彭紅星， 楊榮時(shí)， 王 煥， 曾玉蘭

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北武漢430077)

長(zhǎng)期煙霧暴露對(duì)大鼠肺血管重塑及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1表達(dá)的影響*

彭紅星， 楊榮時(shí)， 王 煥， 曾玉蘭△

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北武漢430077)

目的:觀察長(zhǎng)期吸煙對(duì)大鼠肺血管重塑及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)的影響，探討其發(fā)生的可能機(jī)制。方法:將36只健康SD雄性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、煙霧暴露2周(S-2W)和煙霧暴露12周(S-12W)組。蘇木精-伊紅染色和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白染色切片觀察肺血管重塑的程度，免疫組化法檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和TGF-β1在肺動(dòng)脈的相對(duì)表達(dá);RT-qPCR檢測(cè)肺動(dòng)脈TGF-β1的mRNA表達(dá)。結(jié)果:隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng)，模型組血管壁厚度和血管直徑比值(WT%)和完全肌化血管比例均較對(duì)照組明顯增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.01)。模型組的PCNA及TGF-β1蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組增大，且兩模型組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.01)。與對(duì)照組比較，模型組TGF-β1的mRNA表達(dá)均顯著增加(P＜0.05)，其中S-2W組和S-12W組之間的差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05)。TGF-β1的mRNA表達(dá)與WT%和完全肌化血管比例呈顯著正相關(guān)(P＜0.01); TGF-β1的mRNA表達(dá)與PCNA蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P＜0.01)。結(jié)論:長(zhǎng)期煙霧暴露可導(dǎo)致大鼠肺血管重塑的形成，其機(jī)制可能與吸煙上調(diào)大鼠肺血管TGF-β1的mRNA表達(dá)，誘導(dǎo)肺血管平滑肌細(xì)胞增殖有關(guān)。

煙霧;肺血管重塑;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1;平滑肌

吸煙和二手煙暴露與慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病密切相關(guān)，煙霧暴露不僅可引起肺部的異常炎癥反應(yīng)，還可促使氣道平滑肌顯著增殖，使肌型動(dòng)脈和內(nèi)膜面積百分比顯著增加，降低管腔面積百分比，進(jìn)而使肺小動(dòng)脈發(fā)生重構(gòu)，導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓的形成［1］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 (transforming growth factor-β1，TGF-β1)是調(diào)節(jié)細(xì)胞分化增殖的多功能生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的生成及激活血管外膜成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，并向肺血管中膜層遷移造成中膜層增厚，導(dǎo)致肺血管重塑，有研究表明吸煙可增加肺組織及支氣管上皮細(xì)胞的TGF-β1表達(dá)水平［2］。本研究通過觀察長(zhǎng)期煙霧暴露對(duì)大鼠肺血管平滑肌增殖及TGF-β1的影響，探討肺血管重塑形成的可能發(fā)生機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

武漢卷煙廠產(chǎn)紅金龍香煙，每支含尼古丁1.0 mg和焦油15 mg，煙氣中一氧化碳含量15 mg;小鼠抗增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)單克隆抗體、小鼠抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(αsmooth muscle actin，α-SMA)單克隆抗體和SABC免疫組化試劑盒均購(gòu)自武漢谷歌生物工程有限公司; TRIzol購(gòu)自Ambion;M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒SYBR Green Mix試劑盒均購(gòu)自Invitrogen。TGF-β1β-actin引物根據(jù)Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)，由武漢谷歌生物公司合成。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及煙霧暴露模型的建立 SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照(control)組、煙霧暴露 2周(2-week smoke exposure，S-2W)組和煙霧暴露12周(S-12W)組，每組12只。模型組SD大鼠放入60 cm×57 cm ×100 cm的煙熏箱里，使模型組大鼠被動(dòng)吸煙。每次點(diǎn)燃2支香煙放入，燃燒10 min，休息5 min后再放入2支香煙，上、下午各吸煙20支，中間間隔時(shí)間不少于4 h，每周吸煙6 d。用CY-100B數(shù)字測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)煙熏箱中的氧濃度，根據(jù)監(jiān)測(cè)結(jié)果開放通氣孔的數(shù)目，使煙熏箱中的氧濃度保持20%～21%。正常對(duì)照組大鼠飼養(yǎng)在無煙環(huán)境下。

2.2 樣品留取 到達(dá)干預(yù)時(shí)點(diǎn)后，用10%的水合氯醛麻醉，放血處死大鼠。分離出肺臟，取左肺用4%多聚甲醛固定，二甲苯透明，行石蠟包埋，病理切片機(jī)切片，切片厚約4 μm。自右肺仔細(xì)分離出肺動(dòng)脈，于－80℃冰箱保存，便于后期RT-qPCR用。

2.3 肺組織病理學(xué)觀察和圖像分析 石蠟切片常規(guī)做HE染色，觀察支氣管-肺組織病理學(xué)變化，每張切片選取斷面積較圓、直徑為50～200 μm的5支，以圖像分析系統(tǒng)測(cè)量記錄肺血管壁厚度和血管直徑的比值(WT%)。

2.4 α-SMA免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)血管肌化 石蠟切片脫蠟至水，微波爐修復(fù)抗原，一次滴加小鼠抗小鼠抗α-SMA單克隆抗體、生物素化羊抗小鼠或羊抗兔IgG和SABC試劑，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。用PBS替代I抗作為陰性對(duì)照。光學(xué)顯微鏡下觀察，陽(yáng)性表達(dá)為胞漿內(nèi)有細(xì)絲狀棕黃色著色。將切片置于顯微鏡下隨機(jī)觀察30條血管，將組織切片之中所有直徑在100 μm以下的肺小血管分為3種類型:未肌化的血管(α-SMA染色陽(yáng)性長(zhǎng)度小于周長(zhǎng)的25%)、部分肌化的血管(α-SMA染色陽(yáng)性長(zhǎng)度為周長(zhǎng)的25%～75%)和完全肌化的血管(α-SMA染色陽(yáng)性長(zhǎng)度大于周長(zhǎng)的75%)。以完全肌化的血管數(shù)目占肺小血管總數(shù)的百分比來表示肺血管重構(gòu)時(shí)肌化血管的程度。

2.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PCNA和TGF-β1的蛋白表達(dá) 方法同上，I抗均為1∶200稀釋。顯微鏡下觀察，每張切片選取5支50～200 μm陽(yáng)性染色肺小動(dòng)脈，計(jì)算PCNA陽(yáng)性細(xì)胞率及TGF-β1平滑肌細(xì)胞積分吸光度(IA)值。

2.6 RT-qPCR檢測(cè)TGF-β1的mRNA表達(dá) 將上述實(shí)驗(yàn)中凍存保管的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌組織100 mg，加1 mL TRIzol試劑，按說明書提取總RNA，取1 μg按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取1 μL做PCR擴(kuò)增。TGF-β1的上游引物為 5’-CTTTAGGAAGGACCTGGGTTG-3’，下游引物為5’-GGTTGTGTTGGTTGTAGAGGG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為140 bp;內(nèi)參照 β-actin的上游引物為 5’-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3’，下游引物為 5’-TTGCTGACAATCTCTTGAGGGAG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為201 bp。反應(yīng)在Bio-Rad IQ5熒光定量PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)條件:為95℃5 min;95℃ 15 s，60℃60 s，72℃15 s，40個(gè)循環(huán)。PCR的結(jié)果采用2－ΔΔCt法來測(cè)定目的基因的相對(duì)表達(dá)。

大發(fā)廠財(cái)大氣粗，工價(jià)高得我和阿花叫苦不迭，他們的利潤(rùn)空間已是微乎其微。這是景花廠無論如何承受不起的。阿花說，我們只有降低物耗成本，提高工價(jià)。于是景花廠也提了工價(jià)，但與大發(fā)廠相比，工價(jià)還是低了。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間差異的顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊時(shí)兩組之間采用SNK檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用Dunnet檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 HE染色觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)改變

對(duì)照組肺動(dòng)脈壁較薄，結(jié)構(gòu)正常。模型組各組隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng)，氣道和血管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸加重，肺血管壁逐漸增厚。但未見肺泡壁變薄、斷裂等肺氣腫征象(圖1)。煙霧暴露2周和12周組WT%值較對(duì)照組顯著增加，煙霧暴露12周組肺動(dòng)脈壁增厚最明顯，管腔狹窄。煙霧暴露組之間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(表1)。

Figure 1.Histopathological observation of pulmonary arteries(HE staining，×200).圖1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變

2 肺小動(dòng)脈肌化的觀察

α-SMA免疫組化染色后經(jīng)統(tǒng)計(jì)，肺小動(dòng)脈中完全肌化血管比例、部分肌化血管比例和未肌化血管比例如圖2所示，對(duì)照組大鼠完全肌化血管約占3%，肺小動(dòng)脈以未肌化和部分肌化血管為主。與對(duì)照組相比，煙霧暴露各組大鼠肺小動(dòng)脈完全肌化血管明顯增多增厚，而且未肌化血管和部分肌化血管則逐漸減少。S-12W組與S-2W組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠肺血管重塑指標(biāo)、PCNA及TGF-β1蛋白表達(dá)的比較Table 1.The pulmonary artery remodeling indexes and the protein expression of PCNA and TGF-β1 in different groups(Mean±SD.n=12)

3 免疫組化方法檢測(cè)各組大鼠PCNA和TGF-β1蛋白表達(dá)

對(duì)照組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞無PCNA陽(yáng)性染色，S-2W肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞核PCNA呈弱陽(yáng)性染色，S-12W組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞核PCNA呈強(qiáng)陽(yáng)性染色。結(jié)果顯示，PCNA陽(yáng)性細(xì)胞隨肺血管重塑加重而增多，兩者呈正相關(guān)，故可將其作為肺血管重塑進(jìn)展的指標(biāo)之一。

對(duì)照組肺動(dòng)脈無TGF-β1陽(yáng)性染色，S-2W肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞漿TGF-β1呈弱陽(yáng)性染色，S-12W組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞漿TGF-β1呈強(qiáng)陽(yáng)性染色，見圖2。

4 RT-qPCR檢測(cè)TGF-β1的mRNA表達(dá)

對(duì)照組TGF-β1的mRNA無明顯表達(dá)，煙霧暴露大鼠隨煙霧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，TGF-β1的mRNA水平均較正常組升高。其中S-12W組TGF-β1的mRNA表達(dá)高于S-2W組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05)，見圖3。

討論

香煙煙霧中含有多種氣相或者顆粒狀的化學(xué)物質(zhì)，包括尼古丁和焦油、煙堿、一氧化碳、胺類、酚類、醛類等多種氧化劑和自由基。流行病學(xué)調(diào)查表明吸煙是患有心血管疾病、慢性肺部疾病及各類癌癥的重要危險(xiǎn)因素;與健康非吸煙者比較，“健康吸煙者”肺泡壁變薄及肺泡腔擴(kuò)大，還不同程度存在血管壁增厚，管腔狹窄，內(nèi)皮細(xì)胞增生。韓素霞等［3］研究表明煙霧暴露大鼠肺小動(dòng)脈肌化程度增加，肺動(dòng)脈血管內(nèi)膜增生，管壁明顯增厚，官腔狹窄。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S-2W組大鼠肺小血管的肌化比例較正常對(duì)照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，但HE染色結(jié)果顯示并未出現(xiàn)肺氣腫等病理表現(xiàn)，說明煙霧暴露大鼠早期即存在肺血管重塑，可能亦提示煙霧可直接作用于肺血管系統(tǒng)誘導(dǎo)肺血管重塑，而并不依賴于缺氧或肺氣腫改變等因素［4-5］。研究結(jié)果亦顯示隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng)，模型組WT%和完全肌化血管比例均較對(duì)照組明顯增大。且從模型組SW-2至SW-12組出現(xiàn)大鼠氣道和血管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸加重，肺血管壁逐漸增厚，煙霧暴露SW-12組管腔狹窄，肺動(dòng)脈壁增厚最明顯，S-12W與S-2W比較，W/T和完全肌化血管比例差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，說明隨著煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng)，肺血管重塑程度逐漸加重。本研究結(jié)果還顯示，對(duì)照組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞PCNA 及α-SMA無陽(yáng)性染色，S-2W肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞核PCNA及α-SMA弱陽(yáng)性染色，S-12W組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞核PCNA及α-SMA強(qiáng)陽(yáng)性染色，表明PCNA陽(yáng)性細(xì)胞隨肺血管重塑加重而增多，兩者呈正相關(guān)。因此可認(rèn)為，煙霧暴露后的大鼠早期即可出現(xiàn)肺小血管平滑肌細(xì)胞的增殖，其肺血管平滑肌細(xì)胞增殖與肺血管重塑程度密切相關(guān)，肺血管重塑與煙霧暴露時(shí)間呈正相關(guān)趨勢(shì)。

Figure 2.The protein expression of α-SMA，PCNA and TGF-β1 in the pulmonary arteries detected by immunohistochemistry (×200).圖2 免疫組化檢測(cè)各組大鼠肺動(dòng)脈α-SMA、PCNA和TGF-β1的表達(dá)

Figure 3.The mRNA expression of TGF-β1 in the pulmonary vessels detected by RT-qPCR.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs S-2W group.圖3 RT-qPCR法檢測(cè)各組大鼠肺血管TGF-β1的mRNA表達(dá)水平

有研究表明，煙霧暴露導(dǎo)致的肺血管重塑和肺血管內(nèi)某些細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)［6］。TGF-β1是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化的重要因子，能促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞增殖及表型轉(zhuǎn)化和血管重塑。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組肺動(dòng)脈TGF-β1無陽(yáng)性染色，S-2W組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞漿TGF-β1蛋白弱陽(yáng)性染色，而S-12W組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞漿TGF-β1蛋白強(qiáng)陽(yáng)性染色，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。研究結(jié)果表明肺動(dòng)脈平滑肌TGF-β1蛋白表達(dá)隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng)而表達(dá)增加。在 S-12W組TGF-β1的mRNA表達(dá)高于S-2W組，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，進(jìn)一步說明肺動(dòng)脈血管平滑肌TGF-β1蛋白表達(dá)與煙霧暴露時(shí)間呈正相關(guān)趨勢(shì)。煙霧暴露可促進(jìn)氣道炎癥反應(yīng)，激活淋巴細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞，從而釋放多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α、基質(zhì)金屬蛋白酶，這些炎癥因子進(jìn)一步激活TGF-β1［7］，使得TGF-β1表達(dá)上調(diào)。TGF-β1可調(diào)節(jié)人體動(dòng)脈包括肺動(dòng)脈的收縮和肺血管平滑肌細(xì)胞的增生肥大，加快細(xì)胞從G0/ G1期到G2/M+S期的進(jìn)程，從而促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖［8］。

本研究中免疫組化和RT-qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組(SW-2和SW-12)煙霧暴露大鼠肺動(dòng)脈TGF-β1蛋白表達(dá)分別呈陽(yáng)性，且TGF-β1的mRNA水平和蛋白水平隨著煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加。同時(shí)，不同模型組(SW-2和SW-12)中TGF-β1的mRNA和蛋白表達(dá)水平與WT%和完全肌化血管比例呈正相關(guān)關(guān)系，并與PCNA及α-SMA呈顯著正相關(guān)。這說明煙霧暴露大鼠誘導(dǎo)的肺血管重塑與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖有關(guān)，而TGF-β1可能作為參與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一，故推測(cè)可能存在TGF-β1依賴性肺血管平滑肌細(xì)胞增殖的肺血管重塑。文獻(xiàn)報(bào)告肺動(dòng)脈按解剖學(xué)分支可分為大動(dòng)脈組(包括肺動(dòng)脈干和肺內(nèi)1級(jí)主干)，中動(dòng)脈組(肺內(nèi)主干2、3級(jí)分支)及小動(dòng)脈組(肺內(nèi)動(dòng)脈4級(jí)以上分支)，結(jié)果顯示不同分支的平滑肌細(xì)胞形態(tài)無明顯差異，但其遷移和增殖能力的改變因血管級(jí)別而有所不同［9］。本研究選用右肺動(dòng)脈觀察肺小血管重塑及TGF-β1的mRNA表達(dá)在理論上有其合理性，但仍存在一定的欠缺和不足。

綜述以上表明，長(zhǎng)期煙霧暴露可能通過上調(diào)大鼠肺血管TGF-β1蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)肺血管平滑肌細(xì)胞增殖，導(dǎo)致肺血管重塑和肺動(dòng)脈高壓的形成。但是，TGF-β1信號(hào)通路的分子機(jī)制尚未被完全闡明，因此，對(duì)于TGF-β1在肺動(dòng)脈高壓中的具體作用機(jī)制，特別是信號(hào)受體的細(xì)胞內(nèi)靶基因和特異性表達(dá)模式，還需要我們進(jìn)行更加深入地研究和探索。

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(責(zé)任編輯:陳妙玲，羅 森)

Effects of long-term cigarette smoke exposure on pulmonary vascular remodeling and TGF-β1 expression in rat pulmonary vessels

PENG Hong-xing，YANG Rong-shi，WANG Huan，ZENG Yu-lan

(Department of Respiratory Medicine，Liyuan Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430077，China.E-mail:381154131@qq.com)

AIM:To observe the effects of long-term cigarette smoke exposure on pulmonary vascular remodeling and the protein expression of transforming growth factor-β1(TGF-β1)in the rats，and to explore the mechanism.METHODS:SD rats(n=36)were randomly divided into control group，2-week smoke exposure(S-2W)group and 12-week smoke exposure(S-12W)groups.HE staining and α-smooth muscle actin staining were performed to observe the pulmonary vascular remodeling.The protein expression of proliferating cell nuclear antigen(PCNA)and TGF-β1 in the pulmonary arteries was determined by the method of immunohistochemistry.The mRNA expression of TGF-β1 in the pulmonary arteries was evaluated by RT-qPCR.RESULTS:Compared with control group，ratio of pulmonary vessel wall thickness to vessel diameter(WT%)and percentage of muscularized vessels were significantly increased in S-2W group and S-12W group(P＜0.01).Significant increases in the protein expression of PCNA and TGF-β1 in smoke exposure groups were observed compared with control group.There was significant difference between 2 model groups(P＜0.01).Compared with control group，the mRNA expression of TGF-β1 in pulmonary artery walls obviously increased in smoke exposure groups.There was significantly difference between S-2W and S-12W groups(P＜0.05).The mRNA expression of TGF-β1 was positively correlated with pulmonary vascular muscularization，WT%and the protein expression of PCNA.CONCLUSION:Long-term cigarette smoke exposure results in pulmonary artery remodeling in rats.The possible mechanism is that cigarette smoking exposure induces the over-expression of TGF-β1 at mRNA level in pulmonary vessels and promotes the proliferation of pulmonary vascular smooth muscle cells in rats.

Cigarette smoke;Pulmonary vascular remodeling;Transforming growth factor-β1;Smooth muscle

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2016.07.029

1000-4718(2016)07-1327-05

2016-01-22

2016-04-01

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2013CFB078)

△Tel:027-86773985;E-mail:381154131@qq.com