姚惠琴, 黃　珊, 蘇巧玲, 史可人, 甘倩倩, 王明科

(1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 銀川 750004; 2. 寧夏大學(xué)能源化工國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 銀川 750021)

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基于硼酸-二醇特異性識(shí)別作用的層層組裝薄膜對(duì)肌紅蛋白的吸入及其電化學(xué)研究

姚惠琴1, 黃珊1, 蘇巧玲1, 史可人2, 甘倩倩1, 王明科1

(1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 銀川 750004; 2. 寧夏大學(xué)能源化工國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 銀川 750021)

摘要合成了既含有苯硼酸(PBA)基團(tuán)又含有羧酸基團(tuán)的聚電解質(zhì)PAA-PBA(PAA: 聚丙烯酸). 采用層層組裝(LbL)技術(shù), 利用PAA-PBA和葡聚糖(Dex)之間的硼酸-二醇特異性識(shí)別作用, 在熱解石墨電極(PG)表面構(gòu)筑了{(lán)PAA-PBA/Dex}nLbL薄膜, 該薄膜從溶液中吸入肌紅蛋白(Mb)形成{PAA-PBA/Dex}n-Mb薄膜. 采用循環(huán)伏安方法研究了{(lán)PAA-PBA/Dex}n薄膜中Mb的直接電化學(xué)及對(duì)氧氣和過(guò)氧化氫的電催化還原過(guò)程. 結(jié)果表明, 該薄膜為保持Mb的生物活性提供了良好的微環(huán)境, 是一種新型的可固定蛋白質(zhì)的LbL薄膜, 為設(shè)計(jì)基于酶的直接電化學(xué)生物傳感器提供了新思路.

關(guān)鍵詞直接電化學(xué); 電催化; 層層組裝; 硼酸-二醇特異性識(shí)別作用; 肌紅蛋白

氧化還原蛋白質(zhì)或酶在基底上的固定是不依賴于媒介體的電化學(xué)生物傳感器、 生物反應(yīng)器及其它生物裝置的重要前提, 已引起了研究者的廣泛關(guān)注[1]. 在固體表面固定酶或蛋白質(zhì)并有效實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)直接電化學(xué)的方法之一是將其固定在修飾于電極表面的薄膜中[2]. 在各種制備薄膜的方法中, 層層組裝(LbL)技術(shù)表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢(shì), 它能夠根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)的方案在納米或分子層次上控制薄膜的組成與厚度, 且組裝程序非常簡(jiǎn)便[3,4].LbL組裝的成膜驅(qū)動(dòng)力既包括靜電作用力也包括各種非靜電作用力, 如離子-偶極作用力、 氫鍵作用和特異性相互作用等[5,6]. 在各種特異性相互作用中, 硼酸基團(tuán)和二醇單元之間的相互作用在構(gòu)筑薄膜方面引起了許多研究者的興趣[7～12]. 苯硼酸(PBA)及其衍生物能夠與各種1,2-或1,3-順二醇化合物(如多元醇、 糖類化合物)之間形成共價(jià)鍵, 并生成五元或六元環(huán)狀的硼酯復(fù)合物[13]. 如聚乙烯醇或甘露糖可以與含有PBA基團(tuán)的聚電解質(zhì)構(gòu)筑LbL薄膜[10,11]. 1個(gè)單糖分子通常含有5個(gè)—OH基團(tuán), 而1個(gè)PBA基團(tuán)可以與2個(gè)—OH基團(tuán)結(jié)合, 因此它們可以形成1∶2型糖-PBA復(fù)合物[10,14]. 葡聚糖(Dex)是以葡萄糖為單體的聚多糖, 其分子骨架上含有多個(gè)可以與PBA基團(tuán)結(jié)合的葡萄糖單元[10,15]. 雖然Dex和PBA之間的特異性親和作用已有報(bào)道, 但是由Dex與含有PBA基團(tuán)的聚電解質(zhì)構(gòu)筑的蛋白質(zhì)層層組裝薄膜至今未見(jiàn)報(bào)道.

吸入型蛋白質(zhì)LbL薄膜是一種新型的蛋白質(zhì)LbL薄膜[3,16～18], 它通過(guò)將固體基底表面組裝的聚合物和/或納米粒子LbL薄膜浸泡在蛋白質(zhì)溶液中, 使蛋白質(zhì)自發(fā)吸入薄膜而形成. 與通常的直接用蛋白質(zhì)和其它組分構(gòu)筑的蛋白質(zhì)LbL薄膜相比, 吸入型蛋白質(zhì)LbL薄膜中的蛋白質(zhì)是自發(fā)地?cái)U(kuò)散進(jìn)入薄膜內(nèi)部, 并且獨(dú)立于LbL薄膜的組裝過(guò)程, 因此該方法在保持蛋白質(zhì)的原有結(jié)構(gòu)和生物活性方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn). 在電極上構(gòu)筑不同類型的吸入型蛋白質(zhì)LbL薄膜的研究已有報(bào)道, 并實(shí)現(xiàn)了氧化還原蛋白質(zhì)在該類型薄膜電極上的直接電化學(xué)[19,20].

本文首先通過(guò)氨基苯硼酸與聚丙烯酸(PAA)羧基之間的縮合反應(yīng)將PBA基團(tuán)接枝到PAA骨架上, 得到產(chǎn)物PAA-PBA[11]; 然后利用PAA-PBA與Dex之間的硼酸-二醇特異性識(shí)別作用, 在熱解石墨(PG)電極表面上組裝{PAA-PBA/Dex}nLbL薄膜, 最后再?gòu)娜芤褐形隡b, 制得{PAA-PBA/Dex}n-Mb薄膜. 該薄膜為保持Mb的生物活性提供了良好的微環(huán)境, 并實(shí)現(xiàn)了Mb在薄膜中的直接電化學(xué)及其對(duì)氧和過(guò)氧化氫的電催化還原, 擴(kuò)展了蛋白質(zhì)LbL薄膜成膜材料的范圍, 有助于發(fā)展新型的基于蛋白質(zhì)或酶直接電化學(xué)的電化學(xué)生物傳感器.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑

馬骨骼或肌肉肌紅蛋白(Mb, MW≈17800)、 3-氨基苯硼酸半硫酸鹽(APBA)、 聚丙烯酸(Mw≈100000, 質(zhì)量分?jǐn)?shù)35%水溶液)、 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES, 純度99.5%)、 N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、 N-羥基丁二胺磺酸鈉(NHS)、 葡聚糖(Mw≈200000)和殼聚糖(CS, 酰胺化程度大于85%, Mw≈200000)、 醋酸鈉和磷酸二氫鈉均為分析純, 購(gòu)自Sigma-Aldrich公司.K3Fe(CN)6、K4Fe(CN)6和過(guò)氧化氫(H2O2, 質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%)購(gòu)自北京化工廠. 緩沖溶液為0.1mol/L的醋酸鈉溶液(pH=4.0～6.0)、 0.05mol/L的磷酸二氫鈉溶液(pH≈7.0～8.5)和0.05mol/L的硼酸溶液(pH=9.0), 用稀HCl或KOH溶液調(diào)節(jié)到所需pH值, 緩沖溶液中均含有0.1mol/LNaCl. 所有溶液均用經(jīng)過(guò)離子交換和蒸餾純化的三次蒸餾水配制. 實(shí)驗(yàn)用水均為經(jīng)過(guò)離子交換和蒸餾純化的三次水.

1.2PAA-PBA的合成

根據(jù)文獻(xiàn)[19,21], 使PAA與APBA在交聯(lián)劑NHS和EDC的存在下發(fā)生縮合反應(yīng), 將PBA接枝到PAA骨架上來(lái)合成PAA-PBA聚電解質(zhì)使, 其合成路線如Scheme1所示, 具體過(guò)程如下: 將0.57gPAA水溶液(含有2.77mmol單體)用HEPES緩沖溶液(20mL, 50mmol/L)稀釋, 將溶液pH值調(diào)至8.5; 將APBA(20mL, 61mmol/L)同樣溶于pH=8.5的HEPES緩沖溶液(20mL, 50mmol/L)中; 然后將上述2種溶液混合, 再滴入含有NHS(4mL, 31mmol/L)的HEPES緩沖溶液(50mmol/L,pH=8.5), 并攪拌10min. 將含有EDC(4mL, 310mmol/L)的HEPES緩沖溶液(50mmol/L,pH=8.5)加入到上述反應(yīng)混合溶液中, 室溫下攪拌12h. 然后將上述溶液透析7d以除去所有小分子量的雜質(zhì), 冷凍干燥后得到白色粉末狀固體產(chǎn)物PAA-PBA.

Scheme 1　Synthetic route of PAA-PBA

1.3{PAA-PBA/Dex}n-Mb薄膜的組裝

PG電極的制作: 用熱縮管將直徑為4.5mm、 長(zhǎng)為6mm左右的圓柱型BasalplanePG(AdvancedCeramic公司)密封在直徑與之相等的不銹鋼圓柱棒一端. 使PG的一側(cè)表面緊貼在不銹鋼棒一端的表面, 從而形成導(dǎo)電通路, 而PG的另一側(cè)表面作為電極表面. 將電極表面在320目的金相砂紙上打磨后, 再在蒸餾水中超聲30s, 洗凈吹干后作為實(shí)驗(yàn)中的工作電極. 電極表面的幾何面積為0.16cm2.

將處理好的PG電極首先在帶有正電荷的CS溶液(1mg/mL,pH=5.0)中浸泡15min, 使之在PG表面吸附一層CS前驅(qū)膜. 然后將PG/CS電極交替浸入帶有負(fù)電荷的PAA-PBA(1mg/mL,pH=9.0)和中性Dex(1mg/mL,pH=9.0)水溶液中各15min, 溶液轉(zhuǎn)換時(shí)用水清洗并吹干, 可在電極表面形成一個(gè)PAA-PBA/Dex雙層. 重復(fù)上述過(guò)程直到在PG/CS表面上形成所需雙層數(shù)(n)的{PAA-PBA/Dex}nLbL薄膜. 將組裝好的上述薄膜電極浸入1mg/mL的Mb溶液(pH=5.0, 含0.2mol/LNaCl)中使Mb分子擴(kuò)散到薄膜內(nèi)部, 然后取出洗滌并吹干, 制得薄膜{PAA-PBA/Dex}n-Mb. 然后將固載了Mb的薄膜轉(zhuǎn)移到pH=7.0的空白緩沖溶液中進(jìn)行電化學(xué)研究.

1.4測(cè)試

2結(jié)果與討論

2.1{PAA-PBA/Dex}nLbL薄膜的層層組裝

Fig.1　

打磨后的PG電極暴露出一些棱面(edge面), 因此既具有疏水性也具有親水性. 由于棱面的碳被氧化后連接有O-,OH-等基團(tuán), 因此表面帶有負(fù)電荷[22].CS在pH=5.0時(shí)因pKa≈6.5[23]而帶有正電荷, 因此可以作為前驅(qū)膜吸附在PG電極表面[22].PAA-PBA的分子骨架中含有大量的自由的—COOH基團(tuán),PAA在水溶液中的pKa約為6.0[24～27], 因此在pH=9.0時(shí)PAA-PBA中自由的羧基被離子化而帶負(fù)電荷, 這樣帶負(fù)電荷的PAA-PBA可以被靜電吸附到帶有相反電荷的PG/CS膜表面. 因此PG電極與CS之間、CS與PAA-PBA之間的組裝驅(qū)動(dòng)力主要是靜電作用力. 后續(xù)組裝的Dex是一種不帶電荷的中性聚多糖,Dex在PAA-PBA表面的吸附以及后續(xù){PAA-PBA/Dex}n多層膜的組裝主要通過(guò)硼酸-二醇特異性識(shí)別作用相結(jié)合.

圖1為以K3Fe(CN)6為電活性探針監(jiān)測(cè)的{PAA-PBA/Dex}n薄膜在PG電極表面的循環(huán)伏安曲線. 在裸的PG或PG/CS薄膜電極上,K3Fe(CN)6在pH=7.0的溶液中于0.17V附近出現(xiàn)一對(duì)良好的、 近乎可逆的氧化還原峰. 而當(dāng){PAA-PBA/Dex}nLbL薄膜組裝到PG/CS表面后, 探針的氧化還原峰電流顯著下降, 這是因?yàn)樵陔姌O表面形成的薄膜屏障阻礙了探針到達(dá)底層的電極表面并進(jìn)行電子交換. 隨著薄膜雙層膜數(shù)n的增加,K3Fe(CN)6的電流逐漸降低, 由此表明在PG電極表面構(gòu)筑了{(lán)PAA-PBA/Dex}n多層薄膜.

2.2{PAA-PBA/Dex}n薄膜對(duì)Mb的吸入

在合適的條件下,Mb能夠從其水溶液中被自發(fā)地吸入到{PAA-PBA/Dex}n薄膜之中, 形成{PAA-PBA/Dex}n-Mb薄膜. 圖2是以Fe(CN)3-/4-6為電活性探針裸的PG電極、PG/CS薄膜電極和PG/CS/{PAA-PBA/Dex}6薄膜電極的電化學(xué)阻抗譜. 對(duì)于裸的PG電極和PG/CS薄膜電極,Fe(CN)3-/4-6的EIS響應(yīng)在pH=7.0的溶液中都表現(xiàn)為一條Warburg直線(圖 2曲線a和b), 這是受擴(kuò)散控制的電化學(xué)過(guò)程的特征. {PAA-PBA/Dex}6薄膜在Mb溶液中浸泡9h后, 在高頻區(qū)可以觀察到1個(gè)明顯的半圓形響應(yīng)(曲線d), 其EIS響應(yīng)的半圓直徑遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于吸入Mb之前的{PAA-PBA/Dex}6薄膜的半圓直徑(曲線c). 半圓的直徑通常等于探針的電荷轉(zhuǎn)移電阻[28]. 對(duì)于薄膜體系, 電荷轉(zhuǎn)移電阻主要反映了探針在薄膜中擴(kuò)散的難易程度, 與薄膜的通透性直接相關(guān)[29]. 由此說(shuō)明吸入{PAA-PBA/Dex}6薄膜中的Mb作為物理屏障進(jìn)一步阻礙和限制了探針到達(dá)電極表面, 從而反過(guò)來(lái)證實(shí)了Mb在薄膜中的吸入.

Fig.2　EIS responses of bare PG(a), PG/CS film(b), PG/CS {PAA-PBA/Dex}6 film(c) and PG/CS{PAA-PBA/Dex}6-Mb film(d) at 0.17 V in pH=7.0 buffers containing 5.0 mmol/L Fe(CN)3-/4-(A) and magnification of curves a and b of (A) (B)

Mb的等電點(diǎn)為6.8[30], 其表面凈電荷在pH=5.0時(shí)為正. 而{PAA-PBA/Dex}6薄膜是由帶負(fù)電荷的PAA-PBA和不帶電荷的Dex兩種成膜材料組成, 因此{(lán)PAA-PBA/Dex}6薄膜帶負(fù)電荷. 在pH=5.0條件下, 帶負(fù)電荷的薄膜將吸引帶正電荷的Mb. 因此,Mb和{PAA-PBA/Dex}6薄膜中PAA-PBA組分之間的靜電吸引力也是促使薄膜吸入Mb的另一重要驅(qū)動(dòng)力.

由于薄膜中的Mb具有電活性, 可以作為指示劑, 因此其吸入過(guò)程也可以通過(guò)CV響應(yīng)來(lái)監(jiān)測(cè). 例如, 將組裝了{(lán)PAA-PBA/Dex}6薄膜的PG電極浸入Mb溶液中一定時(shí)間后水洗、 吹干, 然后轉(zhuǎn)移到pH=7.0的空白緩沖溶液中, 在0.1～-0.8V的電位范圍為進(jìn)行CV掃描, 在-0.34V(vs.SCE)處可以觀察到一對(duì)可逆性良好的還原氧化峰[圖3(A), 曲線b～k], 這是Mb中血紅素Fe(Ⅲ)/Fe(Ⅱ)電對(duì)的特征峰[3,31]. 平行實(shí)驗(yàn)中的6組PG/CS{PAA-PBA/Dex}6-Mb薄膜電極的平均式量電位[E°′CV氧化峰和還原峰的峰電位的平均值]為-0.34V, 標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.011V, 表明薄膜的重現(xiàn)性非常好. 而不含Mb的{PAA-PBA/Dex}6薄膜在此電位范圍內(nèi)沒(méi)有任何CV響應(yīng)[圖3(A), 曲線a].Mb的CV還原峰電流(Ipc)隨著{PAA-PBA/Dex}6多層膜在Mb溶液中浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)而增加, 在大約9h后達(dá)到穩(wěn)態(tài)[圖3(B)]. 因此, 在以后的實(shí)驗(yàn)中多層膜在Mb溶液中的浸泡時(shí)間均為9h. {PAA-PBA/Dex}6-Mb薄膜的CV陰極峰和陽(yáng)極峰的峰高和峰面積幾乎相等, 且在0.05～2.0V/s范圍內(nèi)峰電流與掃速呈線性關(guān)系, 表明該薄膜中Mb的伏安行為具有典型的非擴(kuò)散控制的薄層電化學(xué)的特征[32]. 在此條件下, 對(duì){PAA-PBA/Dex}6-Mb薄膜的CV陰極峰進(jìn)行積分, 可得到薄膜中全部電活性的Mb發(fā)生還原反應(yīng)時(shí)的電量Q, 根據(jù)法拉第定律Q=NAFΓ*[其中N是電子轉(zhuǎn)移數(shù)(1), A是PG電極表面的幾何面積(0.16

Fig.3　CVs in pH=7.0 buffers at a scan rate of 0.2 V/s for {PAA-PBA/Dex}6-Mb film after {PAA-PBA/Dex}6 film was immersed in 1 mg/mL Mb solutions at pH=5.0 for different time(A) and effect of the immersing time in Mb solution on reduction peak currents of electroactive Mb(Ipc) for {PAA-PBA/Dex}6-Mb film(B) (A) t/h: a. 0; b. 0.5; c. 1.0; d. 2.0; e. 3.0; f. 4.0; g. 5.0; h. 6.0; i. 7.0; j. 9.0; k. 15.0.

cm2), F為法拉第常數(shù)(96487C/mol)], 可以將Q進(jìn)一步換算為電活性Mb在薄膜電極上的表面濃度(Г*,mol/cm2)[32]. 如果采用Γ*9h表示在Mb溶液中浸泡9h后薄膜中電活性Mb的表面濃度, 則6組平行實(shí)驗(yàn)的{PAA-PBA/Dex}6-Mb薄膜的平均Γ*9h約為1.25×10-10mol/cm2.

對(duì)于雙層數(shù)n不同的{PAA-PBA/Dex}n-Mb薄膜,Mb在薄膜電極上的表面濃度Γ*與浸泡時(shí)間的關(guān)系表現(xiàn)出相同的趨勢(shì), 即Γ*隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)而增大, 在大約9h后趨于穩(wěn)態(tài). 雙層數(shù)不同時(shí), {PAA-PBA/Dex}n-Mb薄膜在Mb溶液中浸泡9h后表現(xiàn)出不同的Γ*值(圖4), Γ*值隨著雙層數(shù)n的增加而增大, 當(dāng)n=6時(shí), Γ*達(dá)到最大值, 繼而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(因此在以后的實(shí)驗(yàn)中選擇雙層數(shù)為6的{PAA-PBA/Dex}6-Mb薄膜作為研究對(duì)象), 這是因?yàn)殡S著薄膜雙層數(shù)n從1增加到6, {PAA-PBA/Dex}n薄膜變得越來(lái)越厚, 這樣可以吸納更多的Mb分子, 因而傾向于獲得更大的Γ*值; 但是同時(shí)薄膜的通透性會(huì)隨著薄膜厚度的增加而降低, 因此溶液中小分子量的對(duì)離子進(jìn)出薄膜變得越來(lái)越困難, 導(dǎo)致Mb分子之間的電子自交換更加困難, 故Γ*值呈減小的趨勢(shì). 這2種效果相反的因素共同作用, 使得Γ*值在n=6時(shí)達(dá)到最大值.

Fig.4　Effect of different number of bilayers(n) on the surface concentration of electroactive Mb(Γ*) after {PAA-PBA/Dex}n films were immersed in 1 mg/mL Mb solutions for 9 h

Fig.5　CVs at a scan rate of 0.2 V/s for {PAA-PBA/Dex}6-Mb films in pH=7.0 buffers a. The first cycle; b. after 200 cycles; c. after the films were immersed in pH=7.0 buffers for 7 d.

將{PAA-PBA/Dex}6-Mb薄膜置于空白緩沖溶液中, 在所研究的電位范圍內(nèi)進(jìn)行CV掃描200圈后,CV峰的位置仍然保持不變, 峰高只下降了約1.5%; 將{PAA-PBA/Dex}6-Mb薄膜于空白緩沖溶液中浸泡7d后, 其峰電流值仍能夠保持其起始峰高的80%(圖5).

2.3薄膜的表面形貌

Fig.6　SEM top views of {PAA-PBA/Dex}6(A), {PAA-PBA/Dex}6/PAA-PBA(B) and {PAA-PBA/Dex}6-Mb films(C) assembled on PG/CS surface

用SEM對(duì)組裝在PG/CS表面的{PAA-PBA/Dex}6, {PAA-PBA/Dex}6/PAA-PBA和{PAA-PBA/Dex}6-Mb層層組裝薄膜的表面形貌進(jìn)行了表征. 由圖6可以看出, 在相同的放大倍率下, {PAA-PBA/Dex}6薄膜和{PAA-PBA/Dex}6/PAA-PBA薄膜的表面形貌比較平整, 并能觀察到一些孔洞或通道, 沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的差異, 表明組裝過(guò)程中相鄰的PAA-PBA與Dex層有一定程度的相互交錯(cuò)或滲透. 而{PAA-PBA/Dex}6-Mb薄膜顯示出相對(duì)粗糙的表面, 說(shuō)明溶液中的Mb分子不但被吸入到薄膜的內(nèi)部, 而且吸附在{PAA-PBA/Dex}6薄膜的表面. 被吸入到薄膜內(nèi)部的Mb對(duì){PAA-PBA/Dex}6-Mb直接電化學(xué)響應(yīng)做出了主要貢獻(xiàn), 這是因?yàn)槿芤褐械腗b在薄膜表面的吸附過(guò)程一般不到30min即可達(dá)到穩(wěn)態(tài)[33], 而本實(shí)驗(yàn)中Mb在{PAA-PBA/Dex}6薄膜中的固載達(dá)到穩(wěn)態(tài)所需要的時(shí)間大約為9h, 表明蛋白質(zhì)進(jìn)入薄膜是一個(gè)相對(duì)緩慢的過(guò)程.

2.4測(cè)試底液的pH值和支持電解質(zhì)的影響

Fig.7　CVs of {PAA-PBA/Dex}6-Mb films at a scan rate of 0.2 V/s in buffers at different pH pH: a. 4.0; b. 6.0; c. 7.0; d. 8.5. Inset: influence of pH of testing solutions on the formal potential(E°′) estimated by CV at a scan rate of 0.2 V/s for {PAA-PBA/Dex}6-Mb film.

將已經(jīng)吸入Mb達(dá)穩(wěn)態(tài)的{PAA-PBA/Dex}6-Mb薄膜電極置于不同pH值的0.1mol/LNaCl測(cè)試底液中進(jìn)行CV掃描, 由圖7可見(jiàn),Mb的CV峰位置表現(xiàn)出明顯的移動(dòng). 體系的式量電位E°′隨著底液pH值的增加而負(fù)移. 在pH=4.0～9.0范圍內(nèi), E°′與測(cè)試底液的pH值呈線性關(guān)系, 斜率為-53.3mV/pH[圖7插圖]. 該值近似于具有相同質(zhì)子與電子轉(zhuǎn)移數(shù)的伴隨著有質(zhì)子轉(zhuǎn)移的可逆電極反應(yīng)的理論值(-58mV/pH, 20 ℃)[34]. 由此說(shuō)明該薄膜電極上Mb的血紅素輔基在發(fā)生單電子傳遞的同時(shí), 很可能伴隨著1個(gè)質(zhì)子的轉(zhuǎn)移:

(1)

根據(jù)電子跳躍機(jī)理, {PAA-PBA/Dex}6-Mb薄膜中Mb分子與電極之間發(fā)生電子交換時(shí)為了補(bǔ)償電子轉(zhuǎn)移過(guò)程中造成的薄膜內(nèi)的電荷改變, 即維持薄膜相的電中性, 溶液相中的對(duì)離子必須能夠進(jìn)入或離開(kāi)薄膜相以補(bǔ)償由于電子轉(zhuǎn)移造成的薄膜內(nèi)部電荷的不均衡. 例如, 當(dāng)薄膜內(nèi)MbFe(Ⅲ)發(fā)生還原時(shí), 薄膜內(nèi)會(huì)產(chǎn)生多余的負(fù)電荷, 因此需要薄膜相中的陰離子轉(zhuǎn)移到溶液相, 或者溶液相中的陽(yáng)離子轉(zhuǎn)移到薄膜相, 以補(bǔ)償由于電子轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生的多余負(fù)電荷[35]. 不同類型支持電解質(zhì)對(duì){PAA-PBA/Dex}6-Mb薄膜電化學(xué)行為的影響如圖8所示. 可見(jiàn), 不同支持電解質(zhì)對(duì){PAA-PBA/Dex}6-Mb薄膜CV峰形的影響很小, 它們峰高和峰電位基本一致.

Fig.8　CVs at before and after different volume of air was injected 0.2 V/s for {PAA-PBA/Dex}6-Mb films in pH=7.0 buffers containing 0.1 mol/L different supporting electrolytes a. NaCl; b. KCl; c. NaBr.

Fig.9　CVs at 0.2 V/s in 10 mL of pH=7.0 buffers for {PAA-PBA/Dex}6(a), {PAA-PBA/Dex}6-Mb films before(b) and {PAA-PBA}6-Mb films(c—j) after different volume of air was injected V(air)/nL: b. 60; c. 50; d. 10; e. 15; f. 20; g. 30; h. 40; i. 60; j. 90.

2.5{PAA-PBA/Dex}6-Mb薄膜的電催化性質(zhì)

用循環(huán)伏安法研究了{(lán)PAA-PBA/Dex}6-Mb薄膜電極對(duì)氧氣和過(guò)氧化氫等底物的電化學(xué)催化還原行為. 當(dāng)用注射器向經(jīng)過(guò)除氧的pH=7.0的緩沖溶液中注入一定量的空氣后(圖9), 與通入空氣之前相比, 可以觀察到{PAA-PBA/Dex}6-Mb薄膜電極在大約-0.4V左右的CV還原峰電流隨著空氣通入量的增加而顯著增加, 并且伴隨著MbFe(Ⅱ)氧化峰的消失, 這是由于MbFe(Ⅱ)已經(jīng)與溶液中的氧發(fā)生了化學(xué)反應(yīng). 而對(duì)于不含Mb的{PAA-PBA/Dex}6薄膜電極, 氧氣直接還原的峰電位大約在-0.9V左右. 因此, {PAA-PBA/Dex}6-Mb薄膜中的Mb使氧的還原過(guò)電位降低了大約0.5V. 結(jié)果證明薄膜中的Mb可以有效地電催化還原O2.

{PAA-PBA/Dex}6-Mb薄膜電極也可以用來(lái)電催化還原H2O2(圖 10). 將H2O2注入pH=7.0的緩沖溶液中,CV結(jié)果顯示, {PAA-PBA/Dex}6-Mb薄膜電極中Mb的CV氧化峰降低而還原峰顯著增大, 并隨著溶液中H2O2濃度的增大, 還原峰電流值逐漸增高, 線性范圍為2.0～85μmol/L[圖10(B)]. 然而對(duì)于不含Mb的{PAA-PBA/Dex}6薄膜, 在掃描電位0.1～-1.2V的范圍內(nèi)則沒(méi)有觀察到H2O2的直接電化學(xué)還原信號(hào)(曲線 a).

Fig.10　CVs at a scan rate of 0.2 V/s for {PAA-PBA/Dex}6 films in buffers(pH=7) containing 100 μmol/L H2O2(a), {PAA-PBA/Dex}6-Mb films(b), {PAA-PBA/Dex}6-Mb films with 20(c), 40(d), 60(e), 80(f), 100(g) and 150 μmol/L(h) H2O2 in pH=7.0 buffers, respectively(A) and dependence of CV Ipc on the concentration of H2O2 for {PAA-PBA/Dex}6-Mb film at 0.2 V/s(B)

3結(jié)論

合成了既含有PBA基團(tuán)又含有羧酸基團(tuán)的聚電解質(zhì)PAA-PBA, 并將其用作成膜材料, 利用PAA-PBA和Dex二者之間的硼酸-二醇特異性識(shí)別作用, 采用層層組裝技術(shù), 在電極表面上構(gòu)筑了{(lán)PAA-PBA/Dex}nLbL薄膜. 生物大分子Mb可以自發(fā)地從pH=5.0的緩沖溶液中進(jìn)入該多層薄膜中, 形成穩(wěn)定的{PAA-PBA/Dex}n-MbLbL薄膜. {PAA-PBA/Dex}n薄膜為保持Mb的生物活性提供了適宜的微環(huán)境, 并實(shí)現(xiàn)了Mb在薄膜中的直接電化學(xué)及其對(duì)氧和過(guò)氧化氫的電催化還原. 采用循環(huán)伏安法、 電化學(xué)阻抗法和掃描電子顯微鏡等表征了{(lán)PAA-PBA/Dex}n多層膜的組裝及{PAA-PBA/Dex}n-Mb薄膜的性質(zhì). 結(jié)果表明, 利用硼酸-二醇特異性識(shí)別作用構(gòu)筑的{PAA-PBA/Dex}n-Mb吸入型蛋白質(zhì)層層組裝薄膜是一種新型的蛋白質(zhì)LbL薄膜, 可作為不依賴于媒介體的電化學(xué)生物傳感器的基礎(chǔ), 為設(shè)計(jì)基于酶的直接電化學(xué)的生物傳感器提供了新思路.

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(Ed.:S,Z,M)

?SupportedbytheProgramofScientificStudiesoftheNingxiaHigherEducationInstitutions,China(No.NGY2014101)andtheNationalInnovationExperimentProgramforUniversityStudents,China(No.20140315).

doi:10.7503/cjcu20150943

收稿日期:2015-12-10. 網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2016-04-22.

基金項(xiàng)目：高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào): NGY2014101)和國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào): 20140315)資助.

中圖分類號(hào)O646; O657.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

LoadingofMyoglobinintoLayer-by-layerFilmsAssembledThroughBoronicAcid-diolSpecificRecognitionandItsElectrochemicalStudy?

YAOHuiqin1*,HUANGShan1,SUQiaoling1,SHIKeren2*,GANQianqian1,WANGMingke1

(1. College of Pharmacy, College of Basic Medical Science, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China;2. State Key Laboratory of Energy Sources & Engineering, Ningxia University, Yinchuan 750021, China)

AbstractA polyelectrolyte PAA-PBA containing both phenylboronic acid(PBA) moieties and carboxylic acid groups[PAA=poly(acrylic acid)] was synthesized. PAA-PBA and dextran(Dex) were then assembled into {PAA-PBA/Dex}n layer-by-layer(LbL) films by LbL assemble technique on pyrolytic graphite(PG) electrode surface through boronic acid-diol specific recognition between them. Myoglobin(Mb) in a buffer solution(pH=5.0) was loaded into the films, forming stable {PAA-PBA/Dex}n-Mb films. By cyclic voltammetry(CV) technique, the {PAA-PBA/Dex}n-Mb film electrodes demonstrated the direct electrochemistry of Mb and could be used to electrocatalyze reduction of various substrates(e.g. O2 and H2O2).

KeywordsDirect electrochemistry; Electrocatalysis; Layer-by-layer assembly; Boronic acid-diol specific recognition; Myoglobin

聯(lián)系人簡(jiǎn)介: 姚惠琴, 女, 博士, 副教授, 主要從事生物/藥物電分析化學(xué)研究.E-mail:huiqin_yao@163.com

史可人, 男, 博士, 副教授, 主要從事材料電化學(xué)研究.E-mail:shikeren@163.com