黃振杰　曾彤華　蔡文華　歐盛敬　陳文?！±铎?/p>

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TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化及其機(jī)制探討

黃振杰曾彤華蔡文華歐盛敬陳文海李斐

536000 廣西北海市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科

【摘要】目的探討轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)過程及信號(hào)傳導(dǎo)通路。 方法體外培養(yǎng)肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞，以TGF-β1進(jìn)行干預(yù)；采用Western blot免疫印跡法檢測(cè)干預(yù)前后細(xì)胞標(biāo)志物蛋白及信號(hào)傳導(dǎo)蛋白P-Smad2/3、Snail1、Snail2的表達(dá)；采用RT-PCR檢測(cè)干預(yù)前后細(xì)胞標(biāo)志物mRNA表達(dá)；采用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。 結(jié)果TGF-β1干預(yù)后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，A549細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cad和CK19蛋白及mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA、Vimentin蛋白及mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；信號(hào)傳導(dǎo)蛋白P-Smad2/3、Snail1表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；倒置相差顯微鏡觀察TGF-β1干預(yù)后A549細(xì)胞由干預(yù)前的鵝卵石狀變?yōu)樗笮?，如同肌纖維母細(xì)胞。 結(jié)論TGF-β1可誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，其機(jī)制可能與P-Smad2/3、Snail1信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)；TGF-β1可能是通過誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞效應(yīng)，最終導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞凋亡和纖維組織形成。

【關(guān)鍵詞】肺纖維化；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；A549細(xì)胞；上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化；信號(hào)傳導(dǎo)通路

肺纖維化是臨床常見的呼吸疾病，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全清楚[1-3]。以往，多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為其與進(jìn)行性炎癥導(dǎo)致的肺間質(zhì)細(xì)胞激活增殖有關(guān)[4]。但近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)炎癥不一定是誘導(dǎo)纖維化的必要條件，尤其是特發(fā)性肺纖維化及尋常型間質(zhì)性肺炎[5]。近年來(lái)，肺泡上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)及其信號(hào)傳導(dǎo)通路理論在肺纖維化中的作用逐漸獲得認(rèn)可[6]。本研究通過采用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞發(fā)生EMT，旨在詮釋和論證EMT是否為肺纖維化發(fā)病的一個(gè)重要的新模式。并探討轉(zhuǎn)化過程中信號(hào)傳導(dǎo)途徑的作用。

資料與方法

一、主要試劑

A549細(xì)胞株(中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)、胎牛血清、低糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)、TGF-β1(Hyclone公司)、β-actin鼠抗人一抗、E-cad羊抗人一抗、CK19鼠抗人一抗、α-SMA鼠抗人一抗、Vimentin鼠抗人一抗、p-Smad2/3羊抗人一抗、Snail1兔抗人一抗、Snai2兔抗人一抗(Sigma公司)

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù): 用10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基將A549細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70%～80%,用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓24 h,換新鮮培養(yǎng)液,隨機(jī)把細(xì)胞分組,于培養(yǎng)液中加入TGF-β1儲(chǔ)液至終濃度5 ng/ml。

2. 觀察細(xì)胞形態(tài): 倒置相差顯微鏡觀察A549細(xì)胞在TGF-β1刺激下出現(xiàn)的肺泡EMT過程中細(xì)胞形態(tài)的變化,在0、24和48 h拍照記錄。

3. Westernblot免疫印跡: 于TGF-β1干預(yù)后0、3、6、12、24、48、72 h裂解并提取細(xì)胞蛋白，分裝凍于-70 ℃?zhèn)溆?。采用BCA法測(cè)定標(biāo)本蛋白濃度，取50 μg樣品蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠變性電泳，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上封閉，加入E-cad、CK19、α-SMA、Vimentin p-Smad2/3、Snail1、Snail2一抗，以β-actin作為內(nèi)參，洗滌后加熒光標(biāo)記的二抗，37 ℃下，放置1 h。采用紅外成像系統(tǒng)掃描圖像，以隨機(jī)附帶軟件計(jì)算熒光強(qiáng)度。

4. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

(1)總RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：當(dāng)A549細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70%～80%,用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓24 h, 加入至TGF-β1終濃度5 ng/ml。在刺激后0、3、6、12、24 h抽提總RNA, 取2 μl RNA樣品, MOPS瓊脂糖凝膠電泳,證實(shí),具有清晰18S和28S條帶的RNA用于逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn),取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，于-20 ℃下保存。

(2)RT-PCR：RT-PCR檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E鈣黏蛋白(E-cadherin, E-cad)、細(xì)胞角蛋白19(cytokeratin19, CK19)和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、間質(zhì)細(xì)胞的波形蛋白(vimentin)的mRNA表達(dá)，以GAPDH做內(nèi)參，所用引物由上海生工生物工程公司合成，見表1。反應(yīng)條件為95 ℃/5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃/20 s、62 ℃/30 s、72 ℃/30 s，40個(gè)循環(huán)，隨機(jī)軟件計(jì)算Ct值和拷貝數(shù)。

表1　RT-PCR所用引物

注：CK19：細(xì)胞角蛋白19;E-cad: E鈣黏蛋白;VIM: 波形蛋白; α-SMA:α平滑肌肌動(dòng)蛋白

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS14.0版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

一、細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

倒置相差顯微鏡觀察，TGF-β1干預(yù)后A549細(xì)胞由干預(yù)前的鵝卵石狀變?yōu)樗笮渭凹忓N形，細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞之間連接變得松散，如肌纖維母細(xì)胞，見圖1。

圖1TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞EMT過程中發(fā)生的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;注：A1,B1,C1 200×；A2,B2,C2 400×

二、TGF-β1對(duì)A549細(xì)胞上皮和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物及信號(hào)傳導(dǎo)蛋白表達(dá)的影響

Wseternblot免疫印跡結(jié)果顯示：TGF-β1干預(yù)后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，A549細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cad和CK19蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA、Vimentin蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，見圖2。信號(hào)傳導(dǎo)蛋白P-Smad2/3、Snail1表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；而Snail2呈弱表達(dá)，各時(shí)段無(wú)明顯變化(P>0.05)，見圖3。

圖2TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞EMT過程中上皮和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的蛋白表達(dá)變化

圖3TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞EMT過程中信號(hào)傳導(dǎo)蛋白表達(dá)的變化

三、TGF-β1對(duì)A549細(xì)胞上皮和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物mRNA的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，TGF-β1干預(yù)后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，A549細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cad和CK19的mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA、Vimentin的mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，見圖4。

圖4TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞EMT過程中上皮和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的mRNA表達(dá)變化

討　　論

上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是由完全分化的上皮細(xì)胞歷經(jīng)細(xì)胞表型改變而轉(zhuǎn)化為完全分化的間充質(zhì)細(xì)胞的過程，一般會(huì)轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞或肌纖維母細(xì)胞[7]。在正常情況下細(xì)胞間黏附機(jī)制將上皮細(xì)胞緊密的連接在一起,其中E-cad蛋白是促成上皮細(xì)胞間緊密連接的主要成分之一,在保持細(xì)胞的完整性和極性中起著重要作用[8]。研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程中的早期變化就是E-cad蛋白的表達(dá)受到抑制,破壞了細(xì)胞間的緊密連接,從而使上皮細(xì)胞喪失其黏附特性,逐漸的從基底膜上脫落；隨后胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞骨架進(jìn)行重新排列,表達(dá)新的表型蛋白α-SMA,同時(shí)胞質(zhì)內(nèi)肌絲也由上皮型角蛋白(cytokeratin)轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞的vimentin[9]。此過程中細(xì)胞形態(tài)由干預(yù)前的鵝卵石狀變成梭形,如成纖維細(xì)胞或肌纖維母細(xì)胞。通過電鏡觀察可見細(xì)胞的極性發(fā)生了改變,細(xì)胞微絨毛消失,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)密體及大量的肌動(dòng)蛋白微絲，這為細(xì)胞遷徙及收縮能力增強(qiáng)等變化提供了形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)[10]。本研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1干預(yù)后, 隨著時(shí)間延長(zhǎng)，A549細(xì)胞的上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cad、CK 19蛋白及mRNA表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì),而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA、Vimentin蛋白及mRNA表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì),這說(shuō)明TGF-β1可直接誘導(dǎo)肺泡EMT的發(fā)生，且存在一定的時(shí)間依賴性。

關(guān)于TGF-β1如何誘導(dǎo)EMT的下游信號(hào)傳導(dǎo)通路,目前完全尚未清楚[11]。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Smads家族蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)在TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程中起著關(guān)鍵作用[12]。Smad蛋白既是轉(zhuǎn)錄因子同時(shí)也是其他轉(zhuǎn)錄因子的誘導(dǎo)物，能夠?qū)GF-β1信號(hào)從上皮細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，導(dǎo)致“蛋白質(zhì)組”表達(dá)，導(dǎo)致包括上皮細(xì)胞連接處分解、細(xì)胞支架結(jié)構(gòu)重建等[13]。Yamada等[14]用博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化，發(fā)現(xiàn)博萊霉素刺激后3、6、12、24 d,Smad3蛋白在肺組織中的表達(dá)增加,P-Smad2/3在胞核提取液中升高，并一直伴隨肺纖維化進(jìn)程至第7天達(dá)到高峰。本研究中, TGF-β1誘導(dǎo)后A549細(xì)胞EMT發(fā)生后，p-smad2/3表達(dá)明顯上調(diào),說(shuō)明肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生EMT與p-smad2/3信號(hào)傳導(dǎo)途徑密切相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1誘導(dǎo)的EMT,不僅可通過Smad途徑,也可通過非Smad途徑實(shí)現(xiàn)[15]。本研究發(fā)現(xiàn),在TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT中,Snail1蛋白表達(dá)明顯上調(diào), Snail2蛋白表達(dá)不明顯,說(shuō)明肺泡EMT過程與Snail1介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑關(guān)系密切。Snail1和Snail2是一組鋅指蛋白，在對(duì)胚胎發(fā)育的研究中發(fā)現(xiàn), Snail1和Snail2作為轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控胚胎EMT的過程中起著至關(guān)重要的作用[16]。Choi等[17]研究發(fā)現(xiàn)Snail1和Snail2可被TGF-β1通過Smad途徑激活，抑制上皮細(xì)胞E-cad蛋白轉(zhuǎn)錄, 但具有細(xì)胞類型依賴性，在本研究中,Snail2表達(dá)不明顯,也證明了這種特異性。

綜上所述，TGF-β1可在體外誘導(dǎo)肺泡EMT,其機(jī)制與p-Smad 2/3、Snail1介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān),提示TGF-β1可能是通過誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞效應(yīng)，最終導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞凋亡和纖維組織形成。肺泡EMT可能是肺纖維化發(fā)病的機(jī)制之一,而p-Smad 2/3、Snail1信號(hào)傳導(dǎo)通路是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過阻斷此信號(hào)傳導(dǎo)通路是否可起到抑制或治療肺纖維化的作用，還有待進(jìn)一步研究。

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(本文編輯：王亞南)

黃振杰，曾彤華，蔡文華，等. TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化及其機(jī)制探討[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2016， 9(3)： 292-296.

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.03.013

基金項(xiàng)目：廣西衛(wèi)生廳科研自籌基金資助項(xiàng)目(Z2011063)

通訊作者：黃振杰，Email： hzj1974bh@126.com

中圖法分類號(hào)：R563

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Corresponding author：Huang Zhenjie, Email： hzj1974bh@126.com

(收稿日期：2015-07-18)

Exploration of the process and mechanism for the epithelial mesenchymal cell transformation of pulmonary alveoli induced by TGF-β1

HuangZhenjie,ZengTonghua,CaiWenhua,OuShengjing,ChenWenhai,LiFei.RespiratoryMedicineDesect1mentofBeihaiPeople′sHospitalofGuangXi,Beihai536000,China

【Abstract】ObjectiveTo explore the process of Epithelial mesenchymal cell transformation (EMT) of pulmonary alveoli induced by transforming growth factorβ1 (TGF-β1) and its signal transduction pathways. MethodCultivated the adenocarcinoma cells of lung A549 in vitro, intervented by TGF-β1, using Westernblot method to detect the expression of the cell markers protein and signal transduction protein P-Smad2/3, Snail1, Snail2 before and after the intervention, using RT-PCR to detect the mRNA expression of the cell markers before and after the intervention. Observed the cell morphology by inverted phase contrast microscope. ResultsAfter the TGF-β1 intervention, with the extension of time, the protein and mRNA expression of the A549 cells epithelial markers E-cad and CK19 were low-regulation (P<0.05); The protein and mRNA expression level of the interstitial cell markers α-SMA, Vimentin were up-regulation (P<0.05); The expression of the signal transduction protein P-Smad2/3, Snail1 were up-regulation (P<0.05); Inverted phase contrast microscope observation: The A549 cells turn into spindle shape of after TGF-β1 intervention from pebble shape pre-intervention, like a muscle fiber mother cell. ConclusionTGF-β1 can induce alveolar epithelial turn into mesenchymal cells and its mechanism may be related to P-Smad2/3, Snail1 signal transduction pathways. TGF-β1 may result in the apoptosis of alveolar epithelial cells and fibrogenesis just by inducing epithelial-mesenchymal transition-like cellular response.

【Key words】Pulmonary fibrosis;Transforming growth factor beta 1;A549 cells;Epithelial mesenchymal cell transformation;Signal transduction pathways

北海市科研自籌基金項(xiàng)目資助(北科合201109002)