沈秋悅，曹志強，朱月芳，施維林*（ 蘇州科技學院環(huán)境科學與工程學院，江蘇蘇州 5009； 蘇州市環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇蘇州 5009）

?

一株耐鎘細菌的分離鑒定及其吸附條件的優(yōu)化①

沈秋悅1，曹志強1，朱月芳2，施維林1*
（1 蘇州科技學院環(huán)境科學與工程學院，江蘇蘇州 215009；2 蘇州市環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇蘇州 215009）

摘 要：從鎘污染場地篩選分離得到一株耐鎘細菌F7，經(jīng)過形態(tài)學觀察以及16S rDNA同源性對比分析，鑒定菌株F7屬于芽孢桿菌（Bacillus），最大耐Cd2+濃度為50 mg/L。實驗研究了Cd2+初始濃度、pH及投菌量對菌株吸附Cd2+的影響，利用FTIR探究菌株吸附的機理。結(jié)果表明：菌株F7在Cd2+初始濃度為1.0 mg/L、投菌量為1.0 g/L、pH為6.1時，對Cd2+的吸附率達到93.9%；吸附符合Langumir模型，最大吸附容量為1.83 mg/g。對比分析吸附前后的紅外光譜圖，發(fā)現(xiàn)菌株F7表面的官能團羥基、胺基、烷基、蛋白酰胺Ⅱ帶及磷酸基團在吸附過程中起主要作用。

關(guān)鍵詞：耐鎘細菌；分離鑒定；生物吸附；吸附機理

隨著工業(yè)（電鍍、采礦、冶金等）的迅速發(fā)展，重金屬以“三廢”的形式不斷向城鄉(xiāng)土壤或水體中排放，能夠被植物吸收在體內(nèi)積聚［1］，或通過土壤中動物的皮膚和消化道在體內(nèi)積聚，通過食物鏈在人體內(nèi)聚集；另一方面，土壤中的重金屬會隨著水分遷移污染地下水或者地表水，從而危害人類健康。重金屬鎘（Cd）是一種毒性很強的元素，長期在人體蓄積可引起骨痛病、心血管功能障礙等疾?。?］。相比較傳統(tǒng)的物理法和化學法，生物吸附法因為費用低、高效，不易造成二次污染而逐漸廣泛運用［3］。很多微生物可以通過氧化還原、甲基化作用和脫烴作用等將重金屬離子轉(zhuǎn)化為無毒或低毒的化合物形式［4］，一些細菌還能通過產(chǎn)生一些酶類還原重金屬［5-6］。目前已發(fā)現(xiàn)的能高效吸附重金屬離子的微生物眾多，如枯草芽孢桿菌［7］、銅綠假單胞菌［8］、螺旋藻［9］、啤酒酵母［10］、浮游球衣菌［11］。

考慮到污染場地篩選的微生物有較高的耐受性，可能存在多種吸附機理以及許多微生物能夠同時降解或吸附多種污染物［12］，有助于高效降低污染場地重金屬的濃度。因此，本研究從鎘污染土壤中分離純化得到一株耐鎘菌株，通過生理生化及分子生物學分析對該菌進行了初步鑒定，并且研究了影響菌株吸附Cd2+的最優(yōu)化條件，初步探究了其吸附機理。研究結(jié)果有助于了解場地原位微生物的重金屬修復能力，以期為今后的重金屬污染微生物修復實踐提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試土壤樣品采自蘇州地區(qū)重金屬污染工業(yè)場地，采用五點取樣法，剝?nèi)ネ寥辣韺拥母采w物，取10 ～20 cm土層的新鮮土壤。土樣的主要理化性質(zhì)：pH 7.88，含水率28.2%，陽離子交換量10.8 cmol/kg，有機質(zhì)8.08 g/kg，Cr 260 mg/kg，As 28 mg/kg，Cd 2.34 mg/kg。

牛肉膏液體培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、去離子水1 000 ml、pH 7.0 ～ 7.2。

鎘儲備液：稱取一定量的優(yōu)級純硫酸鎘溶于1 000 ml的去離子水中，得到1g/L的鎘儲備液。

1.2 耐鎘菌株的富集、篩選及鑒定

1.2.1 耐鎘菌株的分離 在 Cd2+含量為 20 mg/L的牛肉膏液體培養(yǎng)基中加入過篩的新鮮混合土樣，于振蕩培養(yǎng)箱下25℃、150 r/min馴化培養(yǎng)72 h。取適量的馴化后的懸濁液，采用稀釋涂布法均勻涂布在Cd2+濃度為20 mg/L的固體培養(yǎng)基平板上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，挑選菌落形態(tài)不同的優(yōu)勢單菌落劃線分離，純化后制作斜面保存。

1.2.2 耐鎘菌株的抗鎘能力 將分離到的純菌株接種到帶Cd2+培養(yǎng)基上，適宜溫度下培養(yǎng)，2 ～ 3天后觀察培養(yǎng)基中是否有該特異菌株長出，無特異菌株長出的培養(yǎng)基濃度為該菌株最大耐Cd2+濃度。每個濃度設置3個平行樣。

1.2.3 耐鎘菌株的鑒定 菌落形態(tài)觀察：將活化的菌株在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng) 24 h，觀察菌落形態(tài)和顏色。16S rDNA序列分析：將菌株送往上海生物工程有限公司測序，所測得的序列結(jié)果在 Genbank中進行blast同源性比對。鑒定參考《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和相關(guān)文獻［13-15］。

1.3 耐鎘菌株吸附條件研究

1.3.1 菌懸液的制備 將菌株F7接種到牛肉膏液體培養(yǎng)基中，放在28℃、120 r/min的恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)液在5 000 r/min下離心10 min，用去離子水清洗菌體3次，收集菌體測定其鮮重并待用。

1.3.2 吸附實驗方法 1） Cd2+的初始濃度對菌株吸附Cd2+的影響。取一定量的鎘儲備液配制Cd2+的初始質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0、5.0 mg/L的溶液于50 ml的錐形瓶中，加入1 ml的菌懸液，使得最終溶液體系中菌濃度為1.0 g/L、pH為6 ～ 7，體系的總體積為20 ml。設置平行實驗，以不加菌的體系為空白對照。于28℃ 120 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中振蕩2 h，樣品于5 000 r/min 離心10 min，取上清液過0.45 μm水系濾膜，用ICP測定溶液中殘余的Cd2+含量。

2） 投菌量對菌株吸附Cd2+的影響。取一定體積的菌懸液于50 ml的錐形瓶中，加入1.0 mg/L的Cd2+溶液，使得溶液中菌濃度為0.01、0.1、0.5、1.0、2.0 g/L，溶液pH為6 ～ 7，總體積控制為20 ml。設置平行實驗，以不加菌的體系為空白對照。其余同上。

3） 吸附時間對菌株吸附Cd2+的影響。取一定的菌懸液和鎘儲備液于150 ml的錐形瓶中，使得菌濃度為1 g/L、Cd2+濃度為1 mg/L，pH為6 ～ 7，總體積控制為100 ml。設置平行實驗，以不加菌的體系為空白對照。其余同上。

4） pH對菌株吸附Cd2+的影響。取一定的菌懸液和鎘儲備液于50 ml的錐形瓶中，使得菌濃度為1 g/L、Cd2+濃度為1 mg/L，pH分別調(diào)節(jié)為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，總體積控制為20 ml。設置平行實驗，以不加菌的體系為空白對照。其余同上。

1.3.3 紅外光譜實驗 將吸附重金屬后的菌體真空冷凍干燥后，取少量干燥菌體加入 KBr粉末混合研磨，將混合好的粉末壓成薄皮，放置在傅里葉變換紅外吸收光譜儀上進行檢測并記錄其光譜。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Microsoft Excel 2010 處理實驗數(shù)據(jù)并進行誤差分析；采用 Origin 7.5對數(shù)據(jù)進行擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鎘菌株的分離鑒定

2.1.1 耐鎘菌株的形態(tài)鑒定 經(jīng)過富集培養(yǎng)、分離純化，篩選得到一株對鎘具有較高耐性的細菌菌株，編號為F7。菌株F7在固體培養(yǎng)基上的形態(tài)見圖1所示。菌落為不透明，黏稠，菌落較大，表面隆起，顏色為乳白色。革蘭氏染色為陽性。菌株在固體牛肉膏培養(yǎng)基上能耐受Cd2+濃度為50 mg/L。

圖1 菌株F7在固體培養(yǎng)基上的形態(tài)

2.1.2 16S rDNA序列分析 菌株F7的16S rDNA由上海生工測定，得到長度為1 452 bp的16S rDNA序列。將序列在NCBI中與Genbank中已發(fā)表的核酸序列進行同源性比對，并在MEGA5.0中利用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。結(jié)果顯示，菌株F7 與Bacillus weihenstephanensis和 Bacillus sp.的16S rDNA具有 99.9% 的同源性，而由圖2可知，菌株F7與這兩種菌進化距離近，因此判斷菌株F7屬于芽孢桿菌（Bacillus）。

2.2 耐鎘菌株吸附條件研究

2.2.1 Cd2+初始濃度 菌株 F7在不同初始濃度的Cd2+溶液中的吸附率如圖3所示。從圖3可知，當Cd2+的初始濃度從0.1 mg/L增加到1.0 mg/L時，菌株F7對Cd2+的吸附率逐漸增加，在Cd2+濃度為1.0 mg/L時達到最大值為88.42%。說明在Cd2+的一定初始濃度范圍內(nèi)，隨 Cd2+濃度增加有利于菌株對其的吸附，原因可能是，Cd2+濃度的增加使得其與菌株的有效碰撞概率增大、吸附位點增加，吸附率增大；其次，Cd2+在固相和液相之間的傳質(zhì)阻力能因為鎘提供的驅(qū)動力而被克服，從而增加了吸附率［16-17］。在Cd2+濃度達到1.0 mg/L時，隨著Cd2+濃度增加，吸附率降低，可能是因為，高濃度的Cd2+會抑制微生物的生長代謝過程如酶活性機制，另外，也會抑制微生物生長導致微生物表面吸附量的減少［18］。

圖2 菌株F7的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 Cd2+不同初始濃度對菌株吸附Cd2+的影響

2.2.2 投菌量 不同生物量對Cd2+吸附的影響如圖4所示。隨著投菌量從0.01 g/L增加到2.0 g/L，菌株對重金屬Cd2+的吸附率從32.62% 增到88.64%，投菌量在1.0 g/L時吸附率達到最大值?？赡苁怯捎陔S著投菌量的增加，使得吸附位點增加導致吸附率提高。而在吸附率達到最大值后，隨著投菌量的增加，吸附率反而下降，這可能是金屬離子的總量不變，單位菌體吸附重金屬的量減少［19-20］。

2.2.3 pH 一般而言，溶液pH主要是通過影響細菌表面官能團的電性及金屬離子在溶液中的存在形態(tài)來干擾吸附過程。圖5所示是不同 pH對菌株吸附Cd2+的影響。隨著pH升高，菌株吸附Cd2+量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在pH達到6.1時，吸附率達到最大值93.9%。在pH較低時，溶液中存在的大量水合氫離子占據(jù)菌體細胞壁的吸附活性位點，活性基團被質(zhì)子化從而增加了細胞表面的靜電斥力，阻礙了離子交換作用，因此pH越小阻力越大。而隨著pH增加，細胞表面的負電荷量增加，大大增加了對帶正電荷重金屬離子的吸附。當 pH達到6后，溶液中出現(xiàn)微量沉淀，重金屬離子形態(tài)被改變，導致金屬離子被吸附量減小［21］。

圖4 投菌量對菌株吸附Cd2+的影響

圖5 pH對菌株吸附Cd2+的影響

2.3 耐鎘菌株吸附Cd2+的等溫模型

Langmuir吸附模型假設吸附是均一的單分子層吸附，其單層的表面吸附位點有限及能量相等，吸附分子之間無相互作用。Freundlich吸附模型一般適用于非均質(zhì)固體表面的可逆吸附作用。本文采用Langumir和Feundlich方程擬合菌株F7對Cd2+的等溫吸附過程，方程分別如下：

式中：qe是菌株對Cd2+的平衡吸附量，mg/g；Ce是吸附平衡時溶液中殘留 Cd2+的濃度，mg/L；KL是Langmuir等溫方程常數(shù)，L/mg；qm是理論最大吸附量，mg/g；KF（L/mg）和n分別是Freundlich等溫方程常數(shù)。

從表1可以看出，Langumir和Freundlich等溫吸附方程的擬合度分別為 0.915 6和 0.843 3。通過Langumir方程模擬計算所得的 Cd2+的吸附容量為1.83 mg/g，與實際測得的1.739 mg/g較接近。因此可以判斷，Langumir更適合描述菌對Cd2+的等溫吸附過程，說明溶液中 Cd2+在菌表面是單分子層的表面吸附。

圖6 Langumir和Freundlich 吸附等溫模型

表1 菌株吸附Cd2+的等溫吸附參數(shù)

2.4 紅外光譜吸收分析（FTIR）

通過紅外光譜分析，可以判斷菌體表面吸附重金屬過程中發(fā)生變化的官能團。對菌株 F7吸附Cd2+前后的紅外光譜進行分析，結(jié)果如圖7所示。3 290 cm-1處顯示的是氨基和羥基伸縮振動的重疊吸收帶。2 930 cm-1處對應的吸收峰是飽和烷基C-H鍵的伸縮振動峰，在菌株吸附完成后遷移至2 920 cm-1處，表明烷基參與了菌株吸附重金屬的過程［19］。1 650 cm-1處的吸收峰是-C=O伸縮振動引起的。1 539 cm-1、1 530 cm-1處的吸收峰是-N-H彎曲變形振動引起，峰值在吸附前后移動了9 cm-1，表明菌株細胞壁上的蛋白質(zhì)酰胺Ⅱ帶（N-H的彎曲振動與C-N伸縮振動的疊加）表現(xiàn)活躍，參與吸附過程［22］。1 240 cm-1、1 229 cm-1處的吸收峰是蛋白質(zhì)分子O-H的面內(nèi)伸縮振動，可能還有磷酸二酯基團PO2-的不對稱伸縮振動［23］，峰值吸附前后發(fā)生了位移，表明羧基在吸附時與Cd2+離子發(fā)生了配位作用［24］。1 070 cm-1、1 062 cm-1處吸收峰是C-O伸縮帶及磷酸二酯基團 PO2-的對稱伸縮帶，峰值在吸附前后移動的12 cm-1說明磷酸基團可能參與了吸附過程。上述說明，菌株吸附前后有羥基、氨基、烷基、酰胺Ⅱ帶及磷酸基團參與反應，而吸收峰是向低波數(shù)遷移，說明Cd2+發(fā)生絡合反應時，基團的活性會降低［25］。

圖7 菌株吸附Cd2+的FTIR譜圖

3 結(jié)論

1） 本實驗從蘇州某典型Cd污染場地分離篩選得到一株耐鎘的細菌F7，革蘭氏染色為陽性菌，最大耐Cd2+濃度為50 mg/L，經(jīng)鑒定該菌屬于芽孢桿菌。

2） 菌株F7對Cd2+有較好的吸附效果，在Cd2+初始濃度1.0 mg/L，投菌量1.0 g/L，pH 6.1時，對Cd2+的吸附率可達到93.9%。運用吸附等溫模型擬合菌株吸附Cd2+過程，發(fā)現(xiàn)菌株F7符合Langumir模型，最大吸附容量為1.83 mg/g，表明菌株F7在吸附過程中是單分子層的表面吸附。

3） 對比吸附前后的紅外光譜譜圖，發(fā)現(xiàn)菌株F7表面的官能團羥基、胺基、烷基、蛋白酰胺Ⅱ帶及磷酸基團在吸附、絡合或螯合金屬離子或原子過程中起主要作用。

參考文獻：

［1］ 曾希柏， 徐建明， 黃巧云， 等.中國農(nóng)田重金屬問題的若干思考［J］.土壤學報， 2013， 50 （1）: 188-196

［2］ 黃銀華， 李鋮， 李芳柏， 等.廣州市農(nóng)業(yè)表層土壤鎘和鉛多尺度空間結(jié)構(gòu)［J］.土壤， 2015， 47（6）: 1 144-1 150

［3］ Groudev S， Georgiev P， Spasova I， et al.Decreasing the contamination and toxicity of a heavily contaminated soil by in situ bioremediation［J］.Journal of Geochemical Exploration， 2014， 144: 374-379

［4］ 馬瑩， 駱永明， 滕應， 等.根際促生菌及其在污染土壤植物修復中的應用［J］.土壤學報， 2013， 50（5）: 1 022-1 032

［5］ Urrutia M M， Beveridge T J.Remobilization of heavy metals retained as oxyhydroxides or silicates by bacillus subtilis cells［J］.Applied & Environmental Microbiology，1994， 59（12）: 4 323-4 329

［6］ 馬琳娜， 張勝， 李政紅， 等.六價鉻還原細菌的篩選及還原特性研究［C］.北京：中國地質(zhì)學會， 2010

［7］ 陳尚智， 胡勇有.枯草芽孢桿菌對微污染水體的凈化作用［J］.環(huán)境科學學報， 2011， 31（8）: 1 594-1 601

［8］ Wang C L， Michels P C， Dawson S C， et al.Cadmium removal by a new strain of Pseudomonas aeruginosa in aerobic culture ［J］.Applied & Environmental Microbiology，1997， 63 （10）: 4 075-4 078

［9］ Costa A C A D， Fran?a F P D.Cadmium uptake by Spirulina maxima: toxicity and mechanism［J］.World Journal of Microbiology & Biotechnology， 1998， 14（14）: 579-581

［10］ 代群威， 鄧濤， 王巖， 等.吸附 Sr2+后酵母細胞的絮凝特性研究［J］.環(huán)境科學學報， 2015， 35 （6）:1 786-1 791

［11］ Beolchini F， Pagnanelli F， Toro L， et al.Biosorption of copper by Sphaerotilus natans immobilised in polysulfone matrix: equilibrium and kinetic analysis［J］.Hydrometallurgy，2003， 70 （s 1/2/3）: 101-112

［12］ Tripathi M， Vikram S， Jain R K， et al.Isolation and growth characteristics of chromium（VI） and pentachlorophenol tolerant bacterial isolate from treated tannery effluent for its possible use in simultaneous bioremediation［J］.Indian Journal of Microbiology， 2011， 51 （1）: 61-69

［13］ 布坎南.伯杰細菌鑒定手冊.北京: 科學出版社， 1984

［14］ 劉國紅， 劉波， 林乃銓， 等.芽胞桿菌的系統(tǒng)進化及其屬分類學特征//中國微生物學會第二屆全國芽胞桿菌研究與應用學術(shù)研討會.2012.

［15］ 王桂萍， 郭明志， 陳亞華， 等.兩株抗銅細菌的篩選、鑒定及對碳酸銅的溶解作用［J］.土壤， 2014， 46（3）: 498-503

［16］ Yal??n E， ?avu?o?lu K， K?nal?o?lu K.Biosorption of Cu2+and Zn2+by raw and autoclaved Rocella phycopsis ［J］.Journal of Environmental Sciences， 2010， 22 （3）: 367-373

［17］ 邱云云， 尹華， 葉錦韶， 等.嗜麥芽窄食單胞菌對鎘的吸附［J］.環(huán)境污染與防治， 2011， 33（4）: 40-45

［18］ González Paola S， Ambrosio Laura F， Paisio Cintia E， et al.Chromium （VI） remediation by a native strain: Effect of environmental conditions and removal mechanisms involved［J］.Environmental Science and Pollution Research，2014， 21（23）: 13 551-13 559

［19］ 廖佳， 馮沖凌， 李科林， 等.耐性真菌HA吸附鉛、鋅的影響因素及吸附機理研究［J］.微生物學通報， 2015， 42（2）: 254-263

［20］ 金羽， 曲娟娟， 李影， 等.一株耐鉛細菌的分離鑒定及其吸附特性研究［J］.環(huán)境科學學報， 2013， 33 （8）: 2 248-2 255

［21］ Gonte R， Balasubramanian K.Heavy and toxic metal uptake by mesoporous hypercrosslinked SMA beads: Isotherms and kinetics［J］.Journal of Saudi Chemical Society， 2013， 4: 1-12

［22］ 林曉燕， 牟仁祥， 曹趙云， 等.耐鎘細菌菌株的分離及其吸附鎘機理研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報， 2015， 34（9）: 1 700-1 706

［23］ 周艾平， 尹華， 葉錦韶， 等.酵母融合菌對 Cr的吸附性能及機理分析［J］.環(huán)境科學與技術(shù)， 2011， 34（6）: 37-42

［24］ 藏婷婷， 胡曉婧， 顧海東， 等.黑木耳菌糠對Cu2+的生物吸附及其機理［J］.環(huán)境科學學報， 2014， 34（6）: 1 421-1 428

［25］ Qi B C， Aldrich C.Biosorption of heavy metals from aqueous solutions with tobacco dust［J］.Bioresource Technology， 2008， 99 （13）: 5 595-5 601

中圖分類號：X172

DOI:10.13758/j.cnki.tr.2016.03.029

基金項目：①國家自然科學基金項目（31570515）、蘇州科技支撐計劃項目（SYN201402）和蘇州科技學院土壤污染與修復協(xié)同創(chuàng)新項目（051410017）資助。

* 通訊作者（weilin-shi@163.com）

作者簡介：沈秋悅（1991—），女，江蘇蘇州人，碩士研究生，主要從事土壤污染機理及生態(tài)修復研究工作。E-mail：sqy10911@163.com

Isolation of a Cd-resistant Bacterium and Optimization of Its Bio-accumulation Condition

SHEN Qiuyue1， CAO Zhiqiang1， ZHU Yuefang2， SHI Weilin1*
（1 School of Environmental Science and Engineering， Suzhou University of Science and Technology， Suzhou， Jiangsu 215009，China； 2 Environmental Monitoring Center of Suzhou， Suzhou， Jiangsu 215009， China）

Abstract:A native bacterial strain， named F7， with strong Cd resistance ability was isolated from Cd-contaminated soil.According to its morphological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequences analysis， it was identified as Bacillus.The bacterial strain F7 could grow on the beef extract peptone medium that concentrated Cd2+， which can reach to 50 mg/L.The effects of initial Cd2+concentration， pH and biosorbent dosage on Cd2+adsorption efficiency were studied.And the adsorption mechanism of bacterial strain was explored by FTIR.The experimental results showed that the Cd2+adsorption efficiency achieved 93.9% when initial Cd2+concentration was 1.0 mg/L， biosorbent dosage was 1.0 g/L， and pH was 6.1.The biosorption equilibrium conformed to the Langumir equations and the maximum adsorption capacity was 1.83 mg/L.The functional groups on the cell wall of bacterial strain F7 before and after adsorption process were observed by FTIR， the results indicated that the main functional groups participated in Cd adsorption were-OH，-NH2，-CH3， Protein amide Ⅱ and Phosphate group.

Key words:Cd-resistant bacterium； Isolation and identification； Biosorption； Adsorption mechanism