張海燕（三河市畜牧水產(chǎn)局河北三河065200）

學術(shù)研究

甘草添加劑對綿羊支氣管黏膜中杯狀細胞數(shù)量及IgA分泌量的影響

張海燕
（三河市畜牧水產(chǎn)局河北三河065200）

本實驗通過探究甘草的主要藥理作用，對其藥用價值和發(fā)揮藥效的主要成分進行進一步研究，研究甘草添加劑對綿羊呼吸道系統(tǒng)免疫功能的影響。

甘草添加劑；支氣管黏膜；杯狀細胞；IgA

doi：10.3969/j.issn.1008-4754.2016.7.043

1　試驗方法

1.1甘草粉的制備

稱取150 g的甘草粉，置于燒杯中，第1次加1 000 mL蒸餾水浸泡1 h后煎煮，加熱至沸后文火維持30 min，用4層紗布過濾，濾出煎液，濾渣用500 mL水量再煎煮2次，合并3次濾液，濃縮至500 mL，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。將以上各溶液測定前分別用0.45μm微孔濾膜過濾，留濾液備用，用液相色譜法測定甘草酸含量。

1.2試驗動物分組

將試驗用綿羊隨機分為三組，每組4只，分別為空白對照組、低劑量組和高劑量組。實驗組綿羊每只每日早上飼喂甘草粉與精料混合物?？瞻讓φ战M所飼喂的精料中不加甘草粉，連續(xù)飼喂30 d。

1.3杯狀細胞體積及數(shù)量的檢測

具體步驟：取材→固定→蒸餾水沖洗→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→撈片→烤片→脫蠟→蒸餾水沖洗→用阿爾新藍染液染色（30 min）→流水沖洗（2 min）→蒸餾水漂洗→蘇木素復染→脫水→透明→封片→顯微鏡觀察、照相。

1.4IgA分泌量的檢測

1）放血處死綿羊，使用手術(shù)刀將肺組織切成1.5 cm×1 cm×0.3 cm左右的小塊，用10%中性福爾馬林固定24 h后修塊到適當大小，再固定14 d。

2）將固定好的組織塊用自來水沖洗2 d，然后進行脫水、透明、浸蠟，具體操作步驟如下：組織塊→50%乙醇（2～3 h）→60%乙醇（2～3 h）→75%乙醇（2～3 h）→85%乙醇（2～3 h）→95%乙醇（1 h）→100%乙醇（40 min）→二甲苯、乙醇（1∶1）（30 min）→二甲苯（30 min）→52℃蠟杯（60 min）→55℃蠟杯（60 min）。

3）切片、撈片與烤片：將已溶化的石蠟倒入包埋框（小紙盒），迅速夾取已浸透石蠟的組織塊放入其中，冷卻凝固成塊狀（即包埋），將包埋好的蠟塊固定于切片機上，切成8μm薄片，放到42℃溫水中燙平，再貼到載玻片上，再放60℃恒溫箱中烘烤24 h。

4）脫蠟：二甲苯I（15 min）→二甲苯II（10 min）→100%乙醇I（5 min）→100%乙醇II（5 min）→95%乙醇（5 min）→90%乙醇（5 min）→70%乙醇（5 min）。

5）沖洗：蒸餾水沖洗3次，2 min/次；pH 7.2 PBS沖洗3次，5 min/次。

6）阻斷氧化酶活性：擦掉切片組織周圍的液體，用PAP筆在組織周圍畫圈，放入底部盛有PBS的濕盒中，滴加3%H2O2阻斷劑于組織上，室溫避光20 min。PBS液沖洗3次，5 min/次。

7）抗原修復：熱修復96℃，30 min，冷卻后PBS 洗3次，2 min/次。

8）血清封閉：進口羊血清工作液滴加在組織上，37℃孵育30 min，甩掉血清，勿沖洗。

9）滴加一抗：滴加50倍稀釋的一抗，37℃1 h，PBS（pH：7.2-7.6）洗3次，2 min/次。

10）滴加二抗：滴加生物素化兔抗鼠IgG，陰性對照組滴加等量PBS緩沖液代替一抗，20～37℃，20 min。PBS（pH：7.2-7.6）洗3次，2 min/次。

11）滴加試劑SABC，20～37℃，20 min，PBS （pH：7.2-7.6）4次，5 min/次。

12）DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒。取蒸餾水1 mL，加試劑A 1滴，搖勻，再加試劑B和試劑C 各1滴，混勻后加至切片。室溫顯色30 min。

13）蘇木素復染、各級酒精脫水，透明。14）中心樹膠封片、顯微鏡觀察、照相。

2　結(jié)果

2.1甘草品質(zhì)鑒定結(jié)果

利用HPLC對野生脹果甘草粉的甘草酸含量進行測定，結(jié)果為3.1±0.6%，屬于優(yōu)質(zhì)甘草。

2.2杯狀細胞體積及數(shù)量變化

未飼喂甘草組與試驗組相比，杯狀細胞體積和數(shù)量都較??；實驗組綿羊甘草飼喂量高的，杯狀細胞數(shù)量和體積明顯多于低劑量組。

2.3IgA分泌量的變化

未飼喂甘草組與試驗組相比，陽性細胞數(shù)量明顯偏少；與空白組相比，低劑量組陽性細胞明顯較多；與低劑量組相比，高劑量組陽性細胞的數(shù)量又明顯增多。

2.4圖像分析結(jié)果

表1　杯狀細胞及IgA圖像IOD值測算結(jié)果（±s）

表1　杯狀細胞及IgA圖像IOD值測算結(jié)果（±s）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01，*P＜0.05

?

飼喂甘草組杯狀細胞和IgA分泌量都顯著高于空白組（P＜0.01）且高劑量組明顯高于低劑量組（P＜0.01）。

3　結(jié)論

甘草作為飼料添加劑具有增加綿羊支氣管黏膜杯狀細胞體積、數(shù)量和IgA分泌量的作用。

4　討論

本試驗主要探究不同飼喂量的甘草添加劑對綿羊支氣管黏膜杯狀細胞的功能的影響。由于試驗步驟多且繁復，因此必須要求在進行試驗時要有嚴謹認真的態(tài)度，如所需試劑、儀器、各類緩沖液等必須提前準備好，以防造成時間上的沖突，在包埋過程中軟蠟和硬蠟的比例、PBS緩沖液pH值的校正、滴加抗體的時間、濕盒的溫度、DAB顯色的時間等每個步驟都必須嚴格按照試驗設計進行，否則都會影響試驗效果。10%中性福爾馬林比普通福爾馬林對組織滲透性強，固定均勻?qū)M織膨脹約5%，經(jīng)酒精脫水時有較大的收縮，能保存脂肪，不能沉淀核蛋白及白蛋白，長期用其固定的組織使組織變?yōu)樗嵝裕焕谌旧?，特別是細胞核的著色，經(jīng)自來水沖洗6～24 h后，可以使其酸堿中和，并減少結(jié)晶。

在阿爾新藍染色檢測杯狀細胞體積及數(shù)量變化的試驗中，由于阿爾新藍帶正電荷，屬陽離子染料，在pH 2.5條件下，其陽離子可與酸性糖共軛物中的羧基或硫酸根結(jié)合而著色，但不能和核酸的磷酸根結(jié)合，其染色特點為特異性強，染色深而牢固，因此得出的試驗結(jié)果陽性反應很明顯。但免疫組化試驗測IgA分泌量的試驗卻失敗了兩次，第一次是配制PBS緩沖液的過程中沒有進行pH值校正，導致結(jié)果不明顯。第二次是復染過程中忘了過鹽酸（1∶1的鹽酸酒精，6 s，脫色）。除了這些個人原因之外，這次實驗具有很嚴格的時間性，所有步驟都是嚴格按照試驗設計的時間和驟進行，在試驗過程，我們相互配合，相互幫助，嚴謹認真，最終做出了較為理想的結(jié)果。

試驗的不足之處在于我認為試驗組取得不夠完整，當甘草添加劑的飼喂量高于或低于某一個臨界值時，其結(jié)果可能會發(fā)生變化，不再是甘草飼喂量與杯狀細胞的體積變化及IgA分泌量呈正比。這方面可以做更進一步的研究。■（編輯：趙曉松）

［1］中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）［M］.北京：化學工業(yè)出版社.2000：65～66.

［2］胡金鋒，葉仲林，沈鳳嘉.云南甘草化學成分的研究（Ⅰ）［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)1994，04：6～8.

［3］金宏.淺談甘草藥理作用［J］.時珍國醫(yī)國藥，2000，11（1）78～79.

［4］陳少峰，余勝民等.甘草止咳祛痰作用研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20（11）：173～177.

Effects of Licorice additives on numbers of goblet cells and IgA secretion of sheep bronchial mucosa

Zhang Haiyan
（Sanhe animal husbandry and Fisheries Bureau，Sanhe Hebei，065200）

By exploring the main pharmacological effects of licorice and the main component of medicinal value and efficacy，to study Licorice additive effects on the immune function of the respiratory system in sheep.

Licorice additives；Bronchial mucosa；Goblet cell；IgA