趙宏麗，郭永鐵（天津市中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300073）

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞及其細胞因子在尋常型銀屑病患者的改變

趙宏麗，郭永鐵
（天津市中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300073）

目的探討尋常型銀屑病患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞及其細胞因子的改變。方法用流氏細胞儀直接免疫熒光法檢測尋常型銀屑病患者外周血CD4+CD25+T細胞的百分率、FoxP3+分子表達、細胞因子白細胞介素（IL）-10、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β的表達。結(jié)果 尋常型銀屑病患者CD4+CD25+T細胞在進行期組、靜止期組、健康對照組結(jié)果分別是4.55±1.11、5.26±1.38、6.03±1.96，CD4+CD25+FoxP3+T細胞在進行期組、靜止期組、健康對照組結(jié)果分別是3.85±0.89、4.31±1.26、4.95±1.37。進行期患者明顯低于靜止期患者和健康對照組（P＜0.05）；而靜止期患者與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。CD4+CD25+IL-10+細胞、CD4+CD25+TGF-β+T細胞在進行期組、靜止期組、健康對照組結(jié)果分別是11.57±5.64、14.49±8.26、16.35±9.98；2.65±0.97、4.23±1.55、4.83±1.84；進行期患者明顯低于靜止期患者和健康對照組（P＜0.05）；而靜止期患者與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。CD4+CD25+FoxP3+T細胞與PASI呈負相關(guān)（r=-0.659，P＜0.05）；CD4+CD25+IL-10+T與PASI呈負相關(guān)（r=-0.537，P＜0.05）；而CD4+CD25+TGF-β+T細胞與PASI直線相關(guān)（r=-0.184，P＞0.05）。結(jié)論CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的比例以及Foxp3的表達、IL-10、TGF-β的表達明顯下降，導(dǎo)致調(diào)節(jié)性T細胞的抑制功能缺陷，進而影響銀屑病病情的發(fā)展?？梢酝茰y，調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)量或功能異常，均將影響銀屑病的發(fā)病。

尋常型銀屑病；CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞；FoxP3；白細胞介素-10；轉(zhuǎn)化生長因子-β

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，主要表現(xiàn)為表皮角質(zhì)細胞過度增生和炎癥細胞浸潤，其發(fā)病機制尚不明確，現(xiàn)常用外用藥物或光線療法控制其病情的發(fā)展，但不能根治且易復(fù)發(fā)。機體內(nèi)許多免疫細胞均參與其發(fā)病過程，如樹突細胞、角質(zhì)形成細胞、T淋巴細胞，是一種免疫調(diào)節(jié)功能失衡相關(guān)的疾病。調(diào)節(jié)性T細胞是一群獨特的免疫調(diào)節(jié)細胞，具有免疫抑制作用，日漸受到關(guān)注，尤其是CD4+調(diào)節(jié)性T細胞［1］。它們在正常人體穩(wěn)態(tài)的維持，在腫瘤、器官移植、自身免疫性疾病及病毒感染等病理狀態(tài)下都起著重要作用，與尋常型銀屑病的免疫病理過程和病情密切相關(guān)［2］。

1　對象與方法

1.1對象尋常型銀屑病患者65例，其中男36例，女29例，年齡13～68歲，平均（35.9±15.3）歲，來自我院2015年3月—2015年11月門診及住院患者，均符合尋常型銀屑病的診斷標準：具有典型的紅斑、銀白色鱗屑等皮疹，均經(jīng)臨床與組織病理檢查確診。其中尋常型銀屑病患者輕度28例［1＜尋常型銀屑病皮損面積和嚴重程度指數(shù)（PASI）≤25］，重度37例（PASI＞25）［3］。所有患者1個月內(nèi)未使用皮質(zhì)類固醇激素和免疫抑制劑。對照組58例天津地區(qū)健康獻血員，男27例，女31例，年齡21～41歲，平均（35.3±4.3）歲。

1.2儀器和試劑主要儀器：流式細胞儀（美國BD公司，F(xiàn)ACS calibuy）。主要試劑：CD4-FITC，CD25-APC，F(xiàn)oxP3-PE，mouse γ1 APC，mouse γ 1 FITC，rat IgG2a PE，抗IL-10-FITC、生物素化抗TGF-β1抗體、親和素-FITC，溶血素，破膜劑，PHA均購自美國BD公司。

1.3方法

1.3.1CD4+CD25+T細胞檢測取靜脈血2 mL肝素抗凝，取2支試管，一支試管加100μL全血，20μL 抗CD4-FITC，20 μL抗CD25-APC標記抗體；另一只試管加100 μL全血，20 μL mouse γ1 APC，20 μL mouseγ1FITC。室溫避光20min；加溶血素2mL，室溫避光10 min；1 000 r/min，離心10 min；棄上清，加磷酸鹽緩沖液（PBS）2 mL，1 000 r/min，離心10 min；棄上清，加PBS 2 mL，1 000 r/min，離心10 min；棄上清，加500 μL 1%多聚甲醛固定，24 h內(nèi)上機分析。

1.3.2FoxP3+T細胞檢測取靜脈血3 mL肝素抗凝，密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（PBMC），1×106個細胞中加入抗CD4-FITC，抗CD25-APC，mouse γ1 APC，mouse γ 1 FITC，各20 μL，混勻，4℃避光孵育30 min；加入1 mL破膜劑，避光孵育45 min；加入20 μL抗FoxP3-PE，rat IgG2a PE，避光孵育30min，洗滌2次后，上流式細胞儀（FCM）檢測。

1.3.3細胞因子IL-10、TGF-β1的檢測無菌采集外周靜脈血10mL，肝素鈉抗凝，F(xiàn)icoll淋巴細胞分層液的密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，移入RPMI 1640（含10%胎牛血清）培養(yǎng)基中，加20 ng/mL植物血凝素A（PHA）刺激，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。收集培養(yǎng)液中細胞于流式反應(yīng)管中，加入抗CD4-PE，抗CD25-APC，mouseγ1APC，mouseγ1FITC，各20 μL，混勻，4℃避光孵育30 min；加入1 mL破膜劑，避光孵育45 min；分別加入抗IL-10-FITC、生物素化抗TGF-β1抗體、親和素-FITC，室溫避光20 min，PBS洗滌重懸后即采用FCM進行檢測。

1.3.4數(shù)據(jù)分析FCM各項數(shù)據(jù)采用CellQuest軟件進行分析，根據(jù)前向散射光和側(cè)向散射光調(diào)節(jié)PMT1和PMT2，以相應(yīng)同型染色細胞作為陰性對照調(diào)節(jié)FL1和FL2。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS13.0軟件，采用單因素方差分析以及Pearson相關(guān)分析。

2　結(jié)果

2.1CD4+CD25+T細胞結(jié)果分析尋常型銀屑病患者進行期組、靜止期組、對照組CD4+CD25+T細胞、CD4+CD25+FoxP3+T細胞結(jié)果見表1。進行期患者明顯低于靜止期患者和對照組（P＜0.05）；而靜止期患者與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1　尋常型銀屑病患者CD4+CD25+T細胞、CD4+CD25+FoxP3+T細胞結(jié)果?。?）

2.2CD4+CD25+T細胞IL-10、TGF-β的表達情況以CD4+T細胞設(shè)門，計算CD25+IL-10+T細胞和CD25+TGF-β+T細胞的百分率，結(jié)果見表2。進行期患者CD4+CD25+IL-10+細胞、CD25+TGF-β+T細胞明顯低于靜止期患者和對照組（P＜0.05）；而靜止期患者與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2CD4+CD25+T細胞IL-10、TGF-β的表達情況（%）

2.3與疾病嚴重程度PASI積分的相關(guān)性分析CD4+CD25+FoxP3+T細胞與PASI呈負相關(guān)（r=-0.659，P＜0.05）；CD25+IL-10+T與PASI呈負相關(guān)（r=-0.537，P＜0.05）；而CD25+TGF-β+T細胞與PASI無直線相關(guān)性（r=-0.184，P＞0.05）。

3　討論

T淋巴細胞浸潤是銀屑病的重要病理特征之一［4］。目前大量研究證實銀屑病患者外周血和皮損中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)目和功能明顯低于正常人，患者體內(nèi)存在對效應(yīng)性T細胞的調(diào)節(jié)功能缺陷［5］。FoxP3是轉(zhuǎn)錄因子叉頭家族的新成員。FoxP3基因特征性表達于胸腺及外周血的CD4+CD25+T細胞的細胞核，在CD4+CD25-T細胞、CD8+T細胞、B細胞等均無明顯表達，可作為調(diào)節(jié)性T細胞的一個特異性標記［6］，在調(diào)節(jié)性T細胞分化、發(fā)育和功能發(fā)揮方面起著至關(guān)重要的作用［7］。人體內(nèi)FoxP3基因的突變可能會導(dǎo)致自身免疫疾病的發(fā)生。FoxP3調(diào)控調(diào)節(jié)性T細胞功能主要通過3種途徑：①與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，形成蛋白復(fù)合體，動態(tài)調(diào)控Treg的功能；②通過特異性調(diào)控FoxP3的轉(zhuǎn)錄水平，影響Treg的免疫作用［8］；③對FoxP3蛋白進行翻譯后修飾調(diào)控間接影響Treg的功能。

Tr細胞分泌的兩個重要的細胞因子為IL-10和TGF-β［9］。IL-10是CTL分化因子及B細胞活化因子，在天然免疫過程中是重要的負調(diào)節(jié)因子。IL-10可直接抑制IL-2的產(chǎn)生。CD25分子即為IL-2Rα鏈，CD25+T細胞介導(dǎo)抑制作用的機制之一就是被動地吸收由效應(yīng)細胞產(chǎn)生的IL-2。IL-10還具有抑制前炎癥細胞因子的產(chǎn)生，抑制抗原特異性T細胞的激活，抑制Th17細胞的增殖［10］，抑制單核細胞表達MHC-1Ⅰ類抗原和輔助刺激分子，抑制單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生NO［11］等功能。TGF-β參與誘導(dǎo)CD4+T細胞向CD4+CD25+FoxP3+T細胞的分化［12］。TGF-β和IL-6共同作用可促使初始T細胞分化為Th17細胞，Th17細胞通過產(chǎn)生一系列促炎因子，加重銀屑病皮損處的炎癥反應(yīng)。此外，TGF-β是一個多效性細胞因子，在骨的形成中發(fā)揮著重要作用，可抑制骨吸收，促進成骨細胞的合成、分泌、增殖和分化，增加骨的鈣化。近來的研究表明TGF-β的異常改變參與銀屑病的發(fā)生發(fā)展［13］。

本研究結(jié)果顯示尋常型銀屑病患者外周血CD4+CD25+T細胞占CD4+T細胞的比例低于健康對照組，而且進行期患者明顯低于靜止期患者和健康對照組；而靜止期患者與健康對照組相似。進行期患者CD4+CD25+FoxP3+T占CD4+T細胞的比例明顯低于靜止期患者和健康對照組；而靜止期患者與健康對照組相似。進行期患者Tr分泌的IL-10、TGF-β均低于靜止期患者和健康對照組（P＜0.05），而靜止期患者與健康對照組相似。進而與疾病嚴重程度PASI積分比較，發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+FoxP3+T細胞、IL-10均與疾病嚴重程度PASI積分呈負相關(guān)；而TGF-β與疾病嚴重程度PASI積分無直線相關(guān)性。

綜上所述，銀屑病患者體內(nèi)可能存在調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量的減少以及免疫調(diào)節(jié)功能的缺失，進而影響銀屑病病情的發(fā)展。對銀屑病患者體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細胞的深入研究，可能會進一步揭示其發(fā)病機制，為臨床診斷、治療與預(yù)防提供重要的理論依據(jù)。

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Changes of CD4+CD25+Regulatory T cells and Cytokines in Psoriasis Vulgaris Patients

Zhao Hongli，Guo Yongtie
First Teaching Hospital of Tianjin University of TCM，Tianjin 300073，China

ObjectiveIn order to investigate the change of CD4+CD25+regulatory T cells and cytokines in psoriasis vulgaris. Methods The direct immunofluorescence assay was used to detect CD4+CD25+T cell，F(xiàn)oxP3+，IL-10 and TGF-β by flow cytometry.ResultsThe percentage of CD4+CD25+T cell in active stage（4.55±1.11）%was lower than that in stationary stage［（5.26±1.38）%］and the control group［（6.03±1.96）%，P＜0.05］.The percentage of CD4+CD25+FoxP3+Tcell in active stage were lower than that in stationary stage and control group（P＜0.05）.However，there was no statistical significant difference in stationary stage and control group（P＞0.05）.CD4+CD25+IL-10+Tcell and CD4+CD25+TGF-β+Tcell decreased in active stage（P＜0.05），but there was no statistical significance in stationary stage and the control group（P＞0.05）.There was positive relationship between CD4+CD25+FoxP3+Tcell and PSAI（r=-0.659，P＜0.05）.And there was positive relationship between CD25+IL-10+Tcell and PSAI （r=-0.537，P＜0.05）.However，no correlation was found between CD25+TGF-β+T cell and PASI（r=-0.184，P＞0.05）.Conclusion The proportion of CD4+CD25+regulatory T cells and the expression of Foxp3，IL-10 and TGF-β are significantly decreased.It results in the defect of inhibition function，and then influenced the development of psoriasis disease.It suggests that the abnormal of regulatory Tcells'number and function can influence of psoriasis pathogenesis.

Psoriasis vulgaris；CD4+CD25+regulatory Tcell；FoxP3；Interleukin-10；Transforming growth factor-β

R758.63

A

1672－0709（2016）03-0139－03

2016-01-06）