陳萍禎， 朱 曄， 張慧濤， 徐曉嫦， 鄭 晶， 賈 寧， 林宇靜， 李玲玲， 張 樺△

(中山大學附屬第五醫(yī)院1腎內科，2病理科，3中心實驗室，廣東珠海519000)

鈣衛(wèi)蛋白在腎臟缺血再灌注損傷大鼠中的表達及其作用*

陳萍禎1， 朱 曄1， 張慧濤1， 徐曉嫦1， 鄭 晶1， 賈 寧1， 林宇靜2， 李玲玲3， 張 樺1△

(中山大學附屬第五醫(yī)院1腎內科，2病理科，3中心實驗室，廣東珠海519000)

目的:探討鈣衛(wèi)蛋白(CALP)在腎臟缺血再灌注損傷(IRI)大鼠中的表達及其在炎癥反應中的作用。方法:50只雄性SD大鼠隨機分為IRI組和假手術組(sham組)，每組25只。各組分別于缺血再灌注后6 h、12 h、24 h、48 h和72 h觀察腎臟病理改變，檢測大鼠血清尿素氮(BUN)和肌酐(SCr)水平，ELISA法檢測大鼠血清CALP、腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-6的含量，免疫組織化學法和Western blot法分別檢測大鼠腎臟CALP、Toll樣受體4(TLR4)和NF-κB p65蛋白表達水平。結果:IRI組大鼠腎臟呈現(xiàn)不同程度的腎小管上皮細胞和間質損傷，伴炎細胞浸潤。血清BUN、SCr、CALP及促炎細胞因子TNF-α、IL-6的含量在各時點均顯著高于sham組(P＜0.05)。CALP、TLR4和NF-κB p65主要表達于腎小管上皮細胞胞質中，在IRI組呈高表達，在各時點各因子的表達與sham組相比均顯著增強(P＜0.05)。結論:腎臟IRI大鼠的血清CALP、TNF-α和IL-6水平升高，CALP、TLR4和NF-κB p65在腎組織中表達增強。CALP在大鼠腎臟IRI的炎癥反應中可能起重要作用。

腎臟;缺血再灌注損傷;鈣衛(wèi)蛋白;Toll樣受體4

腎臟缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)是引起急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)的常見原因，也是心肺復蘇、腎移植、多種類型休克、造影劑腎病等臨床事件中不可避免的重要環(huán)節(jié)。缺血再灌注引發(fā)腎臟持續(xù)的病理生理學改變，如細胞凋亡、炎癥反應、氧化應激、內皮功能障礙、腎小管堵塞和回漏等，加重缺血本身所致?lián)p傷，而其中的炎癥反應是近年研究的熱點［1-4］。

Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)通過與生物配體相互識別并結合，激活細胞內信號轉導，促發(fā)下游通路核因子(nuclear factor，NF)-κB活化，誘導促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6等的產生和釋放，從而引起和加重組織的炎癥損傷［5-8］。近年研究表明，由S100蛋白家族成員S100A8和S100A9兩種蛋白通過鈣離子連接形成的異二聚體——鈣衛(wèi)蛋白(calprotectin，CALP)可作為內源性危險信號分子通過激活膜受體TLR4介導細胞內炎癥信號轉導，從而激活免疫效應細胞，參與到炎癥免疫反應，故與炎癥的病理生理過程密切相關［9-10］。為了探討在腎臟IRI 中CALP是否通過TLR4/NF-κB通路參與腎臟IRI的炎癥反應，本實驗通過建立大鼠腎臟IRI模型，觀察大鼠血清CALP、TNF-α和IL-6的變化，檢測腎組織CALP、TLR4和NF-κB p65的蛋白表達水平，以探討CALP在大鼠腎臟IRI炎癥反應中的可能作用。

材料和方法

1 實驗動物和主要試劑

健康雄性、SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠50只，體質量220～250 g，購于中山大學實驗動物中心［合格證號為SCXK(粵)2011-0029］，飼養(yǎng)于動物實驗室SPF級環(huán)境。

CALP ELISA試劑盒(上海源葉);大鼠TNF-α 和IL-6 ELISA試劑盒、兔抗大鼠TLR4多克隆抗體、兔抗大鼠NF-κB p65多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔、小鼠多克隆抗體及組織蛋白抽提試劑(武漢博士德);小鼠抗大鼠CALP單克隆抗體(Abcam);小鼠抗人CALP單克隆抗體(Santa Cruz); PVDF膜(Millipore);甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)等試劑(藝佳生物)。

2 實驗方法

2.1 研究對象及分組 大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為IRI組和假手術組(sham組)，每組25只。

2.2 模型建立和標本采集 大鼠術前禁食8 h，不禁水，10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，常規(guī)固定、消毒、鋪巾，腹正中切口，游離腎蒂，IRI組用無創(chuàng)小血管夾同時阻斷雙側腎蒂50 min，之后松開血管夾，血流再通;sham組手術方式同IRI組，但不阻斷腎蒂血流。各組分別于再灌注后6 h、12 h、24 h、48 h和72 h取血(腹主動脈穿刺法)和采集腎臟標本。右腎用冰生理鹽水沖洗后置液氮保存，待Western blot法測定蛋白;左腎用10%甲醛固定緩沖液固定，待制備石蠟切片。

2.3 檢測指標及方法 全自動生化分析儀檢測大鼠血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和血清肌酐(serum creatinine，SCr)水平;ELISA法檢測大鼠血清CALP、TNF-α和IL-6含量，具體步驟按各試劑盒說明書進行;腎組織石蠟切片行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察病理學改變;免疫組織化學法檢測大鼠腎組織CALP、TLR-4和NF-κB p65的表達水平:石蠟切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化，檸檬酸鹽(檢測CALP時用EDTA)抗原修復液高溫高壓修復，3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶，5%牛血清白蛋白室溫封閉，滴加適當濃度I抗，4℃過夜孵育，復溫，滴加II抗，二氨基聯(lián)苯氨顯微鏡下控制顯色，復染細胞核、分化、返藍，梯度乙醇脫水干燥，中性樹膠封片。各指標均用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替I抗作為空白對照。細胞質染色呈棕黃色為陽性結果。Western blot法檢測腎組織CALP、TLR-4和NF-κB p65的表達:大鼠腎組織稱重后，加入100 g/L的裂解液制備組織勻漿，勻漿轉入EP管，加入PMSF(100 mmol/ L)，冰浴裂解30 min，于4℃下12 000 r/min離心15 min，取上清液，測定蛋白含量。取腎組織勻漿蛋白100 μg與等體積的緩沖液混合，煮沸10 min，經10% SDS-PAGE電泳分離蛋白質，轉移至硝酸纖維素膜上，2%脫脂奶粉封閉膜，室溫1 h，加入小鼠抗人CALP(1∶200)單克隆抗體、兔抗大鼠TLR4(1∶200) 和NF-κB p65(1∶200)多克隆抗體，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加辣根過氧化物酶標記的II抗，37℃孵育30 min，TBST洗膜3次，化學發(fā)光試劑處理后于暗室曝光。將膠片進行掃描存檔，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的吸光度值。以GAPDH為內參照行吸光度分析，比較目的條帶/內參照條帶灰度值，測定各組蛋白質的相對含量。

3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。兩組間的均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 腎臟病理學改變

Sham組的腎小球、腎小管及腎間質結構基本正常。IRI組大鼠隨再灌注時間的延長出現(xiàn)不同程度的腎臟病理改變，可見腎小管上皮細胞渾濁腫脹，出現(xiàn)水樣或空泡樣變，刷狀緣消失，部分小管上皮細胞凝固性壞死、脫落，小管腔內可見細胞管型，間質水腫及炎細胞浸潤，而腎小球病變不明顯。

2 腎功能改變

IRI組大鼠的BUN和SCr于再灌注6 h即顯著升高，且隨著再灌注時間的延長呈進行性升高，于24 h達高峰，之后逐漸下降，在各時點均顯著高于sham 組(P＜0.05)，見表1。

3 血清CALP、TNF-α和IL-6含量的變化

IRI組大鼠血清CALP、TNF-α和IL-6含量于再灌注6 h即顯著升高，且隨著再灌注時間的延長呈進行性升高，于24 h達高峰，之后逐漸下降，在各時點均顯著高于sham組(P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清BUN、SCr、CALP、TNF-α和IL-6含量的變化Table 1.The serum levels of BUN，SCr，CALP，TNF-α and IL-6 in rats(Mean±SD.n=5)

4 腎組織CALP、TLR4和NF-κB p65蛋白的表達

4.1 免疫組化結果 CALP、TLR4和NF-κB p65主要在腎小管上皮細胞胞質中表達，sham組表達較弱，IRI組則呈高表達，于再灌注6 h即有明顯表達，于再灌注24 h表達最強，之后表達減弱，見圖1～3。

Figure 1.The expression of CALP in the renal tissue of the rats(immunohistochemical staining，×200).A:sham group;B:reperfusion for 6 h in IRI group;C:reperfusion for 12 h in IRI group;D:reperfusion for 24 h in IRI group;E:reperfusion for 48 h in IRI group;F:reperfusion for 72 h in IRI group.圖1 各組大鼠腎組織CALP的表達

4.2 Western blot檢測結果 CALP、TLR4和NF-κB p65在sham組大鼠腎組織有弱表達，而在IRI組則呈高表達，且隨著再灌注時間延長表達逐漸增強，于再灌注24 h達到峰值，在各時點的表達水平均顯著高于sham組(P＜0.05)，見圖4。

Figure 2.The expression of TLR4 in the renal tissue of the rats(immunohistochemical staining，×200).A:sham group;B:reperfusion for 6 h in IRI group;C:reperfusion for 12 h in IRI group;D:reperfusion for 24 h in IRI group;E:reperfusion for 48 h in IRI group;F:reperfusion for 72 h in IRI group.圖2 各組大鼠腎組織TLR4的表達

Figure 3.The expression of NF-κB p65 in the renal tissue of the rats(immunohistochemical staining，×200).A:sham group;B: reperfusion for 6 h in IRI group;C:reperfusion for 12 h in IRI group;D:reperfusion for 24 h in IRI group;E:reperfusion for 48 h in IRI group;F:reperfusion for 72 h in IRI group.圖3 各組大鼠腎組織NF-κB p65的表達

討論

研究表明，炎癥反應是腎臟IRI的一個重要的病理生理機制，也是AKI的首要啟動及貫穿因素［2-4］。本實驗觀察到，IRI組大鼠血清炎性因子TNF-α和IL-6含量顯著增加，并隨著再灌注時間的延長呈現(xiàn)進行性升高;同時，大鼠血清BUN和SCr水平顯著升高，且與血清TNF-α和IL-6的濃度變化趨勢一致。在腎臟病理上，呈現(xiàn)急性腎小管和間質的損傷，伴顯著炎性細胞浸潤，且腎臟病理改變隨著再灌注時間延長逐漸加重。上述結果和本課題組前期研究一致，說明缺血再灌注誘發(fā)了炎癥反應的發(fā)生，并導致腎臟的功能和病理異常。

近年研究發(fā)現(xiàn)［5-8，11-12］，TLR4可作為“門戶”蛋白啟動機體的炎癥鏈式反應，此作用在跨膜信號轉導受體家族Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)中占有重要位置。TLRs能通過識別外源性病原相關分子模式監(jiān)控微生物入侵，也能通過識別內源性危險相關分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)誘導無菌性炎癥反應而參與組織損傷。TLRs與配體結合后，可導致下游信號轉導途徑如NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶的激活，從而誘導促炎細胞因子如 TNF-α、IL-1β、IL-6等的分泌與表達。TLR4是TLRs家族的重要成員，它不僅可識別革蘭氏陰性細菌壁成分脂多糖，還能識別諸多內源性分子如熱休克蛋白70、高遷移率族蛋白1等而活化。鑒于熱休克蛋白70在器官IRI過程中可能發(fā)揮保護性作用［13］，而高遷移率族蛋白1是一種晚期炎癥因子［11，14］，因此尋找IRI過程中的早期激活TLR4的內源性配體，從TLR4信號通路的源頭早期控制炎癥反應，對于預防腎臟IRI具有重要意義。

Figure 4.The protein expression of CALP，TLR4 and NF-κB p65 in the renal tissues of the rats detected by Western blot.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs sham group.圖4 Western blott檢測各組大鼠腎組織CALP、TLR4和NF-κB p65蛋白的表達

S100A8和S100A9是S100蛋白家族成員，是能夠結合鈣離子的胞質分子，在體內兩者可通過鈣離子連接起來形成異二聚體CALP(S100A8/S100A9)，表達在中性粒細胞、單核細胞和早期分化的巨噬細胞等細胞表面［9，15-16］。在生理狀態(tài)下，CALP具有參與細胞骨架建立、調節(jié)鈣離子穩(wěn)態(tài)等功能，不具備促炎活性［9，15］。在炎癥、腫瘤等病理狀態(tài)下，由于細胞壞死或吞噬細胞激活，CALP可釋放到細胞外而作為DAMP激活免疫效應細胞，參與到中性粒細胞的招募、炎性因子及黏附分子的誘導生成等病理生理過程［17-18］。

臨床上CALP作為炎癥標志物常用來協(xié)助診斷和監(jiān)測類風濕性關節(jié)炎［19］、炎癥性腸?。?0］等炎癥相關性疾病，而其在腎臟病中的研究尚少。近年Heller等［21］發(fā)現(xiàn)，腎性AKI患者尿液CALP水平是腎前性患者的60.7倍，而Seibert等［22］的報道進一步證實上述結果，腎性AKI患者尿液CALP水平較腎前性患者顯著升高，尿液CALP水平可作為鑒別腎前性和腎性AKI的一個診斷標志物，其敏感性和特異性高于中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白。CALP既然與AKI密切相關，那么深入研究CALP在腎臟IRI中的作用及其機制，對早期預測和防范AKI危險事件的發(fā)生有著重要意義和實用價值。CALP是否參與或通過什么信號通路介導腎臟IRI的發(fā)生與病理生理過程?CALP在IRI中的腎臟組織的表達及分布情況如何?目前鮮有文獻報道。

本實驗結果顯示，在IRI組大鼠血清CALP含量于再灌注6 h即顯著升高，且隨著再灌注時間的延長呈進行性升高，并與血清TNF-α和IL-6含量升高相一致，而腎組織中CALP、TLR4及NF-κB p65表達明顯增強，CALP表達與TLR4和NF-κB p65表達水平相平行，且各蛋白表達的高峰時間與血清TNF-α和IL-6水平一致，均于再灌注24 h達到高峰，之后逐漸減弱，變化趨勢也與腎功能和腎臟病理改變相吻合。結果提示在腎IRI的早期，CALP對腎臟IRI的發(fā)生發(fā)展起重要作用，而且很可能作為危險相關分子模式，通過激活膜受體TLR4介導細胞內炎癥信號的轉導，促進NF-κB p65的表達及炎性因子的釋放，加重缺血后的再灌注損傷。Vogl等［9］在實驗性膿毒癥休克小鼠模型中也證實，CALP可作為TLR4的內源性配體，通過識別并與TLR4結合而激活下游炎癥信號通路，加劇小鼠的死亡。

雖然腎臟IRI的機制非常復雜，有多種信號通路交互影響及多種細胞因子共同作用，但本實驗初步揭示，通過激活膜受體TLR4介導細胞內炎癥信號轉導是CALP蛋白參與炎癥反應的一個重要途徑。抑制CALP介導的信號轉導，有望為早期防治AKI提供新靶點。

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(責任編輯:盧 萍，羅 森)

Expression of calprotectin in rats with renal ischemia-reperfusion injury

CHEN Ping-zhen1，ZHU Ye1，ZHANG Hui-tao1，XU Xiao-chang1，ZHENG Jing1，JIA Ning1，LIN Yu-jing2，LI Ling-ling3，ZHANG Hua1

(1Department of Nephrology，2Department of Pathology，3Centre of Laboratory，The Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Zhuhai 519000，China.E-mail:zh3196@126.com)

AIM:To investigate the expression of calprotectin(CALP)in the rats with renal ischemia-reperfusion injury(IRI).METHODS:Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation and IRI group(n= 25 in each group).Blood samples and the kidneys were obtained at 6 h，12 h，24 h，48 h and 72 h after reperfusion.The pathological changes of the kidneys were observed.The serum concentrations of blood urea nitrogen(BUN)and serum creatinine(SCr)were measured.The serum levels of CALP，tumor necrosis factor-α(TNF-α)and interleukin-6(IL-6) were detected by ELISA，and the expression of CALP，Toll-like receptor 4(TLR4)and NF-κB p65 in the renal tissues were determined by the methods of immunohistochemistry and Western blot.RESULTS:Different serial ischemia changes were observed in the renal tissues，mainly in the renal tubular epithelial cells and the mesenchyma，with the infiltration of inflammatory cells.The serum levels of BUN，SCr，CALP，TNF-α and IL-6 in IRI group were markedly increased as compared with sham group(P＜0.05).The protein expression of CALP，TLR4 and NF-κB p65 in the renal tubular epithelial cells in IRI group was greatly enhanced in comparison with that in sham group(P＜0.05).CONCLUSION:The serum concentrations of CALP，TNF-α and IL-6，and the protein expression levels of CALP，TLR4 and NF-κB p65 in the renal tissue are significantly increased in the rats with IRI，suggesting that calprotectin plays an important role in the inflammation in rats with IRI.

Kidney;Ischemia-reperfusion injury;Calprotectin;Toll-like receptor 4

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.027

1000-4718(2016)07-1317-06

2016-02-02

2016-03-16

廣東省自然科學基金資助項目(No.S2013010016698);珠海市醫(yī)學科研基金資助項目(No.201504)

△Tel:0756-2528189;E-mail:zh3196@126.com