馬士杰

(山東省滕州市第一中學(xué) 277500)

1 DNA合成需要引物

原核和真核生物的DNA聚合酶都具有校正功能，必須核實前一個脫氧核苷酸正確后才會催化下一個脫氧核苷酸的加入。DNA聚合酶不能從無到有催化合成DNA。必須要有引物提供3′-OH[1]。

1.1 線性DNA的合成 以真核生物染色體DNA為代表，復(fù)制時需要RNA引物。引物從幾個到十幾個核糖核苷酸不等，由引物合成酶催化合成。復(fù)制的特點是半保留復(fù)制，多起點雙向復(fù)制，在復(fù)制起點處解旋，邊解旋邊復(fù)制。由于DNA聚合酶只能催化從5′→3′合成，提供3′端的模板鏈和RNA引物結(jié)合后，可直接在DNA聚合酶的作用下延伸子鏈，這條子鏈?zhǔn)乔皩?dǎo)鏈。前導(dǎo)鏈只需要一個引物。另外一條模板鏈提供的5′-末端，無法催化子鏈從3′→5′合成。必須等解旋超過一定長度時，RNA引物結(jié)合到這個部位，才能催化岡崎片段的合成， DNA連接酶將岡崎片段連接起來，這種方式稱為半不連續(xù)復(fù)制，形成的這條鏈?zhǔn)呛箅S鏈。后隨鏈的合成需要若干引物，引物發(fā)揮作用后會被切除，形成缺口。缺口一端為3′端；另一端為5′端，DNA聚合酶可以借助3′-OH填補缺口。

體內(nèi)線性DNA的復(fù)制需要RNA引物，發(fā)揮作用后引物會被切除。體外進行的PCR則與體內(nèi)有許多不同。PCR的每一個循環(huán)包括變性、復(fù)性和延伸三步。PCR同樣是半保留復(fù)制，不過，經(jīng)高溫變性后模板DNA全部解旋成單鏈。復(fù)性指的是設(shè)計好的DNA引物與單鏈模板DNA結(jié)合，然后在耐高溫的Taq-DNA聚合酶作用下完成子鏈延伸。經(jīng)過不停地重復(fù)變性、復(fù)性和延伸這三個步驟使DNA大量擴增。PCR需要的引物是DNA，其發(fā)揮作用后無需切除，直接加入子鏈DNA中。

1.2 環(huán)形DNA的復(fù)制 環(huán)形DNA種類復(fù)雜，復(fù)制方式多樣，對引物的要求也不盡相同。

1.2.1 θ型復(fù)制 以原核生物擬核DNA和質(zhì)粒DNA為代表。通常只有一個復(fù)制起點，單向或是雙向復(fù)制。不管是單向還是雙向復(fù)制，都需要RNA引物。同樣是邊解旋邊復(fù)制，會出現(xiàn)岡崎片段，為半不連續(xù)復(fù)制，引物會被切除。由于是環(huán)形分子，任何部位的引物切除后一定會存在3′末端。所以，引物切除后的缺口都可以得到填補。這點和線性DNA復(fù)制時，子鏈5′末端引物切除后得不到填補不同。

1.2.2 滾環(huán)復(fù)制 噬菌體ΦX174的DNA復(fù)制、λ噬菌體復(fù)制后期以及非洲爪蟾卵母細(xì)胞rRNA的基因復(fù)制屬于滾環(huán)復(fù)制。不論是單鏈還是雙鏈DNA，都會先形成閉環(huán)的復(fù)制型雙鏈分子，由特定蛋白識別相應(yīng)序列并在特定部位切開，游離出3′-OH末端，然后在DNA聚合酶作用下，以另外一條鏈為模板合成子鏈，合成一圈后又露出切口序列再次被切開重復(fù)以上過程。因此，在滾環(huán)復(fù)制中不需要專門的引物。

1.2.3 D-環(huán)復(fù)制 線粒體和葉綠體DNA復(fù)制采用D環(huán)復(fù)制。線粒體DNA為雙鏈環(huán)狀，但兩條鏈的復(fù)制起點不在同一點，一條鏈先復(fù)制，復(fù)制到一定程度露出另一鏈的復(fù)制起點，另一鏈才開始復(fù)制，形成特殊的D-環(huán)形狀[2]。復(fù)制過程需要RNA引物，后期也會發(fā)生切除引物以及缺口填補。但RNA引物是轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物，合成引物需要的是RNA聚合酶而不是引物合成酶[3]。葉綠體DNA也是雙鏈，復(fù)制的起點同樣不在同一點，卻是同時進行單向復(fù)制。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄 逆轉(zhuǎn)錄是以RNA為模板合成DNA的過程。在20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)，由逆轉(zhuǎn)錄酶所催化的逆轉(zhuǎn)錄主要存在于病毒中。逆轉(zhuǎn)錄酶具有三種酶活性，即RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶、DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶和RNase H的活性。合成DNA的方向同樣是5′→3′，同樣不能從頭合成，需要引物。不過引物不需要專門的酶催化合成，而是從宿主細(xì)胞獲得的tRNA分子。后期引物會被切除，切除后的缺口有特殊的機制修復(fù)合成。

真核生物染色體末端DNA稱為端粒。 DNA復(fù)制時，子鏈DNA的5′末端引物切除后無法填補，會使5′端序列縮短。為了保護末端端粒，個別細(xì)胞具有端粒酶活性。端粒酶是具有RNA鏈的逆轉(zhuǎn)錄酶，利用自身的RNA模板合成端粒DNA。端粒酶含有的RNA鏈可以與末端引物切除后剩余的單鏈片段局部結(jié)合，形成局部雙鏈結(jié)構(gòu)，以RNA鏈為模板在單鏈片段的3′端逐漸延伸，延伸后3′單鏈末端又可回折充當(dāng)引物以合成互補鏈[2]。所以，在此過程中不需要專門的引物。

體外的RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄PCR)，與PCR類似，同樣需要引物，不過引物是DNA，最后無需切除直接加入要合成的DNA分子中。

2 糖原合成

糖原合酶催化的糖原合成反應(yīng)也不能從第一個葡萄糖分子開始合成糖原，需要至少含4個葡萄糖殘基的α-1，4-多聚葡萄糖作為引物，在其非還原性末端與UDPG(尿苷二磷酸葡萄糖，糖原合成的糖基供體)反應(yīng)，UDPG上的葡萄糖基C 1與糖原分子非還原末端C 4形成α-1，4-糖苷鍵，使糖原增加一個葡萄糖單位。作為引物的寡聚葡萄糖鏈?zhǔn)怯梢环N特殊的蛋白質(zhì)催化合成，這個蛋白質(zhì)稱為glycogenin(生糖原蛋白，又稱糖原引物蛋白或糖原素)，可作為葡萄糖基的受體。糖原起始合成酶可以催化單個葡萄糖加入到生糖原蛋白上，進而合成一寡糖鏈作為引物，繼續(xù)由糖原合酶催化合成糖原。

在糖原合成過程中，糖原合酶一直與生糖原蛋白緊密結(jié)合，即糖原合成不僅需要糖原合酶催化，同時也需要生糖原蛋白。糖原合酶一旦與生糖原蛋白脫離，糖原合成即停止[2]。

3 淀粉的合成

淀粉與糖原結(jié)構(gòu)類似，只是分支程度不同而已，其合成也與糖原合成類似。直鏈淀粉合成有兩種方式：一是由淀粉磷酸化酶催化，該酶同時也可催化淀粉分解；另一種主要方式是由淀粉合成酶催化。不論哪種方式均不能催化從頭合成。需要將糖基供體(主要為ADPG，次要的為UDPG)加到已有寡糖鏈的非還原端C 4羥基上，這個寡糖鏈就是麥芽多糖，是淀粉合成的引物，至少是麥芽三糖。D酶催化麥芽多糖的合成，D酶實際上是糖基轉(zhuǎn)移酶，轉(zhuǎn)移葡萄糖殘基給底物葡萄糖或麥芽多糖，為淀粉的合成提供引物。

4 纖維素的合成

纖維素的合成由纖維素合酶催化，底物是UDPG，同樣不能從頭合成，需要單個糖基供體UDPG加入已有糖鏈的非還原端，提供非還原端的引物是谷甾醇-β-葡萄糖甙[4]。