孫菊香 丁明霞 李學博 李華峰

1.山東省臨沂市人民醫(yī)院 (276000)；2.山東大學第二醫(yī)院；3.山東政法學院證據(jù)鑒識省級重點實驗室；4.山東省臨沂市婦幼保健院

IdentifilerTM系統(tǒng)在產(chǎn)前染色體非整倍體快速檢測中的應(yīng)用

孫菊香1丁明霞2李學博3*李華峰4

1.山東省臨沂市人民醫(yī)院 (276000)；2.山東大學第二醫(yī)院；3.山東政法學院證據(jù)鑒識省級重點實驗室；4.山東省臨沂市婦幼保健院

染色體異常是嚴重的先天性疾病，由于其不可治愈，給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟和精神負擔，產(chǎn)前診斷作為二級預(yù)防措施一直是降低此類疾病發(fā)生率的主要途徑[1]。短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)多態(tài)性符合孟德爾遺傳規(guī)律，具有雜合性高、多態(tài)信息量大和高靈敏度等特點，已廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學親子鑒定、個體識別及人類進化等研究中[2]。本研究利用IdentifilerTM體系對108例產(chǎn)前診斷常規(guī)樣本檢測分析，與常規(guī)細胞染色體培養(yǎng)方法比較，分析其在產(chǎn)前診斷篩查的效果。

1 資料與方法

1.1 標本來源

2013年1月～2014年12月在臨沂市人民醫(yī)院、山東大學第二醫(yī)院，臨沂市婦幼保健院接受遺傳學產(chǎn)前診斷的樣本，按照知情同意的原則取樣共108例，其中羊水88例、臍血12例、絨毛8例。受試孕婦平均年齡38.5(22～46)歲，采集羊水標本者平均孕周為21.2(16～23)周；采集臍血標本者平均孕周為29.8(25～35)周；采集絨毛標本者平均孕周為10.6(9～12)周。以上受檢孕婦具有以下產(chǎn)前診斷指征：唐氏篩查高風險52例，35歲以上高齡孕婦26例，不良孕產(chǎn)史28例，胎兒超聲診斷畸形4例，有害物質(zhì)接觸史9例，夫婦中一方染色體異常3例，其中多例具有兩種及以上產(chǎn)前診斷的指征。

1.2 標本采集

1.2.1羊水采集 在B超引導(dǎo)下，以21GPTC穿刺針經(jīng)腹行羊膜腔穿刺，在羊水暗區(qū)最深處抽取羊水20ml，棄去最初的0.2～0.5ml，置入無菌管中，取3 ml進行STR分型檢測，其余送實驗室進行細胞培養(yǎng)行常規(guī)染色體核型分析。

1.2.2 絨毛采集 在B超引導(dǎo)下行經(jīng)宮頸絨毛活檢術(shù)，挑選吸出的絨毛置無菌生理鹽水洗滌3～5次，倒置顯微鏡下去除血液、脂肪及蛻膜等組織，將絨毛剪成粥樣。大部分接種至培養(yǎng)基培養(yǎng)后進行染色體核型分析，剩余部分用于STR分型檢測。

1.2.3 臍血采集 B超觀察臍帶在羊水中的走向，確定臍帶縱切面后，以22GPTC穿刺針經(jīng)腹行臍靜脈穿刺術(shù)。抽取臍血約3ml置無菌管中，1ml用于STR分型檢測，2ml用于細胞培養(yǎng)后常規(guī)染色體核型分析。

1.3 染色體核型分析

每例樣本均行常規(guī)染色體核型分析，具體方法見參考文獻[3]。

1.4 STR分型檢測

chelex法提取樣本DNA，以IdentifilerTM試劑盒進行STR多位點復(fù)合擴增，反應(yīng)體系為10μl，其中包含Reaction Mix 4μl，Primer 2μl，ddH2O 2.8μl，Taq聚合酶0.2μl和DNA 模板1μl。擴增循環(huán)參數(shù)為：95℃ 11 min；94℃ 1 min，59℃ 1 min，72℃ 1 min，28個循環(huán)；60℃延伸60 min；4℃保存，每組均設(shè)置陰性及陽性對照。

1.5 數(shù)據(jù)分析

擴增結(jié)束后以ABI 3130XL型遺傳分析儀檢測，電泳結(jié)果用GeneMapper ID v3.2軟件分析。STR基因座的不同峰表示不同長度的等位基因，峰面積代表擴增產(chǎn)物量。通過計算該STR位點的峰數(shù)量和峰面積比率進行判斷，其中常染色體位點出現(xiàn)單峰無診斷意義，所得STR分型圖譜均與已知分型結(jié)果比對。對兩種方法的結(jié)果以SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法對不同樣本的檢測情況

IdentifilerTM試劑盒對108例不同種類樣本的STR分型檢測，6h內(nèi)均完成檢測并獲得結(jié)果，成功率為100%。常規(guī)細胞培養(yǎng)染色體核型分析過程中，12例臍血培養(yǎng)均獲成功，成功率100%；88例羊水樣本培養(yǎng)成功85例，成功率96.6%；8例絨毛均培養(yǎng)成功7例，成功率87.5%。所有樣本培養(yǎng)成功率為96.3%。

2.2 兩種方法對不同產(chǎn)前斷指征樣本的檢測情況

兩種方法均檢出8例染色體數(shù)目異常，其中包括4例21三體；2例18-三體；1例13-三體；1例47，XYY，見表1；兩種方法對染色體數(shù)目異常的檢測結(jié)果符合率達100%。檢測結(jié)果中染色體異常電泳圖譜見圖1。

表1 兩種方法對不同產(chǎn)前診斷指征樣本的檢測結(jié)果

圖A為1號21三體樣本；圖B為4號18三體樣本

圖1 部分樣本的D21S11基因座檢測結(jié)果

3 討論

產(chǎn)前診斷是預(yù)防和干預(yù)出生缺陷的重要手段，傳統(tǒng)的以染色體核型分析為主的細胞遺傳學方法一直是公認的染色體疾病診斷的“金標準”。由于羊水穿刺屬于有創(chuàng)性醫(yī)療技術(shù)，對孕婦和胎兒有一定潛在危險。為了保證羊水細胞活力提高培養(yǎng)的成功率，羊膜腔穿刺的時間一般限定在孕16～22周[4]。由于傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)核型分析需要將羊水細胞培養(yǎng)至分裂中期，然后進行染色體制備，并進行人工鏡下分析，其操作過程繁雜[5]，一旦出現(xiàn)細胞培養(yǎng)失敗的情況，孕婦可能已經(jīng)錯過了再次復(fù)查的最佳孕周，導(dǎo)致產(chǎn)前檢查及診斷的困難，給孕婦帶來沉重的心理負擔[1]。因此，建立簡便、有效的孕期染色體核型分析樣本篩查新方法，可提高常規(guī)核型分析的針對性和準確性，具有重要的臨床意義。

染色體數(shù)目異常是臨床上最主要的染色體疾病，約占出生缺陷患兒的80%～90%，其中主要系21、18、13、X與Y染色體非整倍體所致[6-7]。IdentifilerTM系統(tǒng)是美國應(yīng)用生物公司開發(fā)的用于親權(quán)鑒定的商業(yè)試劑盒，引物由5色熒光標記，可對包含13、18、21號染色體的15個STR基因座和1個性別位點進行檢測，已廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學檢案中。利用該方法，對樣本STR基因座進行分型可確定胎兒是否存在主要染色體非整倍體。由于該技術(shù)可在羊膜腔穿刺后6h內(nèi)完成檢測，大大縮短了檢驗周期，對于細胞的分裂周期沒有特殊的要求，標本來源豐富，無需細胞培養(yǎng)，因此非常適合產(chǎn)前診斷樣本的快速篩查。由于樣本羊水量可縮減至1～2ml，對羊水較少的個體更具臨床優(yōu)勢[2，7]。

本研究利用絨毛、臍血和羊水細胞進行檢測，均成功獲得了STR分型結(jié)果，且與細胞培養(yǎng)核型分析結(jié)果一致，說明該方法具有較高的準確性。對于出現(xiàn)核型數(shù)目異常的個體，如果能夠獲得父母樣本，還可以對數(shù)目異常的核型染色體來源進行分析，以便制定更好的醫(yī)療干預(yù)或預(yù)防措施。產(chǎn)前診斷檢測樣本的多樣化具有重要的臨床意義[4]，本方法對臍血和絨毛細胞檢測同時有效，使檢出率大大提高，擴大了樣本選擇的范圍，受孕周限制小，提示該技術(shù)具有較高的臨床應(yīng)用價值。

當前常用的親子鑒定試劑盒均包含有13、18、21號染色體的基因座，因此可作為傳統(tǒng)細胞遺傳學染色體核型分析的篩選及輔助檢測手段，以提高檢出率及準確性。但由于該方法只能根據(jù)某一基因座等位基因分析檢測特定的染色體數(shù)目異常，對染色體結(jié)構(gòu)平衡變異的檢測仍存在局限性。因此，不斷探索多個基因座的聯(lián)合檢測技術(shù)和試劑盒，可大大提高檢測準確性并降低診斷成本，同時兼顧結(jié)構(gòu)異常檢測技術(shù)的創(chuàng)新，是該方法努力和發(fā)展的方向。

[1] 王樹玉, 黃醒華, 賈嬋維, 等. 國產(chǎn)探針熒光原位雜交技術(shù)用于產(chǎn)前診斷未培養(yǎng)羊水細胞染色體異常的研究 [J]. 中華婦產(chǎn)科雜志, 2009,44(7):492-497.

[2] Agarwal S, Srinivasan M, Phadke S. STR markers in clinics: A rapid prenatal diagnosis by quantitative fluorescent-pcr for aneuploidies [J]. Mol Cytogenet, 2014,7(Suppl 1 Proceedings of the International Conference on Human):I58.

[3] Xu AQ, Xia M, Liu JT, et al. Validation of quantitative fluorescent-PCR for rapid prenatal diagnosis of common aneuploidies in the chinese population [J]. Genet Mol Res, 2013,12(4):6379-6388.

[4] 張靜引, 孫麗洲, 肖云山, 等. 改良熒光原位雜交技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用 [J]. 現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展, 2009,18(6):442-445.

[5] Garcia-Sagredo JM. Fifty years of cytogenetics: A parallel view of the evolution of cytogenetics and genotoxicology [J]. Biochim Biophys Acta, 2008,1779(6-7):363-375.

[6] Weise A, Liehr T. Rapid prenatal aneuploidy screening by fluorescence in situ hybridization (FISH) [J]. Methods Mol Biol, 2008,444:39-47.2008:39-48.

[7] 許涓涓, 杜娟, 鄭陳光, 等. 單管多重熒光定量PCR技術(shù)用于染色體非整倍體異常的產(chǎn)前診斷 [J]. 中華婦產(chǎn)科雜志, 2010,45(11):865-869.

[責任編輯：董 琳]

臨沂市科技發(fā)展計劃項目(NO.201413017)，山東省自然科學基金資助項目(ZR2014HQ018)

2015-08-07

2016-07-01

*通訊作者:lysjx2012@126.com