劉小云，李　路，李庚儒，舒　琦，豐麗媛，林先剛，徐亞靜，劉自兵,3

(1.安徽中醫(yī)藥大學針灸骨傷臨床學院，安徽 合肥　230038；2.安徽中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合臨床學院，安徽 合肥　230038；3.安徽中醫(yī)藥大學針灸經(jīng)絡研究所，安徽 合肥　230038)

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·針灸經(jīng)絡·

電針“肺俞”穴對慢性阻塞性肺疾病大鼠迷走神經(jīng)放電的影響

劉小云1，李路1，李庚儒2，舒琦1，豐麗媛1，林先剛1，徐亞靜1，劉自兵1,3

(1.安徽中醫(yī)藥大學針灸骨傷臨床學院，安徽 合肥230038；2.安徽中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合臨床學院，安徽 合肥230038；3.安徽中醫(yī)藥大學針灸經(jīng)絡研究所，安徽 合肥230038)

[摘要]目的觀察電針“肺俞”穴對慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)大鼠迷走神經(jīng)放電的影響，初步探討針刺治療COPD的作用機制。方法隨機將40只SD大鼠分為正常組、正常電針組、模型組、模型電針組，后兩組以香煙煙熏結合脂多糖氣管滴注法復制COPD模型。觀察各組大鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)和血漿中乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)的含量，并取正常電針組、模型電針組大鼠的“肺俞”穴進行即刻電針治療，觀察電針前后大鼠迷走神經(jīng)放電情況。結果與電針前比較，正常電針組和模型電針組大鼠電針后頸部左側(cè)迷走神經(jīng)放電頻率、面積和幅度均顯著增加(P<0.05)，模型電針組大鼠電針前后頸部左側(cè)迷走神經(jīng)放電頻率、面積和幅度差值顯著大于正常電針組(P<0.05)。ACh在外周血漿中含量變化為：模型組顯著高于正常組(P<0.05)，模型電針組顯著高于正常電針組但顯著低于模型組(P<0.05)。ACh在BALF中含量變化為：正常電針組顯著高于正常組(P<0.05)，模型電針組顯著高于正常電針組和模型組(P<0.05)。結論電針“肺俞”穴可使COPD大鼠迷走神經(jīng)放電增強，并促進肺局部ACh遞質(zhì)的釋放。

[關鍵詞]慢性阻塞性肺疾??；電針；肺俞；迷走神經(jīng)；乙酰膽堿

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一種常見的慢性氣道炎性疾病，以不完全可逆的氣流受限為特點，氣流受限呈進行性加重，與肺部對香煙煙霧等有害氣體或顆粒的異常炎癥反應有關[1]。其因患病率高、漸進性發(fā)展、病死率高、經(jīng)濟負擔重等特點成為嚴重的公共衛(wèi)生問題之一[2]。作為當今臨床中較為難治的一種呼吸系統(tǒng)疾病，亟需尋找出可行有效的治療方法。針刺療法是中醫(yī)學的優(yōu)勢和特色，在對COPD的治療中早有應用，其中“肺俞”穴為臨床治療COPD使用頻次最高的穴位[3]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)針刺的抗炎作用與膽堿能抗炎通路存在密切聯(lián)系[4]，這條抗炎途徑以迷走神經(jīng)、乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)及其特異性受體為基礎，在調(diào)控炎癥方面具有迅速、直接、高效的特點[5]。本實驗以迷走神經(jīng)為切入點，觀察電針“肺俞”穴對COPD大鼠迷走神經(jīng)放電的影響及其神經(jīng)遞質(zhì)ACh含量的變化，旨在闡釋針刺干預COPD的作用機制，為針刺防治COPD提供實驗依據(jù)。

1　材料

1.1實驗動物及分組清潔級SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量為250～300 g，由江蘇省常州卡文斯實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK(蘇)2011-0003。動物于室溫環(huán)境下適應性飼養(yǎng)1周后，被隨機分為正常組(未經(jīng)處理的空白大鼠)、正常電針組(空白大鼠+電針“肺俞”穴)、模型組(COPD模型大鼠)、模型電針組(COPD模型大鼠+電針“肺俞”穴)，每組10只。

1.2實驗材料及儀器紅三環(huán)香煙(安徽中煙工業(yè)有限責任公司產(chǎn)品；焦油含量8 mg，煙氣煙堿含量0.4 mg，二氧化碳含量13 mg)；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)：Sigma公司產(chǎn)品，批號 20150305；大鼠ACh酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA)試劑盒：R&D公司，批號 E-30165；混合麻醉藥：由α-氯醛糖(德國默克公司生產(chǎn)，批號 52408)、烏拉坦(上海強順化學試劑有限公司，批號 20090406)和硼砂(江蘇省揚州滬寶化學試劑有限公司，批號 20090103)組成；RT-6000型酶標儀：雷杜生命科學股份有限公司。BL-420S型生物機能采集系統(tǒng)：四川省成都泰盟科技公司；華佗牌SDZ-Ⅴ型多功能電針治療儀：江蘇省蘇州醫(yī)療用品廠。

2　方法

2.1COPD動物模型復制利用香煙熏吸加氣管滴注LPS復制COPD大鼠模型[6]。大鼠于第1天、第14天向氣管內(nèi)注入LPS 1 mg/kg。第2天將大鼠置入1 m3自制煙熏箱內(nèi)，以紅三環(huán)香煙每日煙熏1 h，持續(xù)1個月。

2.2迷走神經(jīng)放電記錄以7 mL/kg劑量的混合麻醉藥對大鼠進行麻醉，鈍性分離大鼠頸部左側(cè)迷走神經(jīng)，用周邊肌肉和皮膚做好皮兜，充以預熱37 ℃的石蠟油，給予迷走神經(jīng)保護，將迷走神經(jīng)勾掛于氯化銀電極(直徑0.7 mm，電阻小于1 Ω，四川省成都泰盟科技公司)上，連接導線至生物功能采集系統(tǒng)，打開軟件，進行迷走神經(jīng)放電原始信號記錄，采集指標為放電頻率、面積和幅度。

2.3穴位即刻電針刺激大鼠仰臥位于自制的鏤空網(wǎng)格的鼠板上，取大鼠背部雙側(cè)“肺俞”穴(第2胸椎棘突最高點作為標志，向下順摸第3胸椎棘突下旁開7 mm[7])，將直徑0.25 mm、長13 mm的一次性無菌針灸針刺入穴位，針柄以導線連接多功能電針治療儀，參數(shù)采用4/20 Hz頻率，電流2 mA，以引起大鼠背部皮膚輕微抖動為宜，針刺持續(xù)30 min，電針后記錄大鼠迷走神經(jīng)放電情況。

2.4取材血漿采集：電生理記錄完成后，采集大鼠腹主動脈血5 mL，置于肝素抗凝管中，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清。支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)的抽取：采血后，開胸，充分暴露肺臟，用注射器插入氣管插管上端，取6 mL生理鹽水反復3次灌洗支氣管及肺泡，回抽灌洗液置于離心管，按上述方法離心。所得血漿及BALF于-20 ℃存放。

2.5ACh含量檢測參照ELISA試劑盒說明書操作，主要包含以下步驟：①包被抗原；②加封閉液；③加被檢血漿；④加辣根過氧化物酶羊抗兔IgG；⑤加底物；⑥加終止液；⑦用酶標儀記錄490 nm讀數(shù)。

3　結果

3.1電針“肺俞”穴對各組大鼠頸部左側(cè)迷走神經(jīng)放電頻率、面積、幅度的影響與電針前比較，正常電針組和模型電針組大鼠電針后頸部左側(cè)迷走神經(jīng)放電頻率、面積和幅度均顯著增加(P<0.05)，模型電針組大鼠電針前后頸部左側(cè)迷走神經(jīng)放電頻率、面積和幅度差值顯著大于正常電針組(P<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠電針前后頸部左側(cè)迷走神經(jīng)放電頻率、面積和幅度比較±s)

注：與同組電針前比較，*P<0.05；與正常電針組比較，#P<0.05。

3.2各組大鼠ACh含量的變化含有一個重復測量數(shù)據(jù)的三因素方差分析結果顯示，檢測部位因素、模型因素和電針因素對ACh水平的主效應均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，檢測部位、模型因素和電針因素的交互作用也具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2和表3，故以簡單效應分析為主。模型組血漿ACh水平和正常電針組BALF中ACh水平顯著高于正常組(P<0.05)，模型電針組BALF中ACh水平顯著高于模型組和正常電針組(P<0.05)，模型電針組血漿ACh水平顯著高于正常電針組(P<0.05)，但顯著低于模型組(P<0.05)，見表4。結果表明，電針“肺俞”穴可增加BALF中ACh含量而降低血漿ACh含量；電針“肺俞”穴對COPD病理狀態(tài)下大鼠ACh合成、釋放的調(diào)節(jié)作用更明顯。

表2　模型因素和電針因素對血漿和BALF中ACh水平影響的方差分析結果(被試內(nèi)因素分析)

表3　模型因素和電針因素對血漿和BALF中ACh水平影響的方差分析結果(被試間因素分析)

表4　各組大鼠血漿和BALF中ACh水平比較

注：與正常組比較，△P<0.05；與正常電針組比較，*P<0.05；與模型組比較，◇P<0.05。

4　討論

迷走神經(jīng)是混合型腦神經(jīng)(第Ⅹ對腦神經(jīng))，行程長，分布范圍廣。在生理狀態(tài)下，迷走神經(jīng)調(diào)節(jié)氣道張力、血液供應、黏液分泌及呼吸形式等。迷走神經(jīng)興奮時，可導致氣管平滑肌收縮[8]。但近年來也有研究發(fā)現(xiàn)，迷走神經(jīng)傳出纖維具有抗炎作用，可以降低局部炎性反應，實現(xiàn)對炎癥的調(diào)控[9]。

近年來，針刺和迷走神經(jīng)的關系是研究的熱點。葉小豐等[10]通過電針“足三里”穴發(fā)現(xiàn)，迷走神經(jīng)傳出纖維放電增加。但若雙側(cè)腹腔迷走神經(jīng)預先被切斷，電針足三里對迷走神經(jīng)的干預作用將明顯減弱或消失[11]。劉麗芝等[12]發(fā)現(xiàn)針刺“神門”穴可使迷走神經(jīng)興奮，增強自主神經(jīng)的整合功能，減緩心率。而在本實驗中對電針的即刻效應的觀察，發(fā)現(xiàn)電針“肺俞”穴也可使大鼠迷走神經(jīng)放電增強。電針“肺俞”穴后正常組和模型組大鼠迷走神經(jīng)放電的頻率、面積、幅度均有增長，且模型組更甚。表明電針“肺俞”穴可激活迷走神經(jīng)，且在COPD狀態(tài)下其效應更明顯。羅麗平等[13]觀察電針對心臟自主神經(jīng)調(diào)節(jié)的即刻效應和后效應中，發(fā)現(xiàn)即刻調(diào)節(jié)作用是以迷走神經(jīng)興奮為主，但取針后心迷走和心交感神經(jīng)張力變化不顯著。而電針則引起交感神經(jīng)、迷走神經(jīng)興奮，取針后心交感神經(jīng)興奮占主導。本實驗已觀察到電針有興奮迷走神經(jīng)的即刻效應，但電針是否也興奮交感神經(jīng)，使兩者在對支氣管平滑肌的調(diào)節(jié)上達到新的動態(tài)平衡，尚需進一步研究。

課題組前期實驗已發(fā)現(xiàn)，針刺治療可以減輕COPD模型大鼠病理特征和改善肺通氣功能[14]，針刺“足三里”穴可以下調(diào)肺組織白細胞介素-1β及血漿白細胞介素-6的含量，抑制肺組織炎性反應[15]。推測電針“肺俞”穴興奮迷走神經(jīng)，促進ACh合成、釋放，與電針抗炎反應有關。2000年，Borovikova提出“膽堿能抗炎通路”的概念[16]，即迷走神經(jīng)及其遞質(zhì)可抑制巨噬細胞的活化，在抗炎反應過程中有重要作用。關于激活迷走神經(jīng)，促進遞質(zhì)合成、釋放并參與抗炎治療疾病的研究被人們廣泛關注。2015年有研究發(fā)現(xiàn)，在刺激犬右側(cè)迷走神經(jīng)干后，其心肌缺血再灌注損傷降低，機制為通過激活迷走神經(jīng)的膽堿能抗炎通路，抑制全身和局部的炎性反應[17]。已有實驗證明，電刺激迷走神經(jīng)可明顯改善肺組織的通氣功能，減輕感染性休克時肺組織的損傷，具有潛在的保護肺臟的作用[18]。本實驗也發(fā)現(xiàn)正常和模型大鼠經(jīng)電針后BALF中ACh含量均明顯升高，與迷走神經(jīng)放電增強的結果一致。但電針興奮迷走神經(jīng)活動、增加ACh釋放的作用是否在短時間能改善肺局部應激或炎癥環(huán)境尚缺乏直接證據(jù)。另外，實驗中還發(fā)現(xiàn)，在外周血漿中，模型大鼠比正常大鼠ACh含量增高，而正常大鼠和模型大鼠電針后ACh含量均有降低。已有研究發(fā)現(xiàn)，ACh能在人全血中抑制LPS所誘導的炎性遞質(zhì)的釋放[19]。本實驗模型大鼠ACh含量增高，推測可能與其在病理狀態(tài)下的代償性增高并參與抑制炎癥有關，鑒于ACh在全身及局部的復雜功能，對即刻針刺可下調(diào)血漿中ACh含量的原因尚需作更深入的研究。

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基金項目：國家自然科學基金項目(81373743；81072870)；安徽省自然科學基金項目(1408085MH201)；大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(2014040)

作者簡介：劉小云(1993-)，女，本科生

通信作者：劉自兵，zibingliu@163.com

[中圖分類號]R563.3；R224[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.04.015

(收稿日期：2015-12-04；編輯：姚實林)

Effect of Electroacupuncture at Feishu Point on Vagus Nerve Discharge in Rats with Chronic Obstructive Pulmonary Disease

LIUXiao-yun1,LILu1,LIGeng-ru2,SHUQi1,FENGLi-yuan1,LINXian-gang1,XUYa-jing1,LIUZi-bing1,3

(1.ClinicalCollegeofAcupunctureandOrthopedics,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China; 2.ClinicalSchoolofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China; 3.InstituteofAcupunctureandMeridian,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of electroacupuncture (EA) at Feishu point on vagus nerve discharge in rats with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and the mechanism of action of acupuncture in the treatment of COPD. MethodsA total of 40 Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal group, EA normal group, model group, and EA model group. The rats in the latter two groups were treated with cigarette smoke combined with intratracheal instillation of lipopolysaccharide to establish the rat model of COPD. The content of acetylcholine (ACh) in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and plasma was determined. The rats in the EA normal group and the EA model group were treated with EA at Feishu point, and vagus nerve discharge was observed before and after EA. ResultsThe EA normal group and the EA model group showed significant increases in discharge frequency, area, and amplitude of the vagus nerve in the left side of the neck after EA (P<0.05), and the EA model group showed significantly higher discharge frequency, area, and amplitude of the vagus nerve in the left side of the neck than the EA normal group (P<0.05). The model group showed a significantly higher level of ACh in the peripheral plasma than the normal group (P<0.05); the EA model group showed a significantly higher level of ACh in the peripheral plasma than the EA normal group but a significantly lower level of ACh than the model group (P<0.05). The EA normal group showed a significantly higher level of ACh in BALF than the normal group (P<0.05), and the EA model group showed a significantly higher level of ACh in BALF than the EA normal group and the model group (P<0.05). ConclusionEA at Feishu point can enhance vagus nerve discharge and promote the release of ACh in the lungs in rats with COPD.

[Key words]Chronic obstructive pulmonary disease; Electroacupuncture; Feishu point; Vagus nerve; Acetylcholine