡介：陳露（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品營養(yǎng)與安全。E-mail：loiscl@126.com

*通信作者：陳季旺（1970—），男，教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)與安全。E-mail：jiwangchen1970@126.com

Separation， Purification， and Purity Identification of Cd-Binding Protein from Rice

CHEN Lu1， CHEN Jiwang1，2，*， CAI Jun1， DING Wenping1，2， WU Yongning1，3
（1.College of Food Science and Engineering， Wuhan Polytechnic University， Wuhan 430023， China；2.Hubei Collaborative Innovation Center for Processing of Agricultural Products， Wuhan 430023， China；3.National Center for Food Safety Risk Assessment， Beijing 100021， China）

Abstract:A graphite furnace atomic absorption spectrometry （GFAAS） method was used to determine the cadmium content in rice grains from different varieties and at milling levels， as well as in four rice seed storage proteins （albumin， globulin，prolamin and glutelin） obtained through the Osborne sequential extraction method.Moreover， rice cadmium-binding protein （RCBP） was separated and purified to homogeneity by using ultrafiltration and ion exchange chromatography.The purity and molecular mass of RCBP were identified.The results showed that the cadmium content in indica rice was higher than that in glutinous rice and japonica rice and the cadmium content in rice decreased with the increase of milling level.The cadmium contents of rice albumin， globulin， prolamin， and glutelin were 0.66， 0.31， 0.63 and 0.23 μg/g， respectively.RCBP （fraction c）with high purity and good homogeneity as well as molecular mass of 14 kD was prepared from rice albumin （RA）.

Key words:rice Cd-binding protein； separation and purification； ion exchange chromatography； molecular mass