李衛(wèi)紅

（山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院，山西太原　030006）

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晉南蔓菁化學(xué)成分分析及蛋白質(zhì)的含量測(cè)定

李衛(wèi)紅

（山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院，山西太原030006）

晉南蔓菁為十字花科蕓薹屬植物，具有增強(qiáng)免疫等功效，在當(dāng)?shù)赜小靶∪藚ⅰ敝Q。為了對(duì)其所含化學(xué)成分及蛋白質(zhì)的含量有所了解，采用系統(tǒng)預(yù)試驗(yàn)方法，對(duì)晉南蔓菁可能含有的化學(xué)成分進(jìn)行鑒別，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蔓菁中蛋白質(zhì)的含量；通過試管反應(yīng)對(duì)蔓菁水提取液、石油醚提取液、95%乙醇提取液進(jìn)行分析；用pH值為11的氫氧化鈉溶液制備供試液，考馬斯亮藍(lán)染色法于595 nm處測(cè)定吸光度。結(jié)果表明，晉南蔓菁中含有蛋白質(zhì)、多糖、有機(jī)酸、甾體、三萜及生物堿等化學(xué)成分；測(cè)得的蛋白質(zhì)含量為1.90%。

晉南蔓菁；化學(xué)成分；蛋白質(zhì)；考馬斯亮藍(lán)法

蔓菁（Brassica rapa L.） 為十字花科蕓薹屬植物。蔓菁根入藥，性味平、辛、苦，具有開胃下氣、利濕解毒的功效。晉南蔓菁是蔓菁的一個(gè)變種，其種子可以打油，是當(dāng)?shù)刂饕挠土献魑?；根可食用，在民間應(yīng)用廣泛，已有上百年的食用歷史，其形似人參，富有營(yíng)養(yǎng)，具有滋補(bǔ)功效，在當(dāng)?shù)乇环Q為“小人參”。近年來，食源性抗癌成分的研究進(jìn)展明確表明，十字花科植物在腫瘤預(yù)防中具有突出作用。在200多項(xiàng)流行病學(xué)研究資料中有80%的結(jié)果表明，食用植物性食物特別是十字花科植物，能夠降低多種癌癥（如肺癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、甲狀腺癌、皮膚癌、胃癌、結(jié)腸癌）的患病危險(xiǎn)［1］。蔓菁含豐富的植物纖維，可增強(qiáng)胃腸活力、稀釋毒素、降低致癌因子濃度，從而發(fā)揮排毒防癌作用。藥理研究表明，蔓菁提取物具有抗缺氧［2］、提高免疫力［3］、抗輻射［4］等活性。目前，晉南蔓菁化學(xué)成分的測(cè)定未見報(bào)道，本文通過某些化合物的特征反應(yīng)來初步確定晉南蔓菁所含化學(xué)成分［5］，采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定其中蛋白質(zhì)的含量［6］，為其資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

757型UV，上海精科儀器廠產(chǎn)品；KQ-250B型超聲清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；Thermo Fisher Lynx 6000 Label2型離心機(jī)，Thermo Fisher公司產(chǎn)品。

95%乙醇、石油醚、雙縮脲試劑、茚三酮試劑、費(fèi)林試劑、α-萘酚、濃硫酸、三氯化鐵、氯化鈉、明膠、溴酚藍(lán)試劑、鹽酸、鎂粉、三氯化鋁、濃氨水、氫氧化鉀、氫氧化鈉、異羥戊酸鐵試劑、醋酸鎂、3，5-二硝基苯甲酸、苦味酸、醋酐、氯仿硅鎢酸、磷鉬酸、碘化汞鉀試劑、碘-碘化鉀試劑、考馬斯亮藍(lán)G-250（中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所8510211）、牛血清蛋白（SCIENTIFIC RESEARCH SPECIAL082013；晉南蔓菁，采自山西運(yùn)城。

1.2方法

1.2.1蔓菁化學(xué)成分預(yù)試驗(yàn)

（1）樣品制備。取一定量的蔓菁，于60℃下干燥2 h，放至室溫后粉碎，粉末過60目篩，即為試驗(yàn)用蔓菁粉末。

（2）水提取供試液的制備。稱取蔓菁粉末20 g，置于具塞磨口錐形瓶中，加去離子水200 mL，浸漬24 h，過濾后所得濾液即為冷水供試液。剩余濾渣在60℃水浴加熱1 h，過濾后所得濾液即為熱水供試液。

（3）石油醚提取供試液的制備。稱取蔓菁粉末5 g，置于具塞磨口錐形瓶中，加石油醚50 mL，室溫浸漬過夜，過濾后所得濾液即為石油醚供試液。

（4）乙醇提取供試液的制備。取蔓菁粉末50 g，置1 L圓底錐形瓶中，加入95%乙醇500 mL，置水浴上加熱回流2 h，放冷，濾液即為乙醇供試液。

（5）方法。按各化合物特征反應(yīng)方法進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2蔓菁中蛋白質(zhì)的含量測(cè)定

（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的配制。精密稱取牛血清蛋白0.010 g，用蒸餾水溶解，定容至10 mL，得1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白對(duì)照品溶液，4℃冰箱保存。

（2）考馬斯亮藍(lán)G-250溶液的配制。精密稱取0.175 g考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50 mL 95%乙醇后，加入85%的磷酸100 mL，搖勻，為儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液30 mL，加95%的乙醇15 mL，85%的磷酸30 mL，蒸餾水425 mL，搖勻，待用。

（3）供試樣品溶液的制備。精密稱取蔓菁粉末7.5 g，加10倍體積pH值11的氫氧化鈉溶液，超聲提取1 h，每隔10 min測(cè)pH值，并用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至相應(yīng)值。以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心20 min，取上清液，定容至100 mL，得堿提法供試品溶液。

（4） 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別量取0，0.02，0.04，0.05，0.06，0.08，0.10 mL的牛血清蛋白溶液于7個(gè)10 mL具塞試管中，各加水至1.0 mL，加考馬斯亮藍(lán)G-250溶液4 mL，搖勻，室溫放置5 min后，于595 nm處測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（5）樣品中蛋白質(zhì)的含量測(cè)定。取0.05 mL供試品溶液于10 mL具塞試管中，加超純水至1.0 mL，加考馬斯亮藍(lán)G-250溶液4 mL，搖勻，室溫放置5 min。以蒸餾水為空白，于595 nm處測(cè)定吸光度。

2　結(jié)果與分析

2.1晉南蔓菁化學(xué)成分預(yù)試驗(yàn)

晉南蔓菁水提取液及石油醚提取液預(yù)試驗(yàn)結(jié)果見表1，乙醇供試液預(yù)試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1　晉南蔓菁水提取液及石油醚提取液預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

由表1和表2可知，蔓菁主要含蛋白質(zhì)、多糖、有機(jī)酸、甾體、三萜及生物堿等生物活性物質(zhì)。

2.2蔓菁中蛋白質(zhì)的含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以標(biāo)準(zhǔn)溶液蛋白質(zhì)的含量（μg）為橫坐標(biāo)、吸光度A595nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=0.006 8X+0.095 1，R2=0.998 0。

2.2.2精密度試驗(yàn)

精密吸取6份牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液0.06 mL，測(cè)定吸光度。

標(biāo)準(zhǔn)蛋白精密度試驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可知，本法分析精密度良好。

2.2.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取蔓菁粉末7.5 g，每隔5 min測(cè)1次吸光度。

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表4。

由表4可知，RSD為2.10%，表明15 min內(nèi)顯色反應(yīng)較穩(wěn)定。

2.2.4重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取6份蔓菁粉末7.5 g，測(cè)定吸光度。

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表5。

由表5可知，本方法的RSD為2.57%，說明該方法的重復(fù)性良好。

表2　乙醇供試液預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

表3　標(biāo)準(zhǔn)蛋白精密度試驗(yàn)結(jié)果

表5　重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.5回收率試驗(yàn)

精密稱取蔓菁粉末3.75 g，加入標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白70 mg，按照供試樣品制備方法制備供試液。

回收率試驗(yàn)見表6。

由表6可知，樣品加樣回收率范圍在92.53%～102.95%，RSD為2.97%，準(zhǔn)確度較好。

2.3蔓菁中蛋白質(zhì)的含量測(cè)定

精密稱取3份蔓菁粉末7.5 g，用堿提法制備供試液。

表6 回收率試驗(yàn)

含量測(cè)定結(jié)果見表7。

表7 含量測(cè)定結(jié)果

由表7可知，計(jì)算得樣品中蛋白質(zhì)的含量為1.90%。

3　結(jié)論

晉南蔓菁含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在當(dāng)?shù)赜薪倌甑氖秤脷v史。采用化合物特征反應(yīng)檢測(cè)蔓菁化學(xué)成分，對(duì)晉南蔓菁的化學(xué)成分有了初步了解，在此基礎(chǔ)上，可以對(duì)晉南蔓菁進(jìn)行有針對(duì)性的分析研究。在與陜西合陽蔓菁所含的化學(xué)成分對(duì)比后［5］，二者的特征反應(yīng)有些微小區(qū)別，說明陜西合陽與山西晉南的氣候和土壤條件相似。其中，晉南蔓菁蛋白質(zhì)的特征反應(yīng)明顯，有必要對(duì)蛋白質(zhì)含量做進(jìn)一步檢測(cè)。蛋白質(zhì)的測(cè)定方法有多種，如雙縮脲法、福林酚法、凱氏定氮法等，但這些方法在測(cè)定蛋白質(zhì)的含量時(shí)均存在不同程度的缺陷。如凱氏定氮法是測(cè)定粗蛋白的經(jīng)典方法，但在測(cè)定提取液中的有效蛋白時(shí)，由于樣品中非蛋白質(zhì)含氮化合物的干擾，使得測(cè)定結(jié)果往往高于實(shí)際提取有效蛋白質(zhì)的實(shí)際含量，且樣品處理復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)。福林酚法是靈敏度較高的方法之一，但該法專一性較差，提取過程中受甘氨酸、糖類等干擾較多?？捡R斯亮藍(lán)法是一種常用的微量蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蔓菁中蛋白質(zhì)含量的靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)?？捡R斯亮藍(lán)法常常在檢測(cè)植物組織粗提液中可溶性蛋白質(zhì)含量時(shí)被采用，在20～100 μg含量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，測(cè)蔓菁蛋白質(zhì)在15 min內(nèi)較穩(wěn)定，超過15 min即出現(xiàn)數(shù)值偏差，所以染色后，15 min之內(nèi)應(yīng)完成測(cè)定。通過精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、加樣回收率等方法學(xué)考察，表明該方法簡(jiǎn)單快速、精密度高、準(zhǔn)確度及重現(xiàn)性好，是測(cè)定蔓菁中蛋白質(zhì)含量的一種有效方法，為進(jìn)一步分離測(cè)定蛋白和利用蔓菁資源提供了科學(xué)依據(jù)。

［1］單毓娟.十字花科蔬菜的癌癥預(yù)防作用 ［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)，2005，32（5）：35-37.

［2］謝玥，馬超，蔣思萍，等.西藏蕪根提取物對(duì)小鼠抗缺氧作用的初步研究 ［J］.四川動(dòng)物，2009，28（6）：853-856.

［3］馬龍，屈衛(wèi)東，鄧淑文，等.新疆蕪菁抗衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究 ［J］.新疆醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998（1）：36-39.

［4］肖春霞.蕪菁膏對(duì)脾虛濕盛型大腸癌FOLFOX4化療減毒作用的臨床觀察 ［J］.新疆醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011（6）：45-47.

［5］陳易彬.合陽蔓菁化學(xué)成分預(yù)實(shí)驗(yàn)及其藥理活性研究 ［J］.食品科技，2011，36（3）：107-108.

［6］羅群.考馬斯亮藍(lán)法快速測(cè)定菜籽粕中可溶性蛋白質(zhì)的含量 ［J］.成都大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，33（2）：128-129.◇

文章編號(hào)：1671-9646（2016）07a-0055-02

Jinnan Manjing Chemical Composition Analysis and Determination of Its Protein Content

LI Weihong
（Shanxi Insititute of Medicine and Life Science，Taiyuan，Shanxi 030006，China）

Jinnan Manjing，which is locally known as“l(fā)ittle ginseng”，belongs to the genus of Brassicaceae plant.It can enhance the immune system of the organism.In order to understand the chemical composition and the protein content of Manjing，system preliminary test and coomassie blue staining method are used in the experiment respectively.First，use the tube reaction to analyze Jinnan Manjing water extract，petroleum ether extract and 95%ethanol extract；then prepare the test solution with pH 11 NaOH solution，which is used with coomassie blue staining method to measure the absorbance value at 595 nm.The tests conclud that Jinnan Manjing contains protein，polysaccharide，organic acids，steroids，triterpenoids and alkaloids，etc.The protein contention in Jinnan Manjing is 1.90%.

Jinnan Manjing；chemical composition；protein；coomassie blue staining method

TS201

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.07.014

1671-9646（2016）07a-0048-03

2016-05-04

李衛(wèi)紅（1966— ），女，本科，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物研究與開發(fā)。