碳源對(duì)多粘類(lèi)芽孢桿菌生長(zhǎng)和多粘菌素E合成的影響

孫仲奇，裘娟萍，陸建衛(wèi)，趙春田，*（.浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州3004；.浙江錢(qián)江生物化學(xué)股份有限公司，浙江海寧34400）

碳源對(duì)多粘類(lèi)芽孢桿菌生長(zhǎng)和多粘菌素E合成的影響

孫仲奇1，裘娟萍1，陸建衛(wèi)2，趙春田1，*
（1.浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014；2.浙江錢(qián)江生物化學(xué)股份有限公司，浙江海寧314400）

為探究提高多粘菌素E產(chǎn)量的方法，在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和可溶性淀粉，應(yīng)用平板菌落計(jì)數(shù)和HPLC法研究了其對(duì)多粘類(lèi)芽孢桿菌生長(zhǎng)和多粘菌素E產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，5種碳源對(duì)多粘類(lèi)芽孢桿菌的生長(zhǎng)和多粘菌素E產(chǎn)量的影響不同，可溶性淀粉是菌體生長(zhǎng)的最適碳源，且多粘菌素E產(chǎn)量依次為可溶性淀粉＞乳糖＞蔗糖＞麥芽糖＞葡萄糖?？扇苄缘矸塾兄谘娱L(zhǎng)多粘菌素E的產(chǎn)素期和提高其合成速率，與葡萄糖作碳源相比，多粘菌素E的產(chǎn)量和合成速率分別提高了111%和60%。因此，可溶性淀粉是多粘菌素E合成的最適碳源。

多粘類(lèi)芽孢桿菌；多粘菌素E；碳源；可溶性淀粉

多粘菌素E（polymyxin E）是一種由多粘類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）產(chǎn)生的多肽類(lèi)抗生素［1］，主要通過(guò)破壞細(xì)胞膜的通透性［2］和誘導(dǎo)胞內(nèi)羥基自由基的產(chǎn)生［3］，使菌體死亡。因其抗畜禽革蘭氏陰性菌作用強(qiáng)、毒性小、安全性高、消化道不易吸收、藥物殘留低，常用于飼料添加劑，是一種安全的促生長(zhǎng)類(lèi)抗生素［4-5］。

多粘菌素E由Dab、Thr、Leu和疏水?；步M成，通過(guò)多粘菌素合成酶PmxA、PmxB和PmxE經(jīng)非核糖體途徑合成，再經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PmxC和PmxD將其運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外［6］。多粘菌素E前體氨基酸Dab由ectB基因編碼的二氨基丁酸氨基轉(zhuǎn)移酶（diaminobutyrate-2-oxoglutarate transaminase，EctB）催化L-Asp合成［7-9］。其前體氨基酸由機(jī)體通過(guò)初級(jí)代謝途徑合成［10］，且非核糖體合成途徑中氨基酸的延伸需要消耗大量的ATP［11］，因此，適宜的碳源對(duì)多粘菌素E的高產(chǎn)至關(guān)重要。葡萄糖是多種抗生素合成過(guò)程中較好的碳源和能源，但是其分解代謝阻遏效應(yīng)（carbon catabolite repression，CCR）會(huì)抑制多種抗生素的合成，例如青霉素、頭孢菌素等［11］，而一些非速效碳源可以促進(jìn)抗生素的生物合成，如植物油可以促進(jìn)頭孢菌素和紅霉素的產(chǎn)生［12-13］，淀粉可以促進(jìn)阿維菌素和普那霉素的合成［14-15］。因此，篩選有利于抗生素合成的碳源就顯得非常重要。本研究通過(guò)分析不同碳源對(duì)多粘菌素E發(fā)酵過(guò)程中pH值、殘?zhí)呛投嗾尘谽產(chǎn)量等參數(shù)的影響，篩選出最佳的碳源，為進(jìn)一步提高多粘菌素E產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基

1.1.1 菌株來(lái)源

多粘類(lèi)芽孢桿菌由浙江工業(yè)大學(xué)微生物研究所保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基（g·L-1）：牛肉膏10.0，蛋白胨15.0，葡萄糖10.0，酵母粉2.0，氯化鈉3.0，F(xiàn)e-SO4·7H2O 0.1，瓊脂20.0，pH 7.0，115℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基［16］，pH 7.0，115℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基［16］，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中含有45 g· L-1葡萄糖（對(duì)照組），其他試驗(yàn)組分別含有45 g· L-1的可溶性淀粉、乳糖、蔗糖、麥芽糖，pH 7.0，115℃滅菌30 min。

1.2 儀器與試劑

LC-20AD島津液相色譜儀（日本島津公司），PB-10 pH計(jì)（德國(guó)Sartorius公司），ZHWY-2112B恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司），SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司）。葡萄糖、蔗糖（廣東光華化學(xué)廠有限公司），麥芽糖、乳糖（上海伯奧生物科技有限公司），可溶性淀粉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 菌株培養(yǎng)

斜面培養(yǎng)：將多粘類(lèi)芽孢桿菌單菌落接種于新鮮斜面，30℃恒溫培養(yǎng)48 h。

1級(jí)種子培養(yǎng)：將多粘類(lèi)芽孢桿菌新鮮的斜面菌種接種于裝液量50 mL/250 mL三角瓶的1級(jí)種子培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速200 r·min-1，30℃培養(yǎng)24 h。

2級(jí)種子培養(yǎng)：將1級(jí)種子液以10%接種量接種于裝液量100 mL/500 mL三角瓶的2級(jí)種子培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速 200 r·min-1，30℃培養(yǎng)24 h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：按10%接種量將2級(jí)種子培養(yǎng)液接種于裝液量50 mL/250 mL三角瓶的發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速 200 r·min-1，30℃培養(yǎng)96 h。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及測(cè)定方法

試驗(yàn)共設(shè)蔗糖、乳糖、麥芽糖和可溶性淀粉4個(gè)處理，以葡萄糖為對(duì)照組，每個(gè)處理重復(fù)3次，發(fā)酵期間每12 h取樣測(cè)定其pH、還原糖、總糖、生物量和多粘菌素E效價(jià)等參數(shù)。還原糖和總糖含量測(cè)定采用 3，5-二硝基苯酚法（DNS法）［17-18］；pH測(cè)定采用 PB-10 pH計(jì)測(cè)定；生物量測(cè)定采用平板計(jì)數(shù)法［19］；多粘菌素E效價(jià)的測(cè)定采用HPLC法［20］。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel和Statview統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和差異顯著度分析，數(shù)據(jù)處理后用Origin 8.0繪圖。

1.5.1 多粘菌素E相對(duì)效價(jià)的計(jì)算

根據(jù)公式（1）和（2）計(jì)算多粘菌素E的效價(jià)和相對(duì)效價(jià)。

式（1）中：Y為發(fā)酵液多粘菌素E效價(jià)（U· mL-1）；X為液相圖譜峰面積；B為稀釋倍數(shù)；0.004 52和1 723.761 13分別表示多粘菌素E標(biāo)準(zhǔn)曲線的x斜率和y軸截距；此標(biāo)準(zhǔn)曲線由實(shí)驗(yàn)室以多粘菌素E硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)樣品的水溶液制作。

式（2）中：YT為T(mén)時(shí)刻各取樣點(diǎn)發(fā)酵液樣品多粘菌素E的效價(jià)（U·mL-1）；YEP為葡萄糖對(duì)照組發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)多粘菌素E的效價(jià)（U·mL-1）；YR為多粘菌素E的相對(duì)效價(jià)（%）。

1.5.2 單位菌體多粘菌素E相對(duì)效價(jià)的計(jì)算

根據(jù)公式（3）和（4）計(jì)算單位菌體多粘菌素E的相對(duì)效價(jià)YPR（%），用于表征碳源對(duì)多粘菌素E合成能力的影響。

式（3）中：YP為發(fā)酵終點(diǎn)各組的效價(jià)（U· mL-1）；Bmax為發(fā)酵過(guò)程菌體生物量的最大值（106cfu·mL-1），以106cfu為1個(gè)菌體單位；YPB為各組發(fā)酵終點(diǎn)的效價(jià)與最大菌體生物量的比值（U·106cfu-1）。

式（4）中：YPB為試驗(yàn)組發(fā)酵終點(diǎn)的效價(jià)與最大菌體生物量的比值（U·106cfu-1）；YPG為對(duì)照組發(fā)酵終點(diǎn)的效價(jià)與最大菌體生物量的比值（U· 106cfu-1）；YPR則為單位菌體多粘菌素E的相對(duì)效價(jià)（%）。

1.5.3 多粘菌素E相對(duì)合成速率的計(jì)算

由公式（5）和公式（6）分別計(jì)算試驗(yàn)組和對(duì)照組各個(gè)時(shí)間段多粘菌素 E的合成速率（U· mL-1·h-1）和相對(duì)合成速率（%），用于表征碳源對(duì)多粘菌素E合成速率的影響。

式（5）中：YRn-YRr為各組單位體積發(fā)酵液中每12 h合成的多粘菌素E的量（U·mL-1）；YS為每h多粘菌素 E的平均合成速率（U·mL-1· h-1）。

式（6）中：YSCM為試驗(yàn)組多粘菌素E的最大合成速率（U·mL-1·h-1）；YSGM為葡萄糖對(duì)照組多粘菌素E的最大合成速率（U·mL-1·h-1）；YSR為多粘菌素E的相對(duì)合成速率（%）。

1.5.4 碳源轉(zhuǎn)化為多粘菌素E相對(duì)轉(zhuǎn)化率的計(jì)算

根據(jù)公式（7）和（8）計(jì)算碳源的相對(duì)轉(zhuǎn)化率

式（7）中：C為碳源轉(zhuǎn)化為多粘菌素E的轉(zhuǎn)化率（U·g-1）；MS-MF為單位體積發(fā)酵液中碳源的消耗量，即初始培養(yǎng)基添加量與發(fā)酵結(jié)束后培養(yǎng)基殘留量的差值（g·L-1）；YF為發(fā)酵終點(diǎn)多粘菌素E的效價(jià)（U·L-1）。

式（8）中：CR為碳源轉(zhuǎn)化為多粘菌素E的相對(duì)轉(zhuǎn)化率（%）；CSM為發(fā)酵過(guò)程中試驗(yàn)組碳源轉(zhuǎn)化為多粘菌素E的轉(zhuǎn)化率（U·g-1）；CGM為發(fā)酵過(guò)程中對(duì)照組葡萄糖轉(zhuǎn)化為多粘菌素E的轉(zhuǎn)化率（U·g-1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)多粘類(lèi)芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

將相同含量的多粘類(lèi)芽孢桿菌接入不同質(zhì)量濃度葡萄糖的液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)22 h，取樣，測(cè)定D600，結(jié)果如圖1所示。培養(yǎng)基中初始葡萄糖濃度小于20 g·L-1有利于多粘類(lèi)芽孢桿菌的生長(zhǎng)，當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到20 g·L-1時(shí)，液體培養(yǎng)基中菌體含量達(dá)到最大值。葡萄糖濃度大于20 g·L-1會(huì)抑制多粘類(lèi)芽孢桿菌的生長(zhǎng)，葡萄糖質(zhì)量濃度越高，菌體生長(zhǎng)受抑制程度越嚴(yán)重。當(dāng)葡萄糖濃度為50 g·L-1時(shí)，其最大菌體含量?jī)H為以20 g·L-1葡萄糖最大菌體含量的64%。表明一定濃度的葡萄糖促進(jìn)多粘類(lèi)芽孢桿菌的生長(zhǎng)，而高濃度的葡萄糖則會(huì)抑制多粘類(lèi)芽孢桿菌的生長(zhǎng)。

圖1 不同葡萄糖質(zhì)量濃度下多粘類(lèi)芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of Paenibacillus polymyxa in different concentrations of glucose

2.2 碳源對(duì)多粘類(lèi)芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

將多粘類(lèi)芽孢桿菌按照1.3節(jié)的方法進(jìn)行培養(yǎng)，由圖2可知，不同碳源培養(yǎng)基中多粘類(lèi)芽孢桿菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)相似。在發(fā)酵0—12 h，葡萄糖對(duì)照組多粘類(lèi)芽孢桿菌開(kāi)始快速生長(zhǎng)，但此時(shí)的菌體含量相對(duì)最少，之后菌體開(kāi)始快速生長(zhǎng)，在36 h生物量最先達(dá)到最高值，可能葡萄糖作為速效碳源被菌體迅速利用，從而促進(jìn)菌體生長(zhǎng)；發(fā)酵36 h后菌體開(kāi)始進(jìn)入衰亡期，多粘類(lèi)芽孢的生長(zhǎng)受到抑制。在蔗糖、乳糖和麥芽糖試驗(yàn)組中，發(fā)酵48 h內(nèi)菌體處于快速生長(zhǎng)期，之后菌體開(kāi)始進(jìn)入衰亡期。而在可溶性淀粉試驗(yàn)組中，發(fā)酵0—60 h，多粘類(lèi)芽孢桿菌處于快速生長(zhǎng)期，至60 h菌體量達(dá)到最大，可能因?yàn)榭扇苄缘矸鄣睦眯枰w合成的淀粉酶將其分解為葡萄糖才能進(jìn)入同化途徑供給菌體生長(zhǎng)，有一定的生長(zhǎng)延遲現(xiàn)象。5組試驗(yàn)組中，可溶性淀粉試驗(yàn)組的生物量最后達(dá)到最高。

2.3 碳源對(duì)多粘菌素發(fā)酵過(guò)程中pH值、還原糖、總糖含量的影響

圖2 多粘菌素E發(fā)酵過(guò)程中碳源對(duì)多粘類(lèi)芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.2 　Influence of carbon sources on the growth of Paenibacillus polymyxa during polymyxin E fermentation

培養(yǎng)基pH值是菌體生長(zhǎng)代謝的重要表征，對(duì)抗生素的合成至關(guān)重要［21］。由圖3-A可知，各試驗(yàn)組發(fā)酵過(guò)程中，pH變化趨勢(shì)基本相同，由于碳源的快速消耗，pH值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；發(fā)酵36 h后，不同碳源引起的pH值差異趨于明顯，其中，葡萄糖對(duì)照組pH呈現(xiàn)最高值，而可溶性淀粉試驗(yàn)組的pH值維持在最低水平。從圖3-B和3-C可知，在發(fā)酵過(guò)程中，各試驗(yàn)組對(duì)糖的利用趨勢(shì)相似；發(fā)酵開(kāi)始后，各試驗(yàn)組還原糖含量迅速下降，發(fā)酵48 h后葡萄糖對(duì)照組的還原糖含量不再變化，維持在最高水平，而可溶性淀粉試驗(yàn)組的還原糖含量維持在最低水平；各試驗(yàn)組的總糖含量基本維持在相同水平。

圖3 碳源對(duì)多粘菌素E發(fā)酵過(guò)程中pH值、還原糖和總糖的影響Fig.3 Influence of carbon sources on pH，reducing sugar and total sugar during polymyxin E fermentation

2.4 碳源對(duì)多粘菌素E產(chǎn)量及其合成速率的影響

從圖4-A可見(jiàn)，不同碳源對(duì)多粘菌素E產(chǎn)量的影響不同，其最終效價(jià)依次為可溶性淀粉＞乳糖＞蔗糖＞麥芽糖＞葡萄糖。其中，可溶性淀粉和乳糖試驗(yàn)組的多粘菌素E合成能力高于其他組，其最終相對(duì)效價(jià)分別是以葡萄糖對(duì)照組的2.11和1.58倍?？扇苄缘矸墼囼?yàn)組中，多粘類(lèi)芽孢桿菌在12 h開(kāi)始合成多粘菌素E，葡萄糖對(duì)照組和其他試驗(yàn)組在24 h才開(kāi)始合成多粘菌素E。對(duì)比圖3-B和圖3-C，推測(cè)高濃度的葡萄糖不利于多粘菌素E的合成，而可溶性淀粉試驗(yàn)組中淀粉酶的緩慢釋放所產(chǎn)生低濃度的還原糖沒(méi)有葡萄糖效應(yīng)，有利于多粘菌素E的生物合成。從圖4-B多粘菌素E合成速率可知，不同試驗(yàn)組中多粘菌素E的合成速率趨勢(shì)相似，均在36～48 h達(dá)到最大合成速率，之后開(kāi)始下降。發(fā)酵84 h之后，葡萄糖對(duì)照組、蔗糖試驗(yàn)組和麥芽糖試驗(yàn)組的合成速率降為0，而乳糖試驗(yàn)組和可溶性淀粉試驗(yàn)組依然可以維持一定的合成速率。葡萄糖對(duì)照組合成速率最高值相對(duì)最低，乳糖試驗(yàn)組和可溶性淀粉試驗(yàn)組的相對(duì)合成速率最大，分別比葡萄糖對(duì)照組高51%和60%，說(shuō)明非速效碳源——乳糖和可溶性淀粉可以提高多粘菌素E的合成速率，同時(shí)相對(duì)延長(zhǎng)合成時(shí)間，從而提高多粘菌素E的產(chǎn)量。

圖4 碳源對(duì)多粘菌素E相對(duì)效價(jià)及相對(duì)合成速率的影響Fig.4 Influence of carbon sources on relative polymyxin E production and relative synthetic rate of polymyxin E

2.5 碳源對(duì)單位菌體多粘菌素E產(chǎn)量的影響

多粘菌素E是在細(xì)胞內(nèi)合成的，其合成與細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定的相關(guān)性。根據(jù)1.5.2節(jié)公式（3）和（4）計(jì)算單位菌體的多粘菌素E產(chǎn)量，橫坐標(biāo)表示不同碳源的試驗(yàn)組別，結(jié)果見(jiàn)圖5?？扇苄缘矸墼囼?yàn)組中單位菌體合成多粘菌素E的能力最強(qiáng)，乳糖試驗(yàn)組次之，葡萄糖對(duì)照組最低，推測(cè)乳糖和可溶性淀粉可以調(diào)節(jié)多粘類(lèi)芽孢桿菌的次級(jí)代謝，促進(jìn)多粘菌素E的生物合成。

2.6 碳源轉(zhuǎn)化為多粘菌素E的差異

根據(jù)1.5.4節(jié)方法計(jì)算不同碳源的相對(duì)轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如圖6所示。在發(fā)酵過(guò)程中不同碳源的多粘菌素E轉(zhuǎn)化效率不同。在各試驗(yàn)組中，可溶性淀粉—多粘菌素E的相對(duì)轉(zhuǎn)化率最高，乳糖—多粘菌素E的相對(duì)轉(zhuǎn)化率次之，葡萄糖—多粘菌素E的相對(duì)轉(zhuǎn)化效率最低。由此可知，可溶性淀粉更有利多粘類(lèi)芽孢桿菌合成多粘菌素E。2.7 不同碳源對(duì)多粘類(lèi)芽孢桿菌合成多粘菌素的影響

圖5 碳源對(duì)單位菌體多粘菌素E產(chǎn)量的影響Fig.5 Influence of carbon sources on the polymyxin E production per unit biomass

圖6 碳源轉(zhuǎn)化為多粘菌素E的相對(duì)效率Fig.6 　The relative conversion efficiency of carbon sources to the polymyxin E production

由上述試驗(yàn)結(jié)果可知，多粘類(lèi)芽孢桿菌在不同碳源條件下進(jìn)行發(fā)酵，其合成多粘菌素E的結(jié)果不同，將其主要發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行匯總，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，各試驗(yàn)組消耗的碳源無(wú)明顯差別，最大生物量相近，但是多粘菌素E相對(duì)效價(jià)相差較大，其中，以可溶性淀粉為碳源的試驗(yàn)組相對(duì)效價(jià)最高、合成速率最快、單位菌體合成能力最強(qiáng)，其最大值分別為葡萄糖對(duì)照組的211%、160%和197%。上述結(jié)果表明，多粘類(lèi)芽孢桿菌利用可溶性淀粉轉(zhuǎn)化為多粘菌素E的效率高，合成速率快，使單位菌體合成多粘菌素E的能力增強(qiáng)，因此，可溶性淀粉是多粘菌素E生物合成的最適碳源。

表1 不同碳源培養(yǎng)基中多粘類(lèi)芽孢桿菌合成多粘菌素E的比較Table 1 The comparison of the synthesis of polymyxin E by Paenibacillus polymyxa in the culture medium containing different carbon sources

3 討論

多粘菌素E作為動(dòng)物飼養(yǎng)促長(zhǎng)藥物，主要用于治療革蘭氏陰性菌（尤其是耐藥性革蘭氏陰性菌）引起的感染，抗菌作用強(qiáng)，飼養(yǎng)效果好，未來(lái)市場(chǎng)需求極大［4］，但是發(fā)酵過(guò)程中容易出現(xiàn)碳代謝阻遏效應(yīng)［22］，導(dǎo)致多粘菌素E產(chǎn)量較低。

在抗生素發(fā)酵過(guò)程中，葡萄糖是廣泛應(yīng)用的能源和碳源，能被菌體快速利用，維持菌體生長(zhǎng)和初級(jí)代謝，為次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成提供前體，但是高濃度的葡萄糖會(huì)通過(guò)碳阻遏效應(yīng)抑制抗生素合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和相關(guān)酶的活性，從而抑制抗生素的合成［11，22］。而淀粉作為非速效碳源，能夠避免葡萄糖引起的碳阻遏效應(yīng)，保障菌體的生長(zhǎng)和次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成。陳小煌等［23］發(fā)現(xiàn)可溶性淀粉對(duì)多粘類(lèi)芽孢桿菌的生長(zhǎng)優(yōu)于葡萄糖，陶銀英［24］的研究表明，可溶性淀粉對(duì)多粘菌素E的促進(jìn)作用優(yōu)于葡萄糖，本研究結(jié)論與此一致。

多粘菌素E作為一種多肽類(lèi)抗生素，其前體氨基酸通過(guò)TCA循環(huán)和氨基酸合成途徑合成。因此，菌體初級(jí)代謝強(qiáng)度與多粘菌素E產(chǎn)量有一定的相關(guān)性。發(fā)酵過(guò)程pH結(jié)果表明，可溶性淀粉試驗(yàn)組菌體初級(jí)代謝過(guò)程較強(qiáng)，能產(chǎn)生較多的副產(chǎn)物有機(jī)酸，使pH下降（圖3），而在葡萄糖對(duì)照組中，初始葡萄糖質(zhì)量濃度高，導(dǎo)致發(fā)酵中后期菌體自溶過(guò)早（圖2），pH較高（圖3），使菌體初級(jí)代謝和次級(jí)代謝異常，多粘菌素E產(chǎn)量較低。同時(shí)，劉鐵軍等［25］對(duì)多肽類(lèi)抗生素桿菌肽的發(fā)酵研究表明，適宜的葡萄糖質(zhì)量濃度有利于避免碳阻遏效應(yīng)，維持初級(jí)代謝和次級(jí)代謝相對(duì)平衡，提高抗生素產(chǎn)量。由此可知，在可溶性淀粉試驗(yàn)組中，多粘類(lèi)芽孢桿菌能夠分解可溶性淀粉維持一定量的葡萄糖質(zhì)量濃度，可以平衡發(fā)酵過(guò)程中初級(jí)代謝和次級(jí)代謝強(qiáng)度，既能為菌體生長(zhǎng)提供必需的前提也能為多粘菌素E的合成提供前提氨基酸。

此外，研究發(fā)現(xiàn)，在多粘菌素E的生物合成中，多糖聚合物可溶性淀粉高于蔗糖和葡萄糖，其可溶性淀粉試驗(yàn)組中，較低濃度的葡萄糖能夠避免碳阻遏效應(yīng)，維持菌體良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。同時(shí)，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中多粘菌素E效價(jià)、合成速率以及相對(duì)轉(zhuǎn)化效率的研究發(fā)現(xiàn)，可溶性淀粉能夠提高多粘菌素E的合成速率，延長(zhǎng)產(chǎn)素期，維持較高的轉(zhuǎn)化率，從而使多粘菌素E的產(chǎn)量提高，是合成多粘菌素E較為理想的非速效碳源。

（References）：

［1］ AZZOPARDI E A，F(xiàn)ERGUSON E L，THOMAS D W，et al. Colistin past and future：A bibliographic analysis［J］.Journal of Critical Care，2013，28（2）：13-19.

［2］ LI C H，BUDGE L P，DRISCOLL C D，et al.Incremental conversion of outer-membrane permeabilizers into potent antibiotics for Gram-negative bacteria［J］.American Chemical Society，1999，121（5）：931-940.

［3］ SAMPSON T R，LIU X，SCHROEDER M R，et al.Rapid killing of Acinetobacter baumannii by polymyxins is mediated by a hydroxyl radical death pathway［J］.Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2012，56（11）：5642-5649.

［4］ 張純萍，肖希龍.硫酸粘桿菌素微生物檢定法的改進(jìn)［J］.中國(guó)獸藥雜志，2002，36（4）：33-35. ZHANG C P，XIAO X L.Improved microbiological assay for determining colistin sulfate in serum［J］.Chinese Journal of Veterinary Drug，2002，36（4）：33-35.（in Chinese）

［5］ EVANS M E，F(xiàn)EOLA D J，RAPP R P.Polymyxin B sulfate and colistin：old antibiotics for emerging multiresistant Gramnegative bacteria［J］.The Annals of Pharmacotherapy，1999，33（9）：960-967.

［6］ CHOI S K，PARK S Y，KIM R，et al.Identification of a polymyxin synthetase gene cluster of Paenibacillus polymyxa and heterologous expression of the gene in Bacillus subtilis［J］. Journal of Bacteriology，2009，191（10）：3350-3358.

［7］ PARK S Y，CHOI S K，KIM J，et al.Efficient production of polymyxin in the surrogate host Bacillus subtilis by introducing a foreign ectB gene and disrupting the abrB gene［J］.Applied and Environmental Microbiology，2012，78（12）：4194 -4199.

［8］ RESHETNIKOV A S，KHMELENINA V N，MUSTAKHIMOV I I，et al.Genes and enzymes of ectoine biosynthesis in halotolerant methanotrophs［J］.Methods in Enzymology，2011，495：15-30.

［9］ SCHUBERT T，MASKOW T，BENNDORF D，et al.Continuous synthesis and excretion of the compatible solute ectoine by a transgenic，nonhalophilic bacterium［J］.Applied and Environmental Microbiology，2007，73（10）：3343-3347.

［10］ 王鏡巖，朱圣庚，徐長(zhǎng)法.生物化學(xué)［M］.北京：高等教育出版社，2002.

［11］ ROKEM J S，LANTZ A E，NIELSEN J.Systems biology of antibiotic production by microorganisms［J］.Natural Product Reports，2007，24（6）：1262-1287.

［12］ HAMEDI J，MALEKZADEH F.Enhancing of erythromycin production by Saccharopolyspora erythraea with common and uncommon oils［J］.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2004，31（10）：447-456.

［13］ KIM N R，LIM J S，et al.Optimization of feed conditions in a 2.5-l fed-batch culture using rice oil to improve cephalosporin C production by Cephalosporium acremonium M25［J］. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2005，21 （5）：322-323.

［14］ JIA B，JIN Z H，MEI L H.Medium optimization based on statistical methodologies for pristinamycins production by Streptomyces pristinaespiralis［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2008，144（2）：133-143.

［15］ SIDDIQUE S，SYED Q，ADNAN A，et al.Production of avermectin B1b from Streptomyces avermitilis 41445 by batch submerged fermentation［J］.Jundishapur Journal of Microbiology，2013，6（8）：1-6.

［16］ YU Z L，GUO C L，QIU J P.Precursor amino acids inhibit polymyxin E biosynthesis in Paenibacillus polymyxa，probably by affecting the expression of polymyxin E biosynthesis-associatedgene［J］.BioMedResearchInternational，2015：690830.

［17］ 張永勤，王哲平，宋雨梅，等.還原糖測(cè)定方法的比較研究［J］.食品工業(yè)科技，2010，31（6）：322-323. ZHANG Y Q，WANG Z P，SONG Y M，et al.Comparative study on the determination of reducing sugar［J］.Science and Technology of Food Industry，2010，31（6）：322-323.（in Chinese with English abstract）

［18］ 武發(fā)菊，陳繼紅，梁仲軍，等.應(yīng)用不同方法測(cè)定阿維菌素發(fā)酵液中的總糖含量［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2007，26 （1）：36-39. WU F J，CHEN J H，LIANG Z J，et al.Determination on total sugar contents in avermectins fermented liquid by different methods［J］.Journal of Traditional Chinese Veterinary Medicine，2007，26（1）：36-39.（in Chinese with English abstract）

［19］ 周德慶.微生物學(xué)教程 ［M］.北京：高等教育出版社，2002：151-152.

［20］ 蔡元寧，余志良，趙春田，等.多粘類(lèi)芽孢桿菌的保藏及復(fù)壯方法研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，27（1）：75 -79. CAI Y N，YU Z L，ZHAO C T，et al.Preservation method and rejuvenation method of Paenibacillus polymyxa［J］.Acta Agriculturae Zhejiangensis，2015，27（1）：75-79.（in Chinese with English abstract）

［21］ DESAI R P，LEAF T，WOO E，et al.Enhanced production of heterologous macrolide aglycones by fed-batch cultivation of Streptomyces coelicolor［J］.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2002，28（5）：297-301.

［22］ SERGIO S N，ADAN C V，F(xiàn)ORERO A，et al.Carbon source regulation of antibiotic production［J］.The Journal of Antibiotics，2010，63（8）：442-459.

［23］ 陳小煌，李自然，黃小云，等.多粘類(lèi)芽孢桿菌培養(yǎng)條件優(yōu)化研究［J］.福州大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，41 （5）：947-954. CHEN X H，LI Z R，HUANG X Y，et al.Optimization of culture conditions of Paenibacillus polymyxa［J］.Journal of Fuzhou University（Natural Science Edition），2013，41（5）：947-954.（in Chinese with English abstract）

［24］ 陶銀英.多粘菌素E產(chǎn)生菌高通量誘變育種的研究［D］.杭州：浙江大學(xué)，2006. TAO Y Y.Study on the high throughput strategy to screen strains with high polymyxin e productivity［D］.Hangzhou：Zhejiang University，2006.（in Chinese with English abstract）

［25］ 劉鐵軍，吳飛.葡萄糖濃度對(duì)桿菌肽發(fā)酵過(guò)程的影響［J］.醫(yī)學(xué)信息（中旬刊），2011，24（9）：4659-4660. LIU T J，WU F.Effect of glucose concentration on bacitracin fermentation process［J］.Medical Information Operations Sciences Fascicule，2011，24（9）：4659-4660.（in Chinese with English abstract）

（責(zé)任編輯 侯春曉）

Effect of carbon sources on growth of Paenibacillus polymyxa and polymyxin E synthesis

SUN Zhong-qi1，QIU Juan-ping1，LU Jian-wei2，ZHAO Chun-tian1，*
（1.College of Biotechnology and Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China；2.Zhejiang Qianjiang Biochemical Co.，Ltd，Haining 314400，China）

In order to explore new methods to improve the yield of polymyxin E，five different carbon sources including glucose，sucrose，maltose，lactose and soluble starch were added in the fermentation medium，respectively. The influence on Paenibacillus polymyxa growth and polymyxin E production of different carbon sources were investigated through plate counting method and HPLC method.The results indicated that the effects of different carbon sources on the growth of Paenibacillus polymyxa and the polymyxin E production varied significantly.The effect of these carbon sources on polymyxin E production was：soluble starch＞lactose＞sucrose＞maltose＞glucose.Soluble starch promoted both cell growth and polymyxin E yield by extending the polymyxin E biosynthetic period and promoting the synthetic rate.Compared with glucose as carbon source，the yield and the synthetic rate of polymyxin E were increased by 111%and 60%，respectively.Therefore，soluble starch was the optimal candidate for carbon sources among the five carbohydrates in polymyxin E synthese.

Paenibacillus polymyxa；polymyxin E；carbon source；soluble starch

S859.79；Q939.9

A

1004-1524（2016）08-1343-08

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.08.11

2015-12-08

浙江省生物工程重中之重學(xué)科開(kāi)放基金項(xiàng)目（20130103）；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（Y2111182）

孫仲奇（1990—），男，河南洛陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物學(xué)。E-mail：570987494@qq.com
*

，趙春田，E-mail：zct2008@yahoo.com