基于HPLC技術(shù)分析白芍根莖與主根部分的主成分含量差異

鄭金鳳 王景紅 宗志勇 路廣義

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基于HPLC技術(shù)分析白芍根莖與主根部分的主成分含量差異

鄭金鳳 王景紅 宗志勇 路廣義

目的 采用高效液相色譜法檢測(cè)亳芍不同的樣品處理方法下主根和根莖部分芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量。方法 采用高效液相色譜法，色譜條件：C18柱（phenomenex公司，250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（25：75）；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；柱溫：30℃；流速為1.0 mL/min。結(jié)果 經(jīng)過(guò)煮制后的白芍去皮主根或根莖所含芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的總含量低于未煮制；白芍的主根和根莖部分去皮后芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷總含量高于未去皮的主根和根莖；無(wú)論是否煮制，是否去皮，白芍根莖中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量均高于主根。結(jié)論 白芍根莖有作為藥用部位的基礎(chǔ)。

白芍根莖； 芍藥苷； 芍藥內(nèi)酯苷； 高效液相色譜法

白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根。采挖后，洗凈，除去頭尾和細(xì)根，置沸水中煮后除去外皮或去皮后再煮，曬干，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽(yáng)的作用［1］。白芍主要含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等單萜類成分，主產(chǎn)于安徽亳州、浙江杭州、四川中江等地。根莖在白芍的加工過(guò)程中，屬于非藥用部位，被去除，但目前市場(chǎng)收購(gòu)者眾多，前期實(shí)驗(yàn)也表明同株白芍根莖的芍藥苷含量高于主根。為探討白芍根莖與主根之間的差異，是否可作為藥材使用，本文從有效成分含量角度來(lái)探討白芍根莖和主根之間的差異。

1 儀器與材料

安捷倫1200B型高效液相色譜儀（G1312B型二元泵，G1315C型DAD檢測(cè)器，ChemStation化學(xué)工作站）；電子天平：BP211D（Sautoris，德國(guó)）d=0.1 mg/0.01 mg，max=210 g/80 g；超聲波清洗器：KQ5200DB型，昆山市儀器有限公司。

乙腈（迪馬公司，色譜純）、水為重蒸水，磷酸等其他試劑均為分析純。試藥：芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-201337）購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；芍藥內(nèi)酯苷對(duì)照品（P/N：ABF-378105）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：C18柱（phenomenex公司，250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（25∶75）；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；柱溫：30℃；流速為1.0 mL/min。

2.2 藥材及加工處理方法

取同一種植基地3年生亳芍30株，分為3組，各10株。洗凈，去除雜質(zhì)、芽孢、須根，保留主根和根莖。（1）將主根和根莖去除外皮，分別煮制15分鐘，曬干。（2）將主根和根莖分別煮制15分鐘，曬干，得白芍主根、根莖。（3）將主根和根莖去除外皮，直接曬干，得白芍去皮主根、根莖。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷對(duì)照品適量，加稀乙醇分別制成每1 mL含芍藥苷83.2 μg和芍藥內(nèi)酯苷34.4 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

2.4.1 提取溶劑的選擇 取白芍主根粉末0.1 g，共三份，置50 mL量瓶中，分別加入稀乙醇、95%乙醇、甲醇35 mL，超聲處理30分鐘，放冷，再分別加稀乙醇、95%乙醇、甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。結(jié)果表明：稀乙醇提取的芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷含量最高，故選擇稀乙醇為提取溶媒。具體見(jiàn)表1。

表1 不同提取溶劑的比較

2.4.2 提取方法的選擇 取白芍主根粉末0.1 g，共兩份，置50 mL量瓶中，各加稀乙醇35 mL，分別進(jìn)行浸漬處理和超聲處理30分鐘，放冷，分別加稀乙醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。結(jié)果表明：超聲提取比浸漬提取含量略高，故選擇超聲提取方法。具體見(jiàn)表2。

表2 不同提取方法的比較

2.4.3 提取時(shí)間的選擇 取白芍主根粉末0.1 g，共三份，置50 mL量瓶中，各加稀乙醇35 mL，分別超聲處理15分鐘、30分鐘、45分鐘，放冷，再加稀乙醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。結(jié)果表明：超聲30分鐘即可提取完全，故選擇提取時(shí)間為30分鐘。具體見(jiàn)表3。

表3 不同提取時(shí)間的比較

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性試驗(yàn) 按2.4項(xiàng)下供試品制備方法制備陰性對(duì)照溶液和供試品溶液。吸取陰性對(duì)照溶液和供試品溶液兩種溶液及芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷混合對(duì)照品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀。結(jié)果陰性對(duì)照色譜圖中無(wú)峰無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

2.5.2 線性關(guān)系考察 精密吸取芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷混合對(duì)照品溶液2、6、10、14、20 μL進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程，芍藥苷：Y=1042X -2.129，R2=1；芍藥內(nèi)酯苷：Y=912.8X+6.2729，R2=0.9999。結(jié)果表明芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷分別在0.1664～1.664 μg，0.0688～0.688 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 對(duì)照品和供試品溶液HPLC圖

2.5.3 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定各峰面積。結(jié)果：芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的RSD分別為0.23%、0.09%，精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，精密稱定，按2.4項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成供試品溶液，分別測(cè)定芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷峰面積，計(jì)算含量，計(jì)算RSD。結(jié)果：芍藥苷的平均含量為1.25%，RSD為1.05%；芍藥內(nèi)酯苷的平均含量為3.42%，RSD為1.79%。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、4、8、16、24小時(shí)進(jìn)樣10 μL，測(cè)定供試品溶液的峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果：芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的RSD分別為0.33%、0.11%，二者穩(wěn)定性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品約0.05 g，共6份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入各對(duì)照品適量，按照2.4項(xiàng)下供試品制備方法制備加樣回收供試品溶液，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果：芍藥內(nèi)酯苷平均回收率為97.02%，RSD為1.93%；芍藥苷平均回收率為97.61%，RSD為1.46%，加樣回收率良好。

2.6 樣品含量測(cè)定

按2.2項(xiàng)下藥材及加工處理方法處理藥材，分別取3組樣品粉末0.1 g，精密稱定，按照2.4項(xiàng)下供試品制備方法操作，10個(gè)批次，每個(gè)批次平行2份，測(cè)定白芍主根和根莖部分中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量。結(jié)果：經(jīng)過(guò)煮制后的白芍去皮主根或根莖芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷總含量低于未煮制。無(wú)論是否煮制，白芍根莖中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量均高于主根。具體見(jiàn)表4。

表4 白芍樣品（是否煮制）主成分的含量測(cè)定（n=10）

白芍的主根和根莖部分去皮后芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷總含量高于未去皮的方法。其中芍藥苷的含量去皮的方法高于未去皮，而芍藥內(nèi)酯苷的含量則低于未去皮的方法，說(shuō)明在皮中可能芍藥內(nèi)酯苷的含量較高。無(wú)論是否去皮，白芍根莖中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量均高于主根。具體見(jiàn)表5。

表5 白芍樣品（是否去皮）主成分含量測(cè)定（n=10）

3 討論

本文對(duì)白芍中主要成分芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的色譜方法進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)色譜柱型號(hào)、流動(dòng)相的選擇、流速、柱溫等進(jìn)行篩選，最終建立了含量測(cè)定方法，此方法所測(cè)成分色譜峰與其他成分分離良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：白芍主根或根莖經(jīng)過(guò)煮制后的芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷低于未煮制的總含量；白芍的主根和根莖部分去皮后芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷總含量高于未去皮相同部位；無(wú)論是否煮制，是否去皮白芍根莖中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量均高于主根，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致。吳雄壯等［2］實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：相同生長(zhǎng)年限的白芍其根莖部位的芍藥苷含量比主根部位明顯偏高，不同生長(zhǎng)年限的白芍根莖部位的芍藥苷含量相差不大。周學(xué)剛等［3-4］實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：白芍地下各部分芍藥苷含量差異明顯，均呈現(xiàn)根莖＞須根＞主根?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》（一部）規(guī)定白芍藥用部位為根，加工方法為置沸水中煮后除去外皮或去皮后再煮，曬干。但從本實(shí)驗(yàn)不同藥用部位的白芍主要成分芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷含量可以看出，采集部位建議保留根莖。實(shí)驗(yàn)僅以亳芍為樣本，未對(duì)不同產(chǎn)地的白芍加以比較，且僅對(duì)主要成分芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷進(jìn)行測(cè)定，需進(jìn)一步研究白芍根莖和主根HPLC指紋圖譜之間的成分差異。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：105.

［2］ 吳雄壯，王美芳，楊思沅，等.不同部位和不同生長(zhǎng)年限白芍中的芍藥苷含量測(cè)定［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2006，23（4）：291-293.

［3］ 周學(xué)剛，張麗萍，王艷芳，等.煮制對(duì)白芍中芍藥苷含量的影響［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，30（1）：82-85.

［4］ 周學(xué)剛，陳淑欣，魏東華，等.不同種質(zhì)和不同部位白芍原植物中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量測(cè)定［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，30 （11）：1477-1480.

（本文編輯：董歷華）

Determination of paeoniflorin and albiflorin in taproot and rhizome of Paeonia lactiflora Pall.

ZHENG Jin-feng，WANG Jing-hong，ZONG Zhi-yong，et al. Wangjing Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100102，China

LU Guang-yi，E-mail：lulutong200504@163.com

Objective To determine the content of paeoniflorin and albiflorin in the different sample treatment of Paeonia lactiflora Pall..Methods The HPLC method was used to detected，the chromatographic condition was RP-C18（4 mm×250 mm，5 μm）column with HCN-water（25∶75）as mobile phase，flow velocity was 1.0 mL/min，with the detection wavelength was 230 nm，column temperature was 30℃.Results The content of paeoniflorin and albiflorin in taproot and rhizome of Paeonia lactiflora Pall. was increased after peeled.Whether boiled or peeled，the content of paeoniflorin and albiflorin in rhizome was higher than taproot of Paeonia lactiflora Pall..Conclusion Rhizome of Paeonia lactiflora Pall.has the potential to use as medicinal parts，it could be exploited and used in further.

Rhizome of Paeonia lactiflora Pall.； Paeoniflorin； Albiflorin； HPLC

R284

A doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.08.006

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院院級(jí)科研課題（WJYY2014-YY-052）

100102 北京，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院藥學(xué)部

鄭金鳳（1987-），女，碩士，藥師。研究方向：臨床藥學(xué)。E-mail：jinfeng317@126.com

路廣義（1959-），本科，副主任藥師。研究方向：中藥調(diào)劑與研究。E-mail：lulutong200504@163.com

（2016-04-28）