舒端陽(yáng)

(廣東省揭陽(yáng)華僑高級(jí)中學(xué) 522000)

1 單酶切

由于高中生普遍沒(méi)有接觸過(guò)分子生物學(xué)，概念上比較模糊，所以高中生物學(xué)教材只介紹相對(duì)簡(jiǎn)單的單酶切，有利于學(xué)生的理解和接受。但單酶切在實(shí)驗(yàn)室操作的時(shí)候，容易出現(xiàn)反連甚至是載體之間的自連現(xiàn)象，因此單酶切的方法并非適應(yīng)基因工程的所有項(xiàng)目。

例如，2012年高考江蘇卷第32題就涉及此問(wèn)題，相關(guān)信息如下：圖1 表示含有目的基因D的DNA 片段長(zhǎng)度(bp即堿基對(duì))和部分堿基序列，圖2表示一種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和部分堿基序列?，F(xiàn)有MspI、BamHI、MboI、SmaI 4 種限制性核酸內(nèi)切酶，它們識(shí)別的堿基序列和酶切位點(diǎn)分別為C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。提出的問(wèn)題是：若將圖2中質(zhì)粒和目的基因D通過(guò)同種限制酶處理后進(jìn)行連接，形成重組質(zhì)粒。但經(jīng)檢測(cè)，部分含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中目的基因D不能正確表達(dá)，其最可能的原因是什么？

分析：根據(jù)題意，應(yīng)采用BamHI進(jìn)行單酶切。所得到的目的基因D與質(zhì)粒兩頭的黏性末端都是相同的。由于在進(jìn)行連接反應(yīng)時(shí)，目的基因和載體是隨機(jī)碰撞的，且兩者的兩端黏性末端都相同。所以，基因D既可以與質(zhì)粒正向連接(正連)，即目的基因順時(shí)針地按其上游到下游的方向與載體相連(與啟動(dòng)子的順時(shí)針?lè)较蛞恢?，這樣，目的基因就能從上游到下游正常轉(zhuǎn)錄，表達(dá)產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)，產(chǎn)生預(yù)期的性狀；目的基因也可以與質(zhì)粒反向連接(反連)，即目的基因的上下游方向顛倒地與載體相連，結(jié)果目的基因的轉(zhuǎn)錄從下游到上游，導(dǎo)致密碼子全部改變，目的基因不能正常表達(dá)。為了防止出現(xiàn)反連現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)中常用雙酶切的方法。

2 雙酶切

雙酶切，即采用兩種不同的限制酶同時(shí)處理目的基因和質(zhì)粒。因?yàn)橄拗泼妇哂刑禺愋?，不同的酶作用于不同的堿基序列，所以得到的黏性末端也是不同的。當(dāng)應(yīng)用DNA連接酶進(jìn)行連接時(shí)，就只能存在一種正連情況，而不會(huì)出現(xiàn)反連的問(wèn)題。正因?yàn)榭梢杂行У胤乐瑰e(cuò)誤連接的現(xiàn)象出現(xiàn)，雙酶切的做法被廣泛應(yīng)用于基因工程中表達(dá)載體的構(gòu)建，也可以用于制備體外轉(zhuǎn)錄的模板。

RNA干擾(RNAi)是由雙鏈RNA(dsRNA)引起的同源mRNA特異性降解的現(xiàn)象，可以定向地關(guān)閉某個(gè)基因的表達(dá)，因而被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)的眾多領(lǐng)域。要對(duì)某個(gè)基因進(jìn)行有效的沉默，就需要得到與這個(gè)基因具有相同序列的dsRNA，而制備dsRNA的過(guò)程需要應(yīng)用雙酶切和單酶切的處理方法。

如何制備dsRNA呢？通常要選擇一種叫做pLITMUS28i的質(zhì)粒，該質(zhì)粒最大的特點(diǎn)是帶有兩個(gè)T7啟動(dòng)子，且轉(zhuǎn)錄方向是相反的，在兩個(gè)啟動(dòng)子之間有一些常用的酶切位點(diǎn)。

首先，用雙酶切(BamHI和EcoRI)同時(shí)處理目的基因和質(zhì)粒pLITMUS28i；連接后獲得重組質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒平均分成兩份，分別被BamHI和EcoRI進(jìn)行單酶切，獲得轉(zhuǎn)錄用的模板；加入RNA聚合酶和4種核糖核苷酸(NTP)后，在室溫下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，得到單鏈RNA。因?yàn)檫@些單鏈RNA本身是互補(bǔ)的，所以低溫下退火即可制備得到dsRNA，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入相應(yīng)受體細(xì)胞就可用于進(jìn)行RNAi的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

圖1 含有目的基因D的DNA片段長(zhǎng)度和部分堿基序列

圖2 一種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和部分堿基序列