杜 倩， 田秋霞， 付莉萍， 李劍波

(南陽市中心醫(yī)院眼科，河南南陽473000)

銀杏葉提取物對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的作用

杜 倩△， 田秋霞， 付莉萍， 李劍波

(南陽市中心醫(yī)院眼科，河南南陽473000)

目的:研究銀杏葉提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)對(duì)大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)的影響及初步機(jī)制。方法:實(shí)驗(yàn)共分為5組，以普通Wistar大鼠作為正常對(duì)照組(control組)、Goto-Kakizaki(GK)大鼠作為糖尿病視網(wǎng)膜病變模型組(DR組)，給予GK大鼠不同劑量的銀杏葉提取物，分為低劑量組(GBEL組)，中劑量組(GBE-M組)和高劑量組(GBE-H組);檢測各組大鼠的血糖與血-視網(wǎng)膜屏障損傷情況;TUNEL染色法和Western blot法分別檢測視網(wǎng)膜組織的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡情況，核子因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)、磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 (phosphorylation-extracellular regulated protein kinase，p-ERK)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶總蛋白(total extracellular regulated protein kinase，t-ERK)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和P53的蛋白水平變化。結(jié)果:銀杏葉提取物能夠降低糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠的血糖，減輕血-視網(wǎng)膜屏障的損傷，并降低視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡數(shù)，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)的Nrf2、p-ERK與Bcl-2的蛋白水平，下調(diào)P53的蛋白表達(dá)，而對(duì)t-ERK蛋白的表達(dá)水平無顯著影響。結(jié)論:在糖尿病視網(wǎng)膜病變中，銀杏葉提取物能有效地保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，可能與Nrf2/ERK通路的激活以及Bcl-2與P53蛋白表達(dá)有關(guān)。

銀杏葉提取物;糖尿病視網(wǎng)膜病變;Nrf2/ERK通路;Bcl-2;P53

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，作為一種進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)退行性病變，主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜多細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的異常，如視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡。糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制尚未明確，因此臨床的預(yù)防和治療困難。銀杏葉提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)提取于銀杏科銀杏屬銀杏的干燥葉，其主要有效成分銀杏黃酮苷和銀杏內(nèi)酯被臨床廣泛用于預(yù)防和治療心腦血管和神經(jīng)系統(tǒng)的疾病。Chung等［1］研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物中的銀杏內(nèi)酯可通過擴(kuò)張血管增加脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜的血液供應(yīng)，保護(hù)視神經(jīng)。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物是一種強(qiáng)抗氧化劑，可促進(jìn)Muller細(xì)胞的谷胱甘肽產(chǎn)生［2］。銀杏葉提取物可以減輕糖尿病視網(wǎng)膜病變中視網(wǎng)膜及玻璃體內(nèi)的纖維組織增生［3］。Moreau等［4］給大鼠口服帶放射性元素標(biāo)記的銀杏葉提取物，發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物可在視網(wǎng)膜上達(dá)到足夠的濃度并發(fā)揮其功效，提示銀杏葉提取物能夠?qū)σ暰W(wǎng)膜產(chǎn)生相關(guān)的作用。本實(shí)驗(yàn)通過觀察銀杏葉提取物對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的作用，并初步研究其作用機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Goto-Kakizaki(GK)大鼠 40只，SPF級(jí)，體重(300±20)g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)有限公司;Wistar大鼠10只，SPF級(jí)，體重(300±20)g，購自南京均可生物工程有限公司。飼養(yǎng)于室溫(22℃ ±2℃)，相對(duì)濕度(60±5)%，日照12 h，晝夜循環(huán)，自由飲水、進(jìn)食。

2 實(shí)驗(yàn)試劑

銀杏葉提取物購自中國藥品生物制品檢定所;伊凡斯蘭購自Sigma;核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)、p-ERK和t-ERK抗體購自Santa Cruz，Bcl-2、P53抗體購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 給藥處理與分組 GK大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只:模型組(DR組)，GBE-低劑量(low dose，L) 組(GBE-L組)、中劑量(medium dose，M)組(GBE-M 組)和高劑量(high dose，H)組(GBE-H組);Wistar大鼠作為正常對(duì)照組(control組)。GBE-低、中和高劑量組大鼠分別每日灌胃銀杏葉提取物100 mg/kg，150 mg/kg和200 mg/kg，每天1次，共35 d。其中DR組與control組大鼠正常飲食。

3.2 血糖監(jiān)測 給藥完成后，監(jiān)測前12 h禁食，尾尖斷尾取血，血滴于試紙上，用血糖儀檢測。

3.3 血-視網(wǎng)膜屏障損傷監(jiān)測 給藥完成后，將30 g/L伊凡斯蘭尾靜脈快速注入。2 h后，以2%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，摘取眼球，操作輕柔(避免損傷視網(wǎng)膜)，分離視網(wǎng)膜。1份用4%多聚甲醛溶液浸泡，置于4℃保存?zhèn)溆?。?份晾干后稱重，加入300 μL甲酰胺65℃孵育15 h，于4℃、38 000 r/min離心25 min。取上清液于628 nm處用分光光度計(jì)測量吸光度(A)值之差，參比波長740 nm，重復(fù)測量6次。

3.4 TUNEL染色法檢測細(xì)胞凋亡 將各組組織石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水化，PBS洗滌，含2% 蛋白激酶K的雙蒸水中室溫孵育15 min，雙蒸水洗滌2次，加入TUNEL反應(yīng)液(TdT+熒光素標(biāo)記dUTP)，并于37℃濕盒中避光孵育1 h，PBS沖洗2次，加入DAPI，20%甘油緩沖液封片。熒光顯微鏡下以552 nm激發(fā)波長、535 nm發(fā)射波長觀察綠色熒光凋亡細(xì)胞。

3.5 Western blot法檢測相關(guān)蛋白 取各組視網(wǎng)膜組織，加入裂解液，超聲波細(xì)胞粉碎儀充分裂解，提取上清液進(jìn)行蛋白定量，調(diào)整蛋白量。取適量裂解產(chǎn)物，進(jìn)行SDS-PAGE分離，完成電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂牛奶封閉1 h，加入I抗孵育過夜，TBST洗膜3次;加入相應(yīng) II抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次;進(jìn)行熒光顯色。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間差異比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組間或組內(nèi)差異比較采用Bonferroni校正t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 血糖的變化

與control組相比，DR組大鼠的血糖顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05);與DR組相比，給予銀杏提取物后，大鼠血糖隨給藥劑量的增大而逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05)，見表1。

2 視網(wǎng)膜組織中伊凡斯蘭的滲透量變化

與control組相比，DR組大鼠視網(wǎng)膜組織中伊凡斯蘭的滲透量顯著升高(P＜0.05);與DR組相比，給予低劑量銀杏提取物治療的大鼠伊凡斯蘭的滲透量有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，中劑量組和高劑量組大鼠視網(wǎng)膜組織中伊凡斯蘭的滲透量顯著下降(P＜0.05)，見表1。

表1 銀杏提取物對(duì)大鼠血糖和視網(wǎng)膜組織中伊凡斯蘭滲透量的影響Table 1.The effects of Ginkgo biloba extract(GBE)on the blood glucose and osmolality of rat retina(Mean±SD.n=10)

3 大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的變化

如圖1所示，DR組中可見大量TUNEL染色呈陽性的細(xì)胞，給予低劑量銀杏葉提取物處理后，可觀察到呈陽性的細(xì)胞少于DR組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性;給予中、高劑量銀杏葉提取物處理后，呈陽性的細(xì)胞數(shù)顯著少于DR組(P＜0.05)，并隨劑量升高而減少。

Figure 1.The effect of Ginkgo biloba extract(GBE)on the apoptosis of ganglion cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs DR.圖1 銀杏葉提取物對(duì)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的影響

4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2、p-ERK和t-ERK蛋白的表達(dá)水平變化

與control組相比，DR組的Nrf2和p-ERK蛋白水平略有增加，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性;與DR組相比，給予低劑量銀杏葉提取物處理后，Nrf2和p-ERK的蛋白水平有所增加，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，而給予中、高劑量銀杏葉提取物處理后，Nrf2 和p-ERK的蛋白水平顯著增加(P＜0.05)。各組t-ERK蛋白表達(dá)水平變化不明顯，見圖2。

5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bcl-2和P53蛋白的表達(dá)水平變化

與control組相比，DR組中Bcl-2的蛋白表達(dá)水平顯著降低，P53蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05);與DR組相比，GBE-L組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞中的Bcl-2和P53蛋白水平無顯著變化;GBE-M組與GBE-H組中的Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高，P53蛋白表達(dá)水平顯著下降(P＜0.05)，見圖3。

討論

糖尿病性視網(wǎng)膜病變是一種具有嚴(yán)重致盲性的眼底病變，主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜毛細(xì)血管基底膜的增厚和血管的通透性增加，從而導(dǎo)致血-視網(wǎng)膜屏障被破壞，其中氧自由基參與了其病變的過程。Nrf2是一種能夠調(diào)節(jié)多種抗氧化應(yīng)激蛋白基因和二相解毒酶基因的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，如過氧化氫酶、血紅素加氧酶-1與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等，進(jìn)而可以清除體內(nèi)的多種氧化性物質(zhì)和毒性物質(zhì)［5-6］，保護(hù)組織器官免受損傷。此外，研究發(fā)現(xiàn)Nrf2能夠被ERK激活而發(fā)揮作用［7］。ERK是絲裂原活化蛋白激酶家族的一個(gè)重要的亞族，通過使多種轉(zhuǎn)錄因子磷酸化來調(diào)控細(xì)胞功能［8］。研究表明ERK的磷酸化/活化在腦缺血再灌注損傷中具有重要的神經(jīng)保護(hù)作用［9］。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)甲酯化脂氧素通過激活ERK磷酸化從而抑制細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)［9-10］。那么，銀杏葉提取物是否通過Nrf2/ERK信號(hào)通路對(duì)視網(wǎng)膜發(fā)揮保護(hù)作用?本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，給予不同劑量銀杏葉提取物處理后，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡減少，此外Nrf2與磷酸化的ERK蛋白水平顯著上升，提示這一過程與Nrf2/ERK信號(hào)通路的激活有關(guān)。另一方面，糖尿病視網(wǎng)膜病變誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜抗凋亡基因bcl-2的下調(diào)與P53蛋白上調(diào)，銀杏葉提取物能夠逆轉(zhuǎn)這一變化，其中P53能夠促進(jìn)多種細(xì)胞組織發(fā)生凋亡［11］。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物能夠降低糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠的血糖，可能通過激活Nrf2/ERK信號(hào)通路，調(diào)控Bcl-2與P53蛋白的表達(dá)，從而抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡，對(duì)視網(wǎng)膜具有保護(hù)作用。Nrf2/ERK信號(hào)通路可能是銀杏葉提取物的作用靶點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)為銀杏葉提取物用于臨床上治療糖尿病視網(wǎng)膜病變提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Figure 2.The effect of Ginkgo biloba extract(GBE)on protein expression of Nrf2，p-ERK and t-ERK.Mean±SD.n=6.#P＜0.05 vs DR.圖2 銀杏葉提取物對(duì)大鼠視網(wǎng)膜中Nrf2、p-ERK和t-ERK蛋白表達(dá)水平的影響

Figure 3.The effect of Ginkgo biloba extract(GBE)on the protein expression of Bcl-2 and P53.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs DR.圖3 銀杏葉提取物對(duì)大鼠視網(wǎng)膜中Bcl-2、P53蛋白表達(dá)水平的影響

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(責(zé)任編輯:盧 萍，余小慧)

Effect of Ginkgo biloba extract on retinopathy in diabetic rats

DU Qian，TIAN Qiu-xia，F(xiàn)U Li-ping，LI Jian-bo

(Department of Ophthalmology，Nanyang Central Hospital，Nanyang 473000，China.E-mail:nyduyaping@126.com)

AIM:To investigate the effect of Ginkgo biloba extract(GBE)on diabetic retinopathy(DR)and its possible mechanism in rats.METHODS:Goto-Kakizaki(GK)rats were used as a DR model，and were treated with different doses of GBE.Normal Wistar rats were used as the control.Blood glucose and retina barrier injury were analyzed，respectively.Ganglion cell apoptosis was detected by TUNEL staining.Moreover，the protein expression of nuclear factor E2-related factor 2(Nrf2)，ERK，Bcl-2 and P53，and ERK phosphorylation were examined by Western blot.RESULTS: GBE reduced blood glucose in the DR rats，attenuated retina barrier injury，and decreased the apoptosis of ganglion cells.Furthermore，the expression of Nrf2 and Bcl-2，and phosphorylation of ERK were increased after GBE treatment，whereas P53 expression was decreased.CONCLUSION:GBE protects ganglion cells against apoptosis in DR rats，which may be through activation of Nrf2/ERK pathway and regulating Bcl-2 and P53 expression.

Ginkgo biloba extract;Diabetic retinopathy;Nrf2/ERK pathway;Bcl-2;P53

R774.1;R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.028

1000-4718(2016)07-1323-04

2016-02-02

2016-04-18

△Tel:0377-3200096;E-mail:nyduyaping@126.com