王文君　陸　森　吳士超　繆鳳琴　潘　寧　張建瓊

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南京210009)

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·免疫學(xué)技術(shù)與方法·

定量PCR檢測(cè)HLA-C等位基因表達(dá)方法的建立和初步應(yīng)用①

王文君陸森②吳士超繆鳳琴潘寧張建瓊

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南京210009)

①本文受國(guó)家自然基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81201601)資助。

②南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科肝臟外科，南京210029。

目的：建立實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)同一個(gè)體兩條不同的HLA-C等位基因的表達(dá)水平。方法：構(gòu)建HLAⅠ類等位基因外顯子2和3數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)計(jì)等位基因特異性系列引物，建立等位基因定量PCR方法；在數(shù)據(jù)庫(kù)和835例漢族人外周血標(biāo)本中對(duì)方法進(jìn)行理論和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；檢測(cè)并比較20對(duì)肝癌和癌旁組織標(biāo)本中HLA-C等位基因的表達(dá)水平。結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的20對(duì)引物能檢測(cè)23種雜合基因型中不同的HLA-C等位基因，覆蓋漢族人群中出現(xiàn)頻率大于0.96%的個(gè)體；55%(11/20)的肝癌組織中HLA-C位點(diǎn)兩條等位基因表達(dá)水平變化不一致。結(jié)論：成功建立了針對(duì)漢族人群的HLA-C等位基因表達(dá)水平的檢測(cè)方法；肝癌組織中普遍存在著兩條HLA-C等位基因表達(dá)水平變化不一致的現(xiàn)象。

定量PCR；HLA-C；等位基因特異性；肝癌

經(jīng)典HLA(Human leucocyte antigen，HLA)Ⅰ類分子在免疫學(xué)上的主要功能是通過與相應(yīng)受體結(jié)合調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞的活化，大量研究表明經(jīng)典HLAⅠ類分子表達(dá)水平異常是腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞的常見免疫逃逸方式，顯著影響著腫瘤免疫、感染免疫以及自身免疫等疾病進(jìn)程[1,2]。

經(jīng)典HLAⅠ類基因包括HLA-A、-B、-C三個(gè)基因座位，在人群中具有高度多態(tài)性，絕大多數(shù)個(gè)體的這三個(gè)位點(diǎn)為雜合子。經(jīng)典HLAⅠ類基因呈共顯性表達(dá)，即來自父母的兩種等位基因產(chǎn)物均表達(dá)于有核細(xì)胞表面。因此，除了少數(shù)純合個(gè)體外，大部分個(gè)體的HLA-A、-B、-C位點(diǎn)在細(xì)胞表面表達(dá)兩種不同的等位基因。然而，以往研究在檢測(cè)經(jīng)典HLAⅠ類分子表達(dá)水平時(shí)，通常對(duì)一個(gè)位點(diǎn)的兩種不同等位基因產(chǎn)物并不加以區(qū)分，即檢測(cè)到的是同一基因座位兩種等位基因疊加的表達(dá)水平。

現(xiàn)有研究已明確，不同等位基因編碼的HLA Ⅰ類分子在調(diào)節(jié)免疫效應(yīng)細(xì)胞功能中常常發(fā)揮不同作用。比如，某些等位基因的產(chǎn)物和NK細(xì)胞上的受體分子結(jié)合，參與調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的活化[3]；特定的等位基因產(chǎn)物結(jié)合特定抗原肽，與TCR結(jié)合，在特異性T細(xì)胞的活化中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。而且，針對(duì)白血病細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，不同等位基因編碼的HLAⅠ類分子表達(dá)水平變化確實(shí)不同[5]。因此，區(qū)分檢測(cè)同一基因座位不同等位基因的表達(dá)水平，對(duì)于理解機(jī)體在生理和病理?xiàng)l件下的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制非常必要。

由于HLAⅠ類等位基因間具有高度多態(tài)性和相似性，目前尚無(wú)足夠的抗體可以區(qū)分各等位基因所編碼的蛋白，因此蛋白水平的檢測(cè)無(wú)法覆蓋絕大多數(shù)個(gè)體。實(shí)時(shí)定量PCR方法敏感性高，且依賴引物序列特異性檢測(cè)目標(biāo)基因?，F(xiàn)有的實(shí)時(shí)定量PCR方法僅能區(qū)分HLA-A、-B、-C不同基因座位的mRNA表達(dá)水平，不能區(qū)分同一基因座位兩條等位基因的mRNA表達(dá)水平[6]。因此，需要建立新的實(shí)時(shí)定量PCR方法，用于檢測(cè)絕大多數(shù)個(gè)體的HLA等位基因mRNA表達(dá)水平。

經(jīng)典HLAⅠ類等位基因數(shù)高達(dá)9 000多個(gè)，主要集中在外顯子2和3區(qū)域，具有高度多態(tài)性和相似性，為保證僅擴(kuò)增兩條等位基因中的一條，需要設(shè)計(jì)高度特異性的系列引物對(duì)大多數(shù)個(gè)體進(jìn)行等位基因mRNA表達(dá)水平的定量分析。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功建立了HLA-A、-B等位基因mRNA表達(dá)水平的定量PCR方法，本實(shí)驗(yàn)旨在建立檢測(cè)HLA-C等位基因mRNA表達(dá)水平的定量PCR方法，為后續(xù)經(jīng)典HLAⅠ類等位基因mRNA表達(dá)水平的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1血標(biāo)本DNA實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)存835例中國(guó)漢族人群外周血標(biāo)本DNA，所有標(biāo)本HLA-C位點(diǎn)經(jīng)過PCR-SBT(聚合酶鏈反應(yīng)-測(cè)序分型方法)高分辨率分型[7-10]。

1.1.2肝癌標(biāo)本cDNA來自實(shí)驗(yàn)室收取新鮮肝癌及癌旁組織，采用PCR-SBT方法進(jìn)行HLA-C位點(diǎn)高分辨率分型[7]，隨機(jī)選取20例HLA-C位點(diǎn)雜合的組織。Trizol法提取標(biāo)本總RNA，DNA酶處理去除基因組DNA，加入Oligo(dT)，M-MLV，dNTP，RNAase抑制劑，DEPC水，總共20 μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，獲得CDNA保存于-20℃。

1.1.3主要儀器試劑和引物設(shè)計(jì)軟件Real-time qPCR儀 (ABI Stepone Plus，Applied Biosystems，美國(guó))； Beacon Designer 8.02定量PCR引物設(shè)計(jì)軟件；SYBR Green PCR Master Mix (ABI， 美國(guó)；Vazyme，中國(guó))；HiScriptTMQ RT SuperMix for qPCR(Vazyme，中國(guó))。

1.2方法

1.2.1構(gòu)建經(jīng)典HLAⅠ類等位基因位點(diǎn)特異性堿基數(shù)據(jù)庫(kù)IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫(kù)收錄了經(jīng)WHO命名委員會(huì)確認(rèn)的全部HLA 基因數(shù)據(jù)，以IMGT/HLA(Release3.19.0)數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，構(gòu)建包含HLA-A,-B,-C位點(diǎn)所有等位基因的位點(diǎn)特異性堿基數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2.2引物設(shè)計(jì)根據(jù)構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫(kù)尋找特異性位點(diǎn)，作為引物3′末端堿基，設(shè)計(jì)等位基因特異性引物(一般16～24 bp)，然后使用Beacon DesignerTM8.02定量PCR引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)出另外一條對(duì)應(yīng)引物，參照軟件的評(píng)分選擇最佳引物。

1.2.3方法建立和驗(yàn)證通過比對(duì)NCBI/Primer-Blast數(shù)據(jù)庫(kù)和HLA數(shù)據(jù)庫(kù)中的核酸序列，在理論上驗(yàn)證所設(shè)計(jì)引物的特異性。以本實(shí)驗(yàn)室HLA-C已分型的漢族人群為目標(biāo)樣本，優(yōu)化退火溫度及引物濃度，確定最適PCR反應(yīng)條件；選取適宜陰性對(duì)照從實(shí)驗(yàn)上驗(yàn)證方法特異性。目標(biāo)標(biāo)本擴(kuò)增曲線典型，溶解曲線為單峰，陰性參照未出現(xiàn)明顯擴(kuò)增曲線，則視為該引物驗(yàn)證成功。采用系列稀釋法檢測(cè)擴(kuò)增效率。

1.2.4實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系及條件本實(shí)驗(yàn)采用SYBR Green染料法進(jìn)行Real-time PCR，反應(yīng)體系20 μl，包括：2×SYBR? Green PCR Master Mix(Vazyme)10 μl，10 μmol/L上下游引物200 nmol/L，cDNA模板1 μl，加雙蒸水補(bǔ)足20 μl。PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min；95℃ 15 s，退火(各引物最適退火溫度)15 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.5肝癌及癌旁組織定量PCR內(nèi)參引物選擇在檢測(cè)肝癌及癌旁標(biāo)本時(shí)，選用TBP和HPRT-1作為內(nèi)參基因，取二者Ct值的幾何平均值作為內(nèi)參基因的Ct值，內(nèi)參引物序列如表1所示。

1.2.6肝癌及癌旁組織定量PCR結(jié)果的數(shù)據(jù)處理方法檢測(cè)肝癌及癌旁HLA-C等位基因cDNA水平時(shí)，每對(duì)等位基因特異性的引物和內(nèi)參引物定量PCR擴(kuò)增時(shí)均作3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取其平均值。采用相對(duì)定量的方法分析數(shù)據(jù)，即2-△△Ct法。其中：△△Ct=△Ct肝癌-△Ct癌旁，△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

表1　內(nèi)參基因引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度Tab.1　Sequences and product length of reference gene primers

圖1　經(jīng)典HLAⅠ等位基因位點(diǎn)特異性堿基數(shù)據(jù)庫(kù)Fig.1　Classical HLA class Ⅰ alleles database

2　結(jié)果

2.1構(gòu)建經(jīng)典HLAⅠ類等位基因位點(diǎn)特異性堿基數(shù)據(jù)庫(kù)以IMGT/HLA(Release3.19.0)數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，將經(jīng)典HLAⅠ類基因的外顯子2和3的基因序列(共546 bp)，從1到546進(jìn)行排列，每一個(gè)位點(diǎn)可能出現(xiàn)1～4個(gè)不同的堿基；列出每個(gè)位點(diǎn)上不同堿基對(duì)應(yīng)的所有等位基因以及對(duì)應(yīng)的所有等位基因亞型及數(shù)目(如圖1)，用于后續(xù)引物設(shè)計(jì)過程中查找和確定特異性的位點(diǎn)。

2.2設(shè)計(jì)等位基因特異性引物根據(jù)構(gòu)建的經(jīng)典HLAⅠ類等位基因位點(diǎn)特異性堿基數(shù)據(jù)庫(kù)，查找具有多態(tài)性的堿基位點(diǎn)，以該位點(diǎn)作為引物3′末端堿基。引物特異性堿基篩選遵循以下標(biāo)準(zhǔn)：①理論上這一位點(diǎn)堿基對(duì)應(yīng)的所有等位基因包括同一血清型的所有亞型，圖1中是外顯子2的第216位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的經(jīng)典HLAⅠ類等位基因，灰色陰影標(biāo)注區(qū)域，216位堿基是G，以該位點(diǎn)作為特異性堿基位點(diǎn)，可擴(kuò)增C*01、C*04、C*06和C*07，并不混雜其他HLA-C等位基因及HLA-A，-B等位基因(其他位點(diǎn)208位堿基為A)；②上游引物位于外顯子2區(qū)域，下游引物位于外顯子3區(qū)域，跨內(nèi)含子2從而排除基因組DNA的影響，產(chǎn)物長(zhǎng)度在80～240 bp之間；③設(shè)計(jì)的引物GC含量在30%～70%之間，無(wú)發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)，引物長(zhǎng)度保持在16～24 bp之間，且上下游引物Tm值相差不超過3℃，以保證引物擴(kuò)增效率；④設(shè)計(jì)的引物滿足通用SYBR Green染料法的要求。

表2　等位基因特異性驗(yàn)證方法舉例Tab.2　An example of how to verify allelic specificity

根據(jù)選定的特異性3′末端堿基設(shè)計(jì)一條引物，使用Beacon DesignerTM8.02定量PCR引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)出另外一條引物。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)及軟件評(píng)分選擇最佳引物。最終設(shè)計(jì)完成20對(duì)符合以上原則的HLA-C等位基因定量PCR引物。

2.3定量PCR方法的驗(yàn)證

2.3.1數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證引物特異性本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的基于HLA-A、-B、-C等位基因數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)避開三個(gè)位點(diǎn)之間的非特異擴(kuò)增，但仍需檢驗(yàn)引物與其他基因的互補(bǔ)程度。①通過NCBI/Primer-Blast數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證，檢驗(yàn)是否能擴(kuò)增出其他非HLA基因。②非經(jīng)典HLAⅠ類基因與經(jīng)典基因相似度亦非常高，通過IMGT/HLA專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)，驗(yàn)證所得引物是否能夠擴(kuò)增HLA-E、-F、-G等非經(jīng)典等位基因。20對(duì)引物均在以上兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)完成驗(yàn)證，未發(fā)現(xiàn)與以上非目的基因匹配。

2.3.2實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證驗(yàn)證方法的特異性和擴(kuò)增效率。

2.3.2.1驗(yàn)證方法的等位基因特異性在已知HLA-C等位基因的835例漢族人群標(biāo)本中按照出現(xiàn)頻率從高到低依次選取樣本，作為目標(biāo)樣本。根據(jù)等位基因序列選擇適宜引物，逐一擴(kuò)增每個(gè)目標(biāo)樣本的兩條等位基因，同時(shí)驗(yàn)證每條等位基因擴(kuò)增的特異性。表2以其中一份標(biāo)本為例(C*01:02:01G；C*08:01:01G)說明驗(yàn)證過程：序列分析顯示引物對(duì)C-07僅能擴(kuò)增C*01:02:01G，而不能擴(kuò)增C*08:01:01G，因此選取引物對(duì)C-07擴(kuò)增C*01:02:01G。陰性對(duì)照選擇一條等位基因?yàn)镃*08:01:01G，且另一條等位基因亦不能被C-07擴(kuò)增的標(biāo)本(C*07:02:01G；C*08:01:01G)。

采用C-07同時(shí)擴(kuò)增目標(biāo)標(biāo)本和陰性對(duì)照(圖2)，擴(kuò)增曲線和產(chǎn)物溶解曲線均顯示，目標(biāo)標(biāo)本得到擴(kuò)增，陰性對(duì)照未有擴(kuò)增，證明該反應(yīng)僅擴(kuò)增目標(biāo)標(biāo)本中的C*01:02:01G，而未擴(kuò)增其另一條等位基因C*08:01:01G。

采用以上流程，同樣方法擴(kuò)增目標(biāo)標(biāo)本另一等位基因C*08:01:01G，并驗(yàn)證其特異性。選取20對(duì)引物的不同組合，能夠擴(kuò)增出漢族人群中23種基因型的每條等位基因，且相應(yīng)陰性參照均無(wú)擴(kuò)增。

2.3.2.2檢測(cè)擴(kuò)增效率將目標(biāo)標(biāo)本cDNA系列稀釋，實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因并計(jì)算擴(kuò)增效率。本研究所有體系擴(kuò)增效率在90%～110%之間。

2.4引物序列及應(yīng)用范圍本實(shí)驗(yàn)最終采用20對(duì)HLA-C等位基因定量PCR引物(表3、4)，能夠特異性擴(kuò)增835例漢族人群中HLA-C基因型頻率大于0.96%個(gè)體的所有等位基因(共23種基因型)。表3列出了按照基因型頻率從高到低排列的漢族人群中23種基因型，以及擴(kuò)增每條等位基因所選取的引物對(duì)及其退火溫度。

2.5肝癌及癌旁組織中HLA-C等位基因mRNA水平檢測(cè)選取20對(duì)HLA-C位點(diǎn)為雜合子的肝癌及癌旁組織cDNA，根據(jù)其等位基因選取適宜的等位基因特異性定量PCR引物，檢測(cè)并比較HLA-C等位基因的mRNA表達(dá)水平(表5)。

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，所設(shè)計(jì)等位基因特異性定量PCR引物能特異性區(qū)分不同HLA-C等位基因。在20例肝癌組織中，與癌旁組織相比，肝癌組織中HLA-C等位基因上調(diào)表達(dá)17.50%，表達(dá)一致47.50%，下調(diào)表達(dá)35.0%；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在HLA-C位點(diǎn)雜合的個(gè)體中，55.0%個(gè)體存在著兩條等位基因表達(dá)水平變化不一致的現(xiàn)象。

圖2　目標(biāo)標(biāo)本和陰性對(duì)照的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2　Amplification of target sample and negative control Note: The amplification plot(A) and melt curve (B) of target sample and negative control.

表3　HLA-C等位基因特異性定量PCR引物可區(qū)分漢族人群基因型Tab.3　Allelic primers distinguishing two HLA-C alleles in Han population

表4　HLA-C等位基因特異性定量PCR引物序列Tab.4　Sequences of HLA-C allelic primers

表5　肝癌相比癌旁組織HLA-C等位基因mRNA表達(dá)變化Tab.5　mRNA expression level of HLA-C alleles in HCC tissue

3　討論

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的HLA-C引物能區(qū)分漢族人群常見等位基因，對(duì)于低頻等位基因或雜合子中兩條等位基因不能用以上引物區(qū)分，可以通過相似流程對(duì)個(gè)別等位基因進(jìn)行單獨(dú)引物設(shè)計(jì)(如等位基因C*06:53，C*14:03，C*15:04)。本文建立的方法能區(qū)分HLA-C等位基因mRNA水平的表達(dá)，但是其局限在于無(wú)法反映轉(zhuǎn)錄后加工過程。

以往對(duì)于白血病細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，同一白血病細(xì)胞表面的不同等位基因編碼的HLAⅠ類分子，其表達(dá)水平變化并不相同：其規(guī)律是作為NK細(xì)胞抑制性配體的某些HLA等位基因產(chǎn)物在表面表達(dá)水平正常，而其他非抑制性HLA等位基因產(chǎn)物則存在明顯下調(diào)，可能反映了白血病細(xì)胞在NK細(xì)胞和T細(xì)胞雙重免疫監(jiān)視壓力下精細(xì)的逃逸方式[5]。在肝癌中，本實(shí)驗(yàn)室以往研究發(fā)現(xiàn)，HLA及其配體基因多態(tài)性影響了肝癌的發(fā)生[7,10]，且其表面HLAⅠ類分子也存在著明顯的異常表達(dá)，但從未有研究對(duì)其等位基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。本次對(duì)20例新鮮肝癌和癌旁組織的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一例肝癌組織HLA-C位點(diǎn)的兩條等位基因表達(dá)水平變化存在明顯差異，一方面表明在肝癌中區(qū)分檢測(cè)同一基因座位不同等位基因表達(dá)水平非常必要，另一方面也為我們進(jìn)一步研究肝癌細(xì)胞精細(xì)的免疫逃逸機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)建立了針對(duì)漢族人群的HLA-C等位基因特異性定量PCR檢測(cè)方法，設(shè)計(jì)、驗(yàn)證等位基因定量PCR引物并明確引物實(shí)際應(yīng)用范圍，為經(jīng)典HLAⅠ類基因mRNA表達(dá)水平的研究建立實(shí)驗(yàn)方法和提供了技術(shù)基礎(chǔ)，在HLA表達(dá)相關(guān)的病毒免疫、腫瘤免疫、自身免疫等領(lǐng)域研究中具有應(yīng)用價(jià)值。

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[收稿2015-12-31修回2016-04-01]

(編輯倪鵬)

A novel real-time quantitative PCR method for analyzing HLA-C allele expression level

WANG Wen-Jun,LU Sen,WU Shi-Chao,MIAO Feng-Qin,PAN Ning,ZHANG Jian-Qiong.Southeast University Medical School,Nanjing 210009,China

Objective:To establish real-time qPCR method to analyze each HLA-C allele expression level of individual.Methods: Database including exon 2 & 3 sequences of HLA class Ⅰ alleles was built,HLA-C allelic specific primers were designed and the real-time quantitative PCR method for analyzing HLA-C allele expression level was built.The allelic specificity of these primers were confirmed in database and 835 normal peripheral blood samples of Han population.The mRNA level of each HLA-C allele from 20 pairs of liver tumor tissues and non-tumor tissues was analyzed by the qPCR method we built.Results: 20 pairs of allelic specific primers were designed to distinguish the two HLA-C alleles of each individual with frequency over 0.96% in 835 cases of Han population.Among 55% of the liver cancer tissues,the expression levels of the two HLA-C alleles from the same tumor tissue changes differently compared to that of the relevant non-tumor tissue.Conclusion: This study provides method for HLA-C allele expression level analysis of Han population and each HLA-C allele expression level is inconsistent of liver cancer tissue.

Real time qPCR;HLA-C;Allelic specific;Liver cancer

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.018

R392.33文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1000-484X(2016)08-1165-06

王文君(1989年-)，女，碩士，主要從事腫瘤免疫學(xué)方面研究，E-mail：wwj2832@163.com。

及指導(dǎo)教師：潘寧(1976年-)，女，博士，講師，主要從事腫瘤免疫學(xué)方面研究，E-mail：panningmicro@aliyun.com。