鄭鐵鑫，張影，邢育鋼，柴華，尹堯（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司黑龍江哈爾濱150069）

仔豬副傷寒活疫苗（C500株）生產(chǎn)工藝關(guān)鍵技術(shù)研究

鄭鐵鑫，張影，邢育鋼，柴華，尹堯
（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司黑龍江哈爾濱150069）

仔豬副傷寒活疫苗（C500株）生產(chǎn)過(guò)程中，存在培養(yǎng)菌數(shù)低，凍干死亡率高等問(wèn)題，影響產(chǎn)品的產(chǎn)量。本文針對(duì)仔豬副傷寒活疫苗（C500株）生產(chǎn)工藝關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行研究，通過(guò)篩選接種量、培養(yǎng)基配方與通氣量的參數(shù)關(guān)系；優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)工藝，采用自動(dòng)添加40%葡萄糖補(bǔ)充碳源并作為調(diào)節(jié)pH值的手段；使用分光光度法與凍干工藝結(jié)合作為收獲標(biāo)準(zhǔn)，從而達(dá)到提高培養(yǎng)菌數(shù)，降低凍干死亡率。本研究為生產(chǎn)高效、安全、穩(wěn)定的仔豬副傷寒活疫苗產(chǎn)品提供有力地技術(shù)支持。

仔豬副傷寒活疫苗；生產(chǎn)工藝；菌數(shù)

doi：10.3969/j.issn.1008-4754.2016.7.003

仔豬副傷寒活疫苗由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的房曉文等選用抗原性良好的豬霍亂沙門(mén)氏菌強(qiáng)毒株在含有醋酸鉈的普通肉湯中傳代培養(yǎng)，經(jīng)傳數(shù)百代后，篩選出一株毒力弱而免疫原性良好的弱毒菌株，命名為豬霍亂沙門(mén)氏桿菌C500弱毒株，于1965年開(kāi)始試用，1976年被批準(zhǔn)列入獸醫(yī)生物制品規(guī)程，已在全國(guó)許多生物制品廠生產(chǎn)，用C500弱毒菌株制成仔豬副傷寒活疫苗，經(jīng)田間試驗(yàn)和區(qū)域試驗(yàn)證明疫苗安全有效，該疫苗在我國(guó)大范圍推廣使用，使我國(guó)仔豬副傷寒得到了有效控制，取得了可觀的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益［1］。

我公司生產(chǎn)的仔豬副傷寒活疫苗從固體培養(yǎng)，到現(xiàn)在的微生物發(fā)酵罐通氣培養(yǎng)，生產(chǎn)量不斷增大，生產(chǎn)工藝趨于穩(wěn)定，現(xiàn)在隨著技術(shù)的提高，我公司經(jīng)過(guò)不斷創(chuàng)新，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基配方以及相應(yīng)培養(yǎng)條件的優(yōu)化改進(jìn)，使產(chǎn)品由原來(lái)的平均27頭份/瓶增加到43頭份/瓶。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1生產(chǎn)用種子豬霍亂沙門(mén)氏菌弱毒株C500，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.1.2效檢攻毒菌株豬霍亂沙門(mén)氏菌C78-2強(qiáng)毒株，由中國(guó)獸藥監(jiān)察所提供。

1.1.3培養(yǎng)基普通瓊脂、普通肉湯、40%葡萄糖溶液、酪胨瓊脂斜面（G.A）、硫乙醇酸鹽酪胨湯（T.G）葡萄糖蛋白胨（G.P），均由本公司培養(yǎng)基班組提供。

1.1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大耳白家兔，由本公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2設(shè)備

1.1.1上海高機(jī)生物工程公司 BIOF-6200B微生物發(fā)酵罐。

1.2.2日本島津UV-2550分光光度計(jì)。

1.2.3上海彼愛(ài)姆光學(xué)儀器制造有限公司顯微鏡。

1.3方法

1.3.1生產(chǎn)用種子的制備按照《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《規(guī)程》）的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法和要求進(jìn)行一級(jí)種子繁殖、鑒定和二級(jí)種子繁殖，二級(jí)種子平均菌數(shù)為19×108CFU/mL［2］，二級(jí)種子按培養(yǎng)量1%、2%、3%準(zhǔn)備，檢驗(yàn)純粹后備用。

1.3.2普通肉湯按《規(guī)程》方法制造，pH值為7.6左右，121℃蒸汽滅菌40 min。

1.3.3半合成培養(yǎng)基將蛋白胨、牛肉膏、NaCl等按不同比例設(shè)計(jì)成3種配方，用蒸餾水溶解，用8%的NaOH溶液調(diào)整pH值為7.6左右，分裝，121℃蒸汽滅菌40 min。

1.3.4培養(yǎng)接種后開(kāi)始以100 r/min進(jìn)行培養(yǎng)，過(guò)程中采用分段攪拌方式，自動(dòng)調(diào)節(jié)由100 r/min增加至200 r/min；培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)采用自動(dòng)添加40%葡萄糖進(jìn)行調(diào)節(jié)pH值的方法，控制培養(yǎng)環(huán)境酸堿度在pH7.4左右，使整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程達(dá)到自動(dòng)化精準(zhǔn)控制。

1.3.5培養(yǎng)條件的優(yōu)化篩選將種子液（A變量因素）按培養(yǎng)基量的1%、2%、3%接種至對(duì)應(yīng)3種半合成培養(yǎng)基（C變量因素）中，37.5℃，通氣量（B變量因素）采用固定12 m3/h；固定20 m3/h；從12 m3/h逐漸加到20 m3/h三種方式。

1.3.6培養(yǎng)終點(diǎn)的選擇從1.3.5項(xiàng)計(jì)數(shù)結(jié)果中選擇合適的一組，其它培養(yǎng)條件不變，分別對(duì)設(shè)定收獲時(shí)間進(jìn)行取樣，利用分光光度法檢測(cè)樣品在600 nm處的吸收值，并對(duì)樣品進(jìn)行菌數(shù)測(cè)定，針對(duì)各個(gè)樣品進(jìn)行分裝凍干，檢測(cè)凍干后菌數(shù)情況。

1.3.7發(fā)酵罐批次生產(chǎn)驗(yàn)證從1.3.5項(xiàng)計(jì)數(shù)結(jié)果選擇合適的一組搭配，從1.3.6項(xiàng)選擇合適的培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)溫度37.5℃，攪拌速度100～200 r/min，罐壓0.05 MPa，進(jìn)行發(fā)酵罐大量生產(chǎn)試驗(yàn)。分別于培養(yǎng)結(jié)束和冷凍真空干燥后取樣計(jì)數(shù)，計(jì)算凍干存活率［3］，并按《規(guī)程》方法進(jìn)行安全性檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1培養(yǎng)的優(yōu)化改進(jìn)

2.1.1通過(guò)L9（33）正交試驗(yàn)A1B1C1400億/mL、A1B2C2395億 /mL、A1B3C3360億 /mL、A2B1C2380億 /mL、A2B2C3380億/mL、A2B3C1410億/mL、A3B1C3385億/mL、A3B2C1445億/mL、A3B3C2375億/mL，極差分析結(jié)果可以看出，三個(gè)參數(shù)效果是RC＞RA＞RB，同時(shí)也可以看出A3B2C1達(dá)到445億/mL為較優(yōu)組合（見(jiàn)表1）。

表1　選用L9（33）正交試驗(yàn)表前三項(xiàng)進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算培養(yǎng)菌數(shù)

2.1.2通過(guò)分光光度法檢測(cè)培養(yǎng)18 h樣品的吸收值趨于最高，18～21 h期間吸收值只有小幅增長(zhǎng)；培養(yǎng)至19 h，培養(yǎng)菌數(shù)最高，而培養(yǎng)18 h的凍干死亡率最低，綜合考慮凍干前菌數(shù)，凍干后菌數(shù)，凍干死亡率以及分光光度法值幾項(xiàng)參數(shù)，培養(yǎng)至18 h為最佳培養(yǎng)時(shí)間（見(jiàn)表2）。

表2　各時(shí)間點(diǎn)的吸收值（600nm）、凍干前菌數(shù)（108CFU/mL）、凍干后菌數(shù)（108CFU/mL）

2.2發(fā)酵罐應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)極差分析法與分光光度法，優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行發(fā)酵罐應(yīng)用試驗(yàn)，三個(gè)批次試驗(yàn)結(jié)果表明，采用改進(jìn)后方法仔豬副傷寒活疫苗培養(yǎng)菌數(shù)平均達(dá)到543×108CFU·mL-1，凍干存活率可達(dá)到74%（見(jiàn)表3），與以往生產(chǎn)結(jié)果相比培養(yǎng)菌數(shù)增高，凍干存活率較穩(wěn)定，安全性好［3］。

表3　改進(jìn)前后發(fā)酵罐培養(yǎng)結(jié)果比較

3　小結(jié)與討論

1）根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮凍前培養(yǎng)菌數(shù)和凍干存活率兩項(xiàng)因素，在采用發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)的條件下，確定了仔豬副傷寒活疫苗生產(chǎn)工藝中的一些關(guān)鍵性技術(shù)參數(shù)。

2）參數(shù)自動(dòng)化設(shè)定調(diào)節(jié)方式，降低批間次差異，使工藝更加穩(wěn)定。

3）采用極差分析方法，更加科學(xué)的選擇試驗(yàn)參數(shù)方案；引入分光光度法，對(duì)培養(yǎng)終點(diǎn)的選擇提供理論數(shù)據(jù)。

4）分光光度法在試驗(yàn)中的成功引入，對(duì)此種方法的科學(xué)性提供理論基礎(chǔ)，將此種方法應(yīng)用于其它產(chǎn)品的試驗(yàn)中提供科學(xué)依據(jù)?！觯ň庉嫞黑w曉松）

［1］楊紅云，伊鴻，康興，等.仔豬副傷寒C500活疫苗純粹檢驗(yàn)中可疑菌落的鑒定［J］.中國(guó)獸藥雜志，1999，33（1）：30-32.

［2］楊紅云，康興，張小萍，等.仔豬副傷寒活疫苗生產(chǎn)工藝的改進(jìn)［J］.中國(guó)獸藥雜志，2002，36（6）：49～50.

［3］中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程二〇一〇年版［S］.

Study on Key Technologies of the Production Process for Piglet Paratyphoid Live Vaccine（C500 Strain）

Zheng Tiexin，Zhang Ying，Xing Yugang，Chai Hua，Yin Yao
（Harbin Pharmaceutical Group Bio-vaccine Co.，Ltd，Harbin Heilongjiang，150069）

Low cultured bacterial and lyophilized high mortality and other problems exist in the piglet paratyphoid live vaccine（C500 strain）production process，affecting the yield of the product.In this paper，the key technologies of manufacturing process for piglet paratyphoid live vaccine（C500 strain）were studied to solve these problems by screening parameters related to inoculation amount and media formulations and ventilation volume，optimizing the fermentation process，adding 40%glucose automatically as carbon source and a means of adjusting the pH value and combining spectrophotometric method and freeze-drying process as the product harvest standards.This study provides strong technical support to produce highly efficient，safe and stable piglet paratyphoid live vaccine products.

piglet paratyphoid live vaccine，manufacturing process，bacterial count

鄭鐵鑫（1982-），男，籍貫山東，理學(xué)學(xué)士，獸醫(yī)師，從事獸用生物制品生產(chǎn)。